屆高三生物一輪復習《基因工程的基本工具和操作程序》輔助學案任務一：梳理基因工程的概念和理論基礎(1)原理：(2)操作對象：(3)操作水平：(4)優(yōu)點：思考1.不同生物的基因為什么能拼接？思考2.外源基因為什么能在受體細胞中表達？任務二：思考培育轉Bt基因抗蟲棉需要哪些分子工具？基本操作程序是怎樣的？分子工具：“剪”“接”“運”操作程序：第1步：第2步：第3步：第4步：【對點練習1：】（2024湖南卷，5）某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（）A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶【重點透析1：】限制酶的選擇原則（1）不破壞，如圖甲、乙中不選擇SmaⅠ，原則（2）切割后目的基因和質粒連接處有黏性末端：可用單酶切，如圖中PstⅠ；為避免，通常使用雙酶切割目的基因和質粒，如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶，這兩種酶產生的黏性末端要。原則（3）目的基因要插在之間?！緦c練習2】右圖1為質粒的限制酶酶切圖譜。bglB基因不含圖中限制酶識別序列。為使PCR擴增的bglB基因重組進該質粒，bglB基因兩端需要分別引入和限制酶的識別序列?！緦c練習3】用切割質粒，用切割目的基因【對點練習4】大本329頁1.(2023·新課標卷，6)寫出酶2和酶4切割后形成的黏性末端，連接起來的序列：該序列還能被酶2或酶4切割嗎？【對點練習5】(25年河南卷，21)（2）為構建攜帶cg（CG的編碼基因）的大腸桿菌表達載體（圖1），對cg的PCR擴增產物和質粒進行雙酶切，隨后用E.coliDNA連接酶連接。為保證連接準確性和效率，cg轉錄模板鏈的5'端最好含有______酶切位點。另有兩組同學選用了各不相同的雙酶切組合和T4DNA連接酶重復上述實驗，獲得的部分重組質粒分子大小符合預期，但均無法使用各自構建表達載體的雙酶切組合進行切割，其原因是______________________________________________________________。【重點透析2：】PCRPCR需要的條件：PCR的前提是：PCR每次循環(huán)包含的3個步驟是：引物的作用：引物結合在模板鏈的_________端。需要2種引物的原因是：若要在擴增的目的基因兩側添加限制酶識別序列，可以在引物的_________端添加。引物設計的要求是：需要引物的數(shù)量=【對點練習6】（2025.2月金太陽聯(lián)考錯題改編）為保證目的基因和載體的高效重組，一般應用雙酶切法。下列圖是目的基因GFP上的酶切位點和限制酶識別序列及切割位點:已知GFP基因轉錄得到的RNA中缺乏起始密碼子AUG,為了保證GFP基因能被限制酶識別且能正常表達，可以通過引物添加相關序列，添加的序列是5’--3’,如何添加，請你在圖中畫出來?！緦c練習7】擴增已知序列用引物：擴增兩側的未知序列用引物：【對點練習8】某科研小組從豬源大腸桿菌中擴增得到LTB和ST1兩個基因片段，利用重組PCR技術構建了LTB—ST1融合基因，制備過程如下圖所示。回答下列問題：(1)從P2，P3兩種引物的角度分析，LTB和ST1基因能夠融合的關鍵是___________________PCR1和PCR2不能在同一個反應體系中進行，原因是：(2)②過程（填“需要”或“不需要”）加入引物，原因是?！局攸c透析3：】基因表達載體的構建——核心步驟目的：使目的基因在受體細胞中，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠。啟動子的組成單位是，作用是。（2024·廣州一模節(jié)選）(1)從原核生物中獲取的質粒不適用于直接構建真核生物的表達載體，其啟動子需要進行替換才有可能在真核細胞中表達，主要原因是?！緦c練習9】（2024安徽卷）20.丁二醇廣泛應用于化妝品和食品等領域。興趣小組在已改造的大腸桿菌中引入合成丁二醇的關鍵基因X，以提高丁二醇的產量?；卮鹣铝袉栴}。擴增X基因時，PCR反應中需要使用Taq

DNA聚合酶，原因是：使用BamH

I和

SalI限制酶處理質粒和X基因，連接后轉化大腸桿菌，并涂布在無抗生素平板上（如圖）。在此基礎上，進一步篩選含目的基因菌株的實驗思路是：【對點練習10】（2025年湖南高考）①獲取基因A，構建重組質粒（該質粒的部分結構如圖所示）。重組質粒的必備元件包括目的基因、限制酶切割位點、標記基因、啟動子和

等；為確定基因A已連接到質粒中且插入方向正確，應選用圖中的一對引物

對待測質粒進行PCR擴增，預期擴增產物的片段大小為

bp?！緦c練習11】（2023年山東高考）(2)構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物?！敬蟊?31頁】2.(2024·新課標卷，35)思考同源重組比雙酶切構建重組質粒的優(yōu)點是什么？【重點透析4：】農桿菌轉化法1、原理：Ti質粒上的可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。2、目的基因應插在中，轉化過程中有2次篩選，篩選的對象分別是?！局攸c透析5：】目的基因的檢測與鑒定類型檢測內容方法分子水平檢測目的基因是否整合到受體細胞染色體DNA上目的基因是否轉錄出mRNA目的基因是否翻譯出蛋白質個體水平鑒定

【綜合訓練】油酸是一種單不飽和脂肪酸，穩(wěn)定性高，具有較高的營養(yǎng)和保健功能，富含油酸的食用油可長時間保存且在高溫條件下不易氧化變質。油酸含量是評價大豆油食用品質和穩(wěn)定性的重要指標。研究人員利用轉基因技術抑制大豆內源FAD2－1基因的表達，獲得了油酸比例顯著提高的大豆，其油酸含量高51.71%?；卮鹣铝袉栴}：(1)從大豆基因組數(shù)據(jù)庫查找到FAD2－1基因的序列后，可用

_______

的方法獲得FAD2－1基因片段，接著用PCR技術進行擴增，PCR技術的原理是

_________

。(2)對FAD2－1基因進行XbaⅠ、SacⅠ雙酶切，這兩種酶作用的化學鍵是

______

。將FAD2－1基因反向連接到pCAMBIA3300－BCSP質粒中，構建反義基因表達載體。重組表達載體轉錄產生的mRNA可抑制細胞內FAD2－1基因的表達，其原因是

_________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)重組表達載體導入大豆細胞方法是