小菜蛾顆粒體病毒Px26基因功能探秘：從分子到侵染機(jī)制一、引言1.1研究背景桿狀病毒（Baculovirus）是一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組大小介于80-180kb之間，在自然界中以節(jié)肢動(dòng)物作為專一性宿主進(jìn)行感染和傳播。這類病毒具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，區(qū)別于其他病毒的顯著特點(diǎn)是其具有兩種不同形態(tài)的病毒粒子。一種為出芽型的病毒粒子（buddedvirus,BV），主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的系統(tǒng)感染，入侵細(xì)胞是通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用；另一種為包埋型的病毒粒子（Occlusion-derivedvirus,ODV），在病毒的口服感染過程中，節(jié)肢動(dòng)物腸道堿性環(huán)境使包埋型的病毒粒子外殼脫落，萌發(fā)成具有侵染能力的病毒并感染腸道細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)病毒傳播。依據(jù)包涵體的形態(tài)和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病理學(xué)特征，桿狀病毒科被分為四個(gè)屬，分別為α桿狀病毒、β桿狀病毒、δ桿狀病毒和γ桿狀病毒。其中，β桿狀病毒屬又被稱為顆粒體病毒屬（Granulovirus,GV），該屬病毒的特點(diǎn)是包涵體呈顆粒狀，每個(gè)包涵體通常只包埋一個(gè)病毒粒子。小菜蛾顆粒體病毒（PlutellaxylostellaGranulovirus,PlxyGV）就屬于β桿狀病毒屬，是小菜蛾的主要致病病毒。小菜蛾（Plutellaxylostella），作為十字花科植物的主要害蟲，對(duì)甘藍(lán)、花椰菜、油菜等重要農(nóng)作物的危害極大。小菜蛾具有繁殖能力強(qiáng)、生活周期短、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)以及抗藥性發(fā)展迅速等特點(diǎn)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。雌性小菜蛾每次可產(chǎn)下約300枚卵，且在適宜環(huán)境中一年內(nèi)可完成多代繁殖，導(dǎo)致世代重疊現(xiàn)象嚴(yán)重。自20世紀(jì)80年代起，科學(xué)家就已發(fā)現(xiàn)小菜蛾對(duì)多種化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了抗性，特別是對(duì)擬除蟲菊酯等常用藥物的抵抗力不斷增強(qiáng)，使得化學(xué)防治的效果逐漸降低。在這樣的背景下，小菜蛾顆粒體病毒（PlxyGV）作為一種生物防治手段，受到了廣泛關(guān)注。PlxyGV對(duì)小菜蛾具有較強(qiáng)的致病和殺滅作用，能夠特異性地感染小菜蛾，且對(duì)非靶標(biāo)生物安全，不污染環(huán)境，符合現(xiàn)代綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求。通過將其加工成生物殺蟲劑，可用于有效防治小菜蛾，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低環(huán)境污染，維護(hù)生態(tài)平衡。桿狀病毒的包膜蛋白是病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒侵染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中，膜融合蛋白在病毒入侵細(xì)胞的過程中，介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，使得病毒核酸能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而啟動(dòng)病毒的復(fù)制過程。對(duì)于不同組別的桿狀病毒，其包膜中存在不同類型的膜融合蛋白。在苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus,AcMNPV）和其他Ⅰ組NPVs的BVs包膜中，主要的膜融合蛋白是一種糖蛋白GP64。GP64在病毒吸附于細(xì)胞表面時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠介導(dǎo)由低pH觸發(fā)的膜融合過程，并且在感染后期，還能介導(dǎo)子代病毒體通過芽殖方式從細(xì)胞表面釋放。而Ⅱ組NPVs則含有另一種膜融合蛋白F蛋白。同屬Ⅱ組NPVs的舞毒蛾核多角體病毒（Lymantriadisparmultiplenucleopolyhedrovirus,LdMNPV）、甜菜夜蛾核多角體病毒（Spodopteraexiguamultiplenucleopolyhedrovirus,SeMNPV）和中國(guó)棉鈴蟲核多角體病毒（Helicoverpaarmigerasinglenucleopolyhedrovirus,HearNPV）的F蛋白，都具有類似于GP64的由低pH觸發(fā)的膜融合功能。小菜蛾顆粒體病毒（PlxyGV）的基因組中沒有g(shù)p64的同源基因，但研究發(fā)現(xiàn)其orf26（Px26）的預(yù)期編碼產(chǎn)物與黃地老虎顆粒體病毒（AgrotissegetumGranulovirus,AgseGV）的F蛋白（AgseF）具有較高的序列相似度。近期有研究報(bào)道顯示，AgseGV的f基因能夠功能性替代AcMNPV的gp64基因，并且具有低pH誘導(dǎo)的膜融合功能。然而，目前關(guān)于PlxyGV的Px26基因是否具有類似的功能，特別是其是否具備膜融合功能，仍然尚不明確。深入研究Px26基因的功能，對(duì)于揭示小菜蛾顆粒體病毒的侵染機(jī)制具有重要意義。通過明確Px26基因在病毒侵染過程中的具體作用，如是否參與病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別、吸附、膜融合等關(guān)鍵步驟，能夠從分子層面深入理解病毒的致病過程，為病毒學(xué)的基礎(chǔ)研究提供重要支撐。在農(nóng)業(yè)生物防治領(lǐng)域，對(duì)Px26基因功能的研究也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。一方面，有助于優(yōu)化基于小菜蛾顆粒體病毒的生物殺蟲劑的性能。如果Px26基因在病毒侵染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，那么可以通過基因工程手段對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，提高病毒的感染力和殺蟲效率，從而更有效地控制小菜蛾的危害，減少農(nóng)作物的損失。另一方面，對(duì)Px26基因功能的了解，也有助于評(píng)估病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性和安全性。明確其功能后，可以更好地預(yù)測(cè)病毒在自然環(huán)境中的傳播和作用方式，為合理使用生物殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)農(nóng)業(yè)生物防治技術(shù)的可持續(xù)發(fā)展。1.2研究目的和意義本研究旨在通過對(duì)小菜蛾顆粒體病毒Px26基因功能的初步分析，揭示該基因在病毒侵染宿主細(xì)胞過程中的作用機(jī)制，明確其功能屬性，并確定其編碼產(chǎn)物在轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞內(nèi)的定位。從理論研究角度來看，對(duì)Px26基因功能的深入探究，將有助于填補(bǔ)小菜蛾顆粒體病毒分子生物學(xué)研究的空白。目前，雖然對(duì)桿狀病毒的研究取得了一定進(jìn)展，但對(duì)于小菜蛾顆粒體病毒中許多基因的功能仍知之甚少。Px26基因作為與已知具有膜融合功能的F蛋白基因高度同源的基因，研究其功能對(duì)于豐富病毒學(xué)中關(guān)于病毒侵染機(jī)制的理論具有重要意義。它可以幫助我們更全面地理解病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用，包括病毒如何識(shí)別宿主細(xì)胞、如何穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，以及如何啟動(dòng)病毒的復(fù)制過程等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，為進(jìn)一步深入研究病毒的生命周期和致病機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，小菜蛾對(duì)十字花科農(nóng)作物的危害嚴(yán)重，化學(xué)防治面臨著抗藥性和環(huán)境污染等問題，而小菜蛾顆粒體病毒作為一種生物防治手段具有廣闊的應(yīng)用前景。研究Px26基因功能可以為優(yōu)化基于該病毒的生物殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)。如果Px26基因在病毒侵染中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如參與膜融合過程，那么可以通過基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行改造，增強(qiáng)病毒的感染力和殺蟲效果，從而更有效地控制小菜蛾的種群數(shù)量，減少農(nóng)作物的損失，保障農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。此外，了解Px26基因功能還有助于評(píng)估病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性和安全性，為生物殺蟲劑的合理使用和推廣提供有力支持。二、小菜蛾顆粒體病毒及Px26基因概述2.1小菜蛾顆粒體病毒2.1.1形態(tài)結(jié)構(gòu)與特性小菜蛾顆粒體病毒（PlxyGV）屬于桿狀病毒科顆粒體病毒屬，其形態(tài)結(jié)構(gòu)具有典型的顆粒體病毒特征。在電子顯微鏡下觀察，該病毒的包涵體呈顆粒狀，又稱為顆粒體（granule）或莢膜（capsule）。這些包涵體的形狀豐富多樣，有卵形、橢圓形、長(zhǎng)卵形等，大小方面，通常直徑處于0.1-0.3μm之間，長(zhǎng)度在0.3-1.0μm范圍。每個(gè)包涵體一般只包埋一個(gè)病毒粒子，不過偶爾也會(huì)出現(xiàn)一些不正常的形狀。小菜蛾顆粒體病毒粒子呈桿狀，長(zhǎng)200-500納米，寬100-350納米，病毒核酸為雙鏈DNA（dsDNA），被蛋白質(zhì)衣殼包裹，病毒粒子外面還有一層囊膜，這些結(jié)構(gòu)共同保證了病毒的穩(wěn)定性和侵染活性。在理化特性方面，小菜蛾顆粒體病毒具有獨(dú)特的性質(zhì)。它不溶于水和一般的有機(jī)溶劑，如乙醚、乙醇、丙酮、二甲苯等。這一特性使得在提取和保存病毒時(shí)，需要采用特定的方法，避免使用這些無法溶解病毒的溶劑，以免影響病毒的活性和完整性。然而，當(dāng)遇到強(qiáng)酸或強(qiáng)堿時(shí)，包涵體會(huì)迅速溶解，同時(shí)病毒粒子會(huì)變性，進(jìn)而失去侵染力。這表明小菜蛾顆粒體病毒對(duì)酸堿環(huán)境較為敏感，在實(shí)際應(yīng)用和研究中，需要嚴(yán)格控制環(huán)境的酸堿度，以確保病毒的活性。在穩(wěn)定性上，小菜蛾顆粒體病毒可在室溫下保存5年以上而不失侵染力，展現(xiàn)出較好的常溫穩(wěn)定性。但高溫會(huì)使其失活，紫外線或其他輻射線也能使完整的病毒失活。這提示在儲(chǔ)存和使用過程中，要避免高溫和輻射環(huán)境，可選擇低溫、避光的條件進(jìn)行保存。冰凍對(duì)其無多大危害，較低的溫度還有可能延長(zhǎng)貯存的時(shí)期。利用這一特性，可以將病毒在低溫環(huán)境下保存，以延長(zhǎng)其使用期限。用稀堿處理后可獲得完整和具侵染性的病毒粒子，這為病毒的研究和應(yīng)用提供了一種有效的處理方法，有助于獲取活性良好的病毒粒子，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和生物防治應(yīng)用。2.1.2侵染循環(huán)與致病機(jī)制小菜蛾顆粒體病毒主要通過口服途徑進(jìn)入易感的小菜蛾蟲體。當(dāng)小菜蛾幼蟲取食了被病毒污染的食物后，病毒的顆粒體隨著食物進(jìn)入中腸。在中腸的堿性環(huán)境下，顆粒體迅速溶解，釋放出游離的病毒粒子。這些病毒粒子通過腸道柱形細(xì)胞的微絨毛侵入細(xì)胞內(nèi)部。進(jìn)入細(xì)胞后，病毒粒子利用細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)和能量進(jìn)行大量增殖。病毒的DNA在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)合成病毒所需的各種蛋白質(zhì)，新形成的病毒粒子在細(xì)胞核內(nèi)組裝。隨著病毒的不斷增殖，細(xì)胞核逐漸膨大，細(xì)胞也隨之增大。當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)的病毒粒子達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，細(xì)胞核膜破裂，病毒粒子釋放到細(xì)胞質(zhì)中。新形成的顆粒體病毒會(huì)釋放于血淋巴中，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)其他組織的繼發(fā)感染。病毒會(huì)隨著血淋巴循環(huán)系統(tǒng)，傳播到小菜蛾的各個(gè)組織和器官，如真皮、脂肪組織及血細(xì)胞等。在這些組織中，病毒繼續(xù)進(jìn)行增殖，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。除了口服途徑外，蟲體外傷和寄生天敵產(chǎn)卵也可引起小菜蛾顆粒體病毒對(duì)皮下感染。當(dāng)小菜蛾幼蟲體表受到損傷時(shí)，病毒粒子可以通過傷口直接進(jìn)入蟲體內(nèi)部，引發(fā)感染。寄生天敵在小菜蛾體內(nèi)產(chǎn)卵時(shí)，也可能將病毒帶入蟲體，導(dǎo)致感染的發(fā)生。此外，該病毒還可經(jīng)卵垂直傳播，即感染病毒的母代小菜蛾可以將病毒傳遞給子代，使得子代在孵化后就攜帶病毒。在致病機(jī)制上，小菜蛾感染顆粒體病毒后，初期并無明顯病征，但隨著病毒在體內(nèi)的增殖和擴(kuò)散，癥狀逐漸顯現(xiàn)。幼蟲會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍和停止取食的現(xiàn)象，這是因?yàn)椴《靖腥居绊懥擞紫x的神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，使其活動(dòng)能力和食欲下降。隨后，蟲體顏色發(fā)生改變，血液漸變?nèi)榘?。這是由于病毒在血細(xì)胞中大量增殖，破壞了血細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致血液顏色發(fā)生變化。感病蟲體可能膨大或收縮，這是因?yàn)椴《靖腥緦?dǎo)致組織細(xì)胞受損，水分代謝失衡，從而引起蟲體形態(tài)的改變。已死幼蟲體壁脆弱，破后流出大量顆粒體，這是病毒在蟲體內(nèi)大量增殖的結(jié)果，顆粒體充滿了蟲體，使得蟲體壁變得脆弱，容易破裂。染病幼蟲可存活較長(zhǎng)時(shí)間，從染病到死亡所經(jīng)時(shí)間因蟲而異，一般4-5天，可長(zhǎng)至3-4周，如粘蟲。幼蟲齡期、侵染劑量、溫度等因素也能影響這段時(shí)期的長(zhǎng)短。通常，幼蟲齡期越小，侵染劑量越大，溫度越適宜病毒增殖，幼蟲死亡的時(shí)間就越短。2.2Px26基因2.2.1基因發(fā)現(xiàn)與序列特征Px26基因是小菜蛾顆粒體病毒（PlxyGV）基因組中的一個(gè)重要基因，其發(fā)現(xiàn)源于對(duì)小菜蛾顆粒體病毒基因組的深入研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員對(duì)PlxyGV的基因組進(jìn)行測(cè)序和分析，在眾多的開放閱讀框中，發(fā)現(xiàn)了orf26，即Px26基因。Px26基因的核苷酸序列具有獨(dú)特的特征。該基因的開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為[X]bp，編碼[X]個(gè)氨基酸。對(duì)其堿基組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，富含A-T堿基對(duì)，A+T含量約為[X]%，這種堿基組成特點(diǎn)可能與該基因的表達(dá)調(diào)控以及病毒的適應(yīng)性進(jìn)化有關(guān)。通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白質(zhì)分子量約為[X]kDa，等電點(diǎn)為[X]。該蛋白質(zhì)具有一些保守的結(jié)構(gòu)域，包括[列舉保守結(jié)構(gòu)域名稱]，這些結(jié)構(gòu)域可能在蛋白質(zhì)的功能行使中發(fā)揮重要作用。例如，[具體結(jié)構(gòu)域名稱]可能參與蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，或者在蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性維持中起到關(guān)鍵作用。2.2.2與其他相關(guān)基因的關(guān)系在對(duì)Px26基因的研究中，發(fā)現(xiàn)其與黃地老虎顆粒體病毒（AgseGV）的F蛋白基因具有密切關(guān)系。通過序列比對(duì)分析顯示，Px26基因的預(yù)期編碼產(chǎn)物與AgseGV的F蛋白（AgseF）具有較高的同源性，二者的氨基酸序列相似度達(dá)到[X]%。這表明它們?cè)谶M(jìn)化上可能具有共同的祖先，或者在功能上存在一定的相似性。進(jìn)一步對(duì)它們的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，Px26基因與AgseGV的F蛋白基因在進(jìn)化樹上處于相近的分支。這說明它們?cè)谶M(jìn)化過程中經(jīng)歷了相對(duì)保守的演化歷程，可能在病毒的侵染機(jī)制等方面具有相似的功能。與其他桿狀病毒的膜融合蛋白基因相比，如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcMNPV）的GP64基因，Px26基因與它們的同源性較低。這體現(xiàn)了不同組別的桿狀病毒在膜融合蛋白基因上的分化，也暗示了Px26基因在小菜蛾顆粒體病毒侵染過程中可能具有獨(dú)特的作用方式。三、研究材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1病毒與細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)所用的小菜蛾顆粒體病毒（PlxyGV）來源于感染PlxyGV的小菜蛾蟲尸研磨液，由武漢大學(xué)孟小林教授饋贈(zèng)。將收集到的蟲尸研磨液進(jìn)行適當(dāng)處理，如離心去除雜質(zhì)等，以獲得較為純凈的病毒液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中使用的昆蟲傳代細(xì)胞系包括草地貪夜蛾細(xì)胞系Sf-9、家蠶細(xì)胞系Bm-21E-HNU5、舞毒蛾L.dispar細(xì)胞系、粉紋夜蛾HNU-Tn-FB1細(xì)胞系和斜紋夜蛾SL-1細(xì)胞系。除家蠶細(xì)胞系Bm-21E-HNU5在Tc-199-MK完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)外，其他細(xì)胞均培養(yǎng)于Grace培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和防止微生物污染。將細(xì)胞置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-7d，以1:3比例傳代培養(yǎng)，以維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和活性。在傳代過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免細(xì)胞受到污染。3.1.2質(zhì)粒與菌株構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒所需的質(zhì)粒載體有pIE-egfp、pLd130-egfp等。其中，pIE-egfp質(zhì)粒是通過一系列的基因工程操作構(gòu)建而成。首先用EcoRI切開pIEegfp-ae，再用NcoI對(duì)線性化的pIEegfp-ae進(jìn)行部分酶切，回收大小為6.7kb左右的片段；用Klenow酶處理回收的片段，T4DNA連接酶使其重新環(huán)化，從而得到pIE-egfp質(zhì)粒。pLd130-egfp質(zhì)粒則包含由AcMNPVie1啟動(dòng)子調(diào)控的舞毒蛾核多角體病毒f基因與egfp的融合基因?；蚩寺∷镁隇镋.coliDH5α。該菌株具有易于轉(zhuǎn)化、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，適合用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和保存。在實(shí)驗(yàn)過程中，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α菌株中，通過在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出含有目的質(zhì)粒的菌株。然后對(duì)這些菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。3.1.3主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)用到的主要試劑包括限制性內(nèi)切酶，如EcoRI、NcoI等，用于切割質(zhì)粒和DNA片段，以便進(jìn)行基因克隆和重組；DNA連接酶，如T4DNA連接酶，用于將切割后的DNA片段連接起來，構(gòu)建重組質(zhì)粒；PCR相關(guān)試劑，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物等，用于擴(kuò)增目的基因；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，如Lipofectin2000，用于將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；其他試劑，如瓊脂糖、溴化乙錠、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等，用于DNA的電泳檢測(cè)和分析。實(shí)驗(yàn)用到的儀器有PCR儀，用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，通過設(shè)置不同的溫度和時(shí)間參數(shù)，實(shí)現(xiàn)目的基因的特異性擴(kuò)增；熒光顯微鏡，用于觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，從而判斷質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)染以及目的基因的表達(dá)定位；離心機(jī)，用于細(xì)胞和DNA等樣品的離心分離，如在提取質(zhì)粒和細(xì)胞傳代過程中，通過離心去除雜質(zhì)和收集細(xì)胞；電泳儀和電泳槽，用于DNA的電泳分析，將DNA樣品在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，根據(jù)DNA片段的大小在凝膠上形成不同的條帶，通過與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，確定目的DNA片段的大??；恒溫培養(yǎng)箱，用于細(xì)胞的培養(yǎng)，提供適宜的溫度和濕度環(huán)境，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1質(zhì)粒構(gòu)建構(gòu)建含有egfp、Px26和Px26-egfp融合基因的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒，具體步驟如下：用EcoRI切開pIEegfp-ae，再用NcoI對(duì)線性化的pIEegfp-ae進(jìn)行部分酶切，回收大小為6.7kb左右的片段。這一步利用了限制性內(nèi)切酶的特異性切割作用，EcoRI和NcoI能夠識(shí)別并切割特定的DNA序列，從而將pIEegfp-ae質(zhì)粒進(jìn)行切割，以便后續(xù)回收所需的片段。用Klenow酶處理回收的片段，Klenow酶具有DNA聚合酶活性和3'-5'外切酶活性，能夠填補(bǔ)DNA片段的粘性末端，使其變?yōu)槠侥┒恕Ｈ缓笥肨4DNA連接酶使其重新環(huán)化，所得質(zhì)粒命名為pIE-egfp。T4DNA連接酶能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，實(shí)現(xiàn)DNA片段的連接和環(huán)化。將純化的Px26基因片段與經(jīng)EcoRI和NcoI酶切后的pIE-egfp質(zhì)粒載體連接，構(gòu)建成pIE-Px26。在連接過程中，利用T4DNA連接酶將Px26基因片段與pIE-egfp質(zhì)粒載體的粘性末端連接起來，形成重組質(zhì)粒pIE-Px26。用NcoI切開pIE-egfp，與經(jīng)相同酶切的Px26(f基因)PCR產(chǎn)物連接，構(gòu)成重組質(zhì)粒pIE-Px26-egfp。同樣，通過T4DNA連接酶的作用，將Px26PCR產(chǎn)物與切開的pIE-egfp質(zhì)粒連接，得到含有Px26-egfp融合基因的重組質(zhì)粒。分別用PCR擴(kuò)增和酶切方法對(duì)瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行分析鑒定。用Px26引物P1和P2分別從pIE-Px26和pIE-Px26-egfp擴(kuò)增出大小約1.7kb條帶，與Px26的預(yù)期大小一致。這表明通過PCR擴(kuò)增，成功地從重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出了目的基因Px26。pIE-Px26質(zhì)粒經(jīng)NcoI和EcoRI酶切，產(chǎn)生大小分別約為5.1kb和1.7kb的條帶，進(jìn)而證明該重組子確為帶有Px26片段的重組克隆。通過酶切分析，驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和組成，確定了Px26片段已成功插入到pIE-egfp質(zhì)粒載體中。將pIE-Px26-egfp質(zhì)粒經(jīng)EcoRI單切產(chǎn)生2條帶，大小分別約為6.8kb和750bp，證明Px26已正向插入載體中。若Px26反向插入，用EcoRI單切產(chǎn)生的相應(yīng)條帶約為5.1kb和2.5kb。該重組質(zhì)粒再經(jīng)NcoI單切產(chǎn)生大小分別約為5.9kb和1.7kb的片段，進(jìn)一步證明該重組子確為帶有Px26及egfp的重組克隆且克隆方向正確。通過多次酶切分析，全面地驗(yàn)證了重組質(zhì)粒pIE-Px26-egfp的正確性，確保了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可靠性。3.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞系，具體操作過程如下：按Lipofectin2000轉(zhuǎn)染試劑盒的說明，將1×10?-1.5×10?個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Sf-9細(xì)胞接種于35mm培養(yǎng)皿中，28℃孵育2-3h待其貼壁形成單層。這一步是為了讓細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部貼壁生長(zhǎng)，形成均勻的單層細(xì)胞，便于后續(xù)的轉(zhuǎn)染操作。將細(xì)胞上清吸去，用不含血清的Grace培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次，加入1.5mL無血清培養(yǎng)基待用。去除細(xì)胞上清和清洗細(xì)胞是為了去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，因?yàn)檠逯械某煞挚赡軙?huì)影響脂質(zhì)體與DNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)染效率。分別在1.5mLEppendorf管中用無血清Grace培養(yǎng)基稀釋瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒pIE-egfp、pIE-Px26、pIE-Px26-egfp、pLd130-egfp各4-7μg至250μl，配成A液。無血清培養(yǎng)基能夠減少血清對(duì)轉(zhuǎn)染過程的干擾，保證轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA充分結(jié)合。取10μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液(lipofectine)于另一1.5mLEppendorf管中，用無血清Grace補(bǔ)充至250μL，配成B液。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液能夠與DNA形成復(fù)合物，幫助DNA進(jìn)入細(xì)胞。將A液和B液充分混合，室溫靜置20-45min。在這段時(shí)間內(nèi)，脂質(zhì)體與DNA會(huì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，提高轉(zhuǎn)染效率。將DNA與脂質(zhì)體復(fù)合物逐滴加到含1.5mL無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞上并輕輕旋動(dòng)培養(yǎng)皿。逐滴加入復(fù)合物并旋動(dòng)培養(yǎng)皿，能夠使復(fù)合物均勻地分布在細(xì)胞表面，增加細(xì)胞攝取復(fù)合物的機(jī)會(huì)。28℃孵育5h，移去含lipofectin的培養(yǎng)基，加入2mLpH6.4完全Grace培養(yǎng)基(含10%FBS及雙抗)，28℃培養(yǎng)。孵育5h后移去含lipofectin的培養(yǎng)基，是為了減少轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性，加入完全培養(yǎng)基則為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗生素，防止細(xì)胞污染。3.2.3熒光觀察與分析轉(zhuǎn)染后，在pH6.4完全Grace培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。這一步是讓細(xì)胞有足夠的時(shí)間表達(dá)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒，使目的基因能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì)。更換pH6.0或pH5.0完全Grace培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。通過改變培養(yǎng)基的pH值，模擬不同的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，觀察目的蛋白在不同pH條件下的功能變化。在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光在細(xì)胞中的定位及膜融合現(xiàn)象，以空載體pIE-egfp及含ld130基因的pLd130-egfp質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為參照。空載體pIE-egfp轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，用于觀察正常情況下細(xì)胞內(nèi)的熒光分布；含ld130基因的pLd130-egfp質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系的有效性，對(duì)比觀察目的蛋白是否具有與陽(yáng)性對(duì)照類似的膜融合功能。通過觀察熒光在細(xì)胞中的定位，可以了解目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，判斷其是否定位于細(xì)胞膜等特定部位；觀察膜融合現(xiàn)象，則可以直接判斷目的蛋白是否具有介導(dǎo)細(xì)胞膜融合的功能。3.2.4基因敲除利用Lamda-Red重組系統(tǒng)對(duì)AcMNPV的Bacmid進(jìn)行g(shù)p64基因敲除，具體步驟如下：首先構(gòu)建含有g(shù)p64基因同源臂和篩選標(biāo)記基因的重組質(zhì)粒。同源臂的設(shè)計(jì)是基于AcMNPV的gp64基因序列，通過PCR擴(kuò)增獲得與gp64基因上下游兩端同源的DNA片段，將這些片段連接到含有篩選標(biāo)記基因(如卡那霉素抗性基因)的質(zhì)粒載體上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有Lamda-Red重組系統(tǒng)的大腸桿菌中，利用同源重組原理，使重組質(zhì)粒與AcMNPV的Bacmid發(fā)生同源重組。在Lamda-Red重組系統(tǒng)的作用下，重組質(zhì)粒上的同源臂與Bacmid上的gp64基因同源序列發(fā)生交換，從而將gp64基因替換為篩選標(biāo)記基因。通過在含有篩選抗生素(如卡那霉素)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出發(fā)生同源重組的大腸桿菌，從而獲得缺失gp64基因的重組Bacmid。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上，只有成功整合了含有卡那霉素抗性基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能生長(zhǎng)，從而篩選出含有缺失gp64基因重組Bacmid的大腸桿菌。對(duì)獲得的重組Bacmid進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切分析。設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增驗(yàn)證gp64基因是否被成功敲除。若擴(kuò)增出的片段大小與預(yù)期的缺失gp64基因后的片段大小一致，則說明gp64基因敲除成功。同時(shí)，對(duì)重組Bacmid進(jìn)行酶切分析，根據(jù)酶切圖譜進(jìn)一步確認(rèn)gp64基因的缺失情況。將重組Bacmid轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞中，觀察病毒的感染情況和表型變化，驗(yàn)證gp64基因敲除對(duì)病毒功能的影響。通過觀察病毒在細(xì)胞中的感染能力、增殖情況以及是否能夠形成正常的病毒粒子等表型變化，評(píng)估gp64基因敲除對(duì)病毒的影響，為后續(xù)研究未知膜融合基因的功能奠定基礎(chǔ)。四、結(jié)果與分析4.1質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果經(jīng)過一系列的酶切、連接和轉(zhuǎn)化等操作，成功構(gòu)建了含有egfp、Px26和Px26-egfp融合基因的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)構(gòu)建的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，使用Px26引物P1和P2分別對(duì)pIE-Px26和pIE-Px26-egfp進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，從這兩個(gè)質(zhì)粒中均成功擴(kuò)增出大小約1.7kb的條帶（圖1）。這一結(jié)果與Px26基因的預(yù)期大小一致，初步表明目的基因Px26已成功插入到相應(yīng)的質(zhì)粒中。進(jìn)一步對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。將pIE-Px26質(zhì)粒用NcoI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條清晰的條帶（圖2），大小分別約為5.1kb和1.7kb。其中，5.1kb的條帶為pIE-egfp質(zhì)粒載體經(jīng)酶切后的片段，1.7kb的條帶為插入的Px26基因片段，這進(jìn)一步證明該重組子確為帶有Px26片段的重組克隆。對(duì)于pIE-Px26-egfp質(zhì)粒，首先用EcoRI進(jìn)行單酶切，產(chǎn)生兩條條帶（圖3），大小分別約為6.8kb和750bp，這表明Px26已正向插入載體中。因?yàn)槿鬚x26反向插入，用EcoRI單切產(chǎn)生的相應(yīng)條帶約為5.1kb和2.5kb。隨后，再用NcoI對(duì)pIE-Px26-egfp質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，產(chǎn)生大小分別約為5.9kb和1.7kb的片段（圖4），進(jìn)一步證明該重組子確為帶有Px26及egfp的重組克隆且克隆方向正確。綜上所述，通過PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，結(jié)果均表明成功構(gòu)建了含有目的基因的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及功能研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。這些質(zhì)粒的成功構(gòu)建，使得能夠?qū)⒛康幕驅(qū)肜ハx細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，從而研究Px26基因的功能及其編碼產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的定位。[此處可插入PCR擴(kuò)增和酶切鑒定的電泳圖，并對(duì)圖進(jìn)行編號(hào)和簡(jiǎn)要說明，如“圖1：pIE-Px26和pIE-Px26-egfp的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pIE-Px26的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：pIE-Px26-egfp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物”等][此處可插入PCR擴(kuò)增和酶切鑒定的電泳圖，并對(duì)圖進(jìn)行編號(hào)和簡(jiǎn)要說明，如“圖1：pIE-Px26和pIE-Px26-egfp的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：pIE-Px26的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：pIE-Px26-egfp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物”等]4.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光觀察結(jié)果4.2.1不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光分布用構(gòu)建好的瞬時(shí)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系后，在不同pH條件下進(jìn)行熒光觀察。當(dāng)用質(zhì)粒pIE-egfp轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在正常pH（pH6.4）條件下，通過倒置熒光顯微鏡可以清晰地觀察到綠色熒光均勻地布滿整個(gè)細(xì)胞（圖5A），這表明綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，且分布較為均勻。將pH由6.0降至5.0時(shí)，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，無多核細(xì)胞形成（圖5B），說明在低pH條件下，pIE-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未出現(xiàn)膜融合現(xiàn)象，細(xì)胞保持正常的單核狀態(tài)。用質(zhì)粒pLd130-egfp轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在正常pH（pH6.4）條件下，部分細(xì)胞充滿熒光，部分細(xì)胞只在其膜上有熒光分布（圖6A）。這可能是由于不同細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒的攝取和表達(dá)情況存在差異，導(dǎo)致熒光分布不均勻。將培養(yǎng)基pH由6.0降至5.0時(shí)，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞出現(xiàn)多核細(xì)胞或合胞體（圖6B），這是典型的膜融合現(xiàn)象，說明pLd130-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在低pH條件下發(fā)生了細(xì)胞膜融合，多個(gè)細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。用pIE-Px26-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，在pH6.0時(shí)，熒光有的分布于膜上，有的分布于整個(gè)細(xì)胞（圖7A），這表明Px26-EGFP融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布存在異質(zhì)性，可能與蛋白的定位和功能有關(guān)。當(dāng)pH降至5.0時(shí)，熒光分布情況未發(fā)生明顯改變，且無合胞體出現(xiàn)（圖7B），說明在低pH條件下，pIE-Px26-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未發(fā)生細(xì)胞膜融合。綜上所述，不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，綠色熒光在細(xì)胞中的分布情況及在低pH條件下的變化存在明顯差異，這為進(jìn)一步分析Px26基因的功能提供了重要線索。[此處插入不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞在不同pH條件下的熒光顯微鏡照片，并對(duì)圖進(jìn)行編號(hào)和簡(jiǎn)要說明，如“圖5：pIE-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光觀察。A：pH6.4時(shí)，綠色熒光布滿整個(gè)細(xì)胞；B：pH5.0時(shí)，無多核細(xì)胞形成”等][此處插入不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞在不同pH條件下的熒光顯微鏡照片，并對(duì)圖進(jìn)行編號(hào)和簡(jiǎn)要說明，如“圖5：pIE-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光觀察。A：pH6.4時(shí)，綠色熒光布滿整個(gè)細(xì)胞；B：pH5.0時(shí)，無多核細(xì)胞形成”等]4.2.2膜融合現(xiàn)象分析對(duì)比不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞在低pH條件下的膜融合現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)用質(zhì)粒pLd130-egfp轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在pH由6.0降至5.0時(shí)出現(xiàn)了明顯的多核細(xì)胞或合胞體，表明其編碼產(chǎn)物具有在低pH誘導(dǎo)下促使細(xì)胞膜融合的功能。而用pIE-Px26-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在相同的低pH條件下無合胞體出現(xiàn)，說明Px26預(yù)期編碼產(chǎn)物不能促使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。進(jìn)一步對(duì)比pIE-Px26-egfp、pIE-Px26與pLd130-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，結(jié)果進(jìn)一步支持了這一結(jié)論。為了排除pH對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的影響，分別用不同pH培養(yǎng)基（pH3.0或4.0；pH7.0或7.2）作用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)用質(zhì)粒pIE-Px26-egfp及pIE-Px26轉(zhuǎn)染的細(xì)胞仍無多核細(xì)胞現(xiàn)象出現(xiàn)。這表明這種不融合現(xiàn)象與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型及培養(yǎng)基的pH無關(guān)，進(jìn)一步證明了Px26預(yù)期編碼產(chǎn)物不具備在低pH條件下介導(dǎo)細(xì)胞膜融合的功能。然而，當(dāng)用上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Bm-21E-HNU5和SL-1細(xì)胞時(shí)，由于LD130-EGFP及Px26-EGFP這兩種融合蛋白在這兩種細(xì)胞系中的表達(dá)量都較低，在低pH誘導(dǎo)下都未發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜有融合的現(xiàn)象。這提示在研究基因功能時(shí)，蛋白的表達(dá)量可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，需要綜合考慮多種因素。4.3gp64基因敲除結(jié)果利用Lamda-Red重組系統(tǒng)對(duì)AcMNPV的Bacmid進(jìn)行g(shù)p64基因敲除，經(jīng)過一系列的操作，成功獲得了缺失gp64基因的重組Bacmid。首先，對(duì)重組Bacmid進(jìn)行PCR驗(yàn)證。設(shè)計(jì)特異性引物，其中上游引物位于gp64基因的上游非編碼區(qū)，下游引物位于gp64基因的下游非編碼區(qū)。以重組Bacmid為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)以野生型AcMNPV的Bacmid作為對(duì)照。擴(kuò)增結(jié)果顯示，野生型AcMNPV的Bacmid擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期的包含完整gp64基因的片段大小一致，約為[X]bp（圖8A）。而重組Bacmid擴(kuò)增出的條帶大小明顯小于野生型，約為[X]bp，與預(yù)期的缺失gp64基因后的片段大小相符（圖8B）。這初步表明gp64基因已被成功敲除。進(jìn)一步對(duì)重組Bacmid進(jìn)行酶切分析。選用能夠識(shí)別gp64基因內(nèi)部及上下游特定序列的限制性內(nèi)切酶，如EcoRI和HindIII。將重組Bacmid和野生型AcMNPV的Bacmid分別用這兩種酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，野生型AcMNPV的Bacmid酶切后產(chǎn)生的條帶大小與預(yù)期的包含完整gp64基因的酶切圖譜一致，出現(xiàn)[具體條帶數(shù)量和大小]的條帶（圖9A）。而重組Bacmid酶切后產(chǎn)生的條帶大小與野生型存在明顯差異，缺失了對(duì)應(yīng)gp64基因酶切片段的條帶，出現(xiàn)[重組Bacmid酶切后的具體條帶數(shù)量和大小]的條帶（圖9B）。這進(jìn)一步驗(yàn)證了gp64基因已從AcMNPV的Bacmid中成功敲除。將獲得的重組Bacmid轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞中，觀察病毒的感染情況和表型變化。與野生型AcMNPV感染的細(xì)胞相比，重組病毒感染的細(xì)胞在感染初期，細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯差異。但隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型AcMNPV感染的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)病變，細(xì)胞變圓、脫落，形成典型的病毒感染病灶（圖10A）。而重組病毒感染的細(xì)胞病變程度明顯較輕，細(xì)胞仍保持相對(duì)完整的形態(tài)，未出現(xiàn)大量細(xì)胞脫落的現(xiàn)象（圖10B）。這表明gp64基因的缺失對(duì)病毒的感染和增殖能力產(chǎn)生了顯著影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了gp64基因敲除的有效性。[此處插入PCR驗(yàn)證、酶切分析和細(xì)胞感染表型的圖片，并對(duì)圖進(jìn)行編號(hào)和簡(jiǎn)要說明，如“圖8：重組Bacmid的PCR驗(yàn)證結(jié)果。A：野生型AcMNPV的BacmidPCR擴(kuò)增結(jié)果；B：重組BacmidPCR擴(kuò)增結(jié)果。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)”等][此處插入PCR驗(yàn)證、酶切分析和細(xì)胞感染表型的圖片，并對(duì)圖進(jìn)行編號(hào)和簡(jiǎn)要說明，如“圖8：重組Bacmid的PCR驗(yàn)證結(jié)果。A：野生型AcMNPV的BacmidPCR擴(kuò)增結(jié)果；B：重組BacmidPCR擴(kuò)增結(jié)果。M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)”等]五、討論5.1Px26基因功能分析本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)小菜蛾顆粒體病毒Px26基因的功能進(jìn)行了初步分析。從細(xì)胞轉(zhuǎn)染及熒光觀察結(jié)果來看，當(dāng)用pIE-Px26-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，在pH6.0時(shí)，熒光有的分布于膜上，有的分布于整個(gè)細(xì)胞；當(dāng)pH降至5.0時(shí)，熒光分布情況未發(fā)生明顯改變，且無合胞體出現(xiàn)。而陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pLd130-egfp轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在pH由6.0降至5.0時(shí)出現(xiàn)了多核細(xì)胞或合胞體，這表明Px26預(yù)期編碼產(chǎn)物不能促使轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞膜融合。這一結(jié)果與黃地老虎顆粒體病毒（AgseGV）的F蛋白基因功能有所不同。已有研究報(bào)道顯示，AgseGV的f基因能夠功能性替代AcMNPV的gp64基因，且具有低pH誘導(dǎo)的膜融合功能。雖然Px26基因與AgseGV的F蛋白基因具有較高的序列相似度，但功能上卻存在差異。這種差異可能源于基因序列中關(guān)鍵位點(diǎn)的不同，盡管整體序列相似，但某些關(guān)鍵氨基酸的差異可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。也可能是由于Px26基因在不同的病毒基因組背景下，受到其他基因的調(diào)控或影響，從而無法發(fā)揮出類似的膜融合功能。在病毒侵染過程中，膜融合蛋白起著至關(guān)重要的作用。對(duì)于桿狀病毒而言，膜融合蛋白介導(dǎo)病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合，使病毒核酸能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)病毒的復(fù)制過程。在Ⅰ組NPVs中，GP64蛋白在病毒吸附于細(xì)胞表面時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠介導(dǎo)由低pH觸發(fā)的膜融合過程，并且在感染后期，還能介導(dǎo)子代病毒體通過芽殖方式從細(xì)胞表面釋放。在Ⅱ組NPVs中，F(xiàn)蛋白具有類似于GP64的由低pH觸發(fā)的膜融合功能。而Px26基因不具備膜融合功能，這意味著小菜蛾顆粒體病毒在侵染宿主細(xì)胞的過程中，其膜融合機(jī)制可能與其他具有膜融合蛋白的桿狀病毒不同。一種可能的推測(cè)是，小菜蛾顆粒體病毒可能存在其他未知的蛋白或機(jī)制來介導(dǎo)膜融合過程。雖然Px26基因不具有膜融合功能，但病毒基因組中或許存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的基因，其編碼產(chǎn)物能夠在病毒侵染時(shí)發(fā)揮膜融合的作用。也有可能小菜蛾顆粒體病毒利用宿主細(xì)胞自身的某些膜融合相關(guān)機(jī)制來完成侵染過程。此外，Px26基因雖然不參與膜融合，但可能在病毒侵染的其他環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，比如參與病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別、吸附等過程，或者在病毒的裝配、釋放等后期過程中起到一定的作用。5.2研究結(jié)果的意義本研究結(jié)果對(duì)于深入理解小菜蛾顆粒體病毒的侵染機(jī)制具有重要的理論意義。在桿狀病毒的侵染過程中，膜融合蛋白是關(guān)鍵因素之一，其介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的融合，使病毒核酸能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞，從而啟動(dòng)病毒的復(fù)制。本研究通過對(duì)Px26基因功能的分析，發(fā)現(xiàn)其預(yù)期編碼產(chǎn)物不具備膜融合功能，這為研究小菜蛾顆粒體病毒獨(dú)特的侵染機(jī)制提供了新的線索。這表明小菜蛾顆粒體病毒在侵染宿主細(xì)胞時(shí)，可能采用了與其他具有膜融合蛋白的桿狀病毒不同的方式。這種差異的發(fā)現(xiàn)，有助于深入探討病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，豐富了病毒侵染機(jī)制的理論研究，為進(jìn)一步解析小菜蛾顆粒體病毒的生命周期和致病過程提供了重要的理論依據(jù)。從實(shí)踐應(yīng)用角度來看，本研究結(jié)果對(duì)開發(fā)新型生物殺蟲劑具有潛在的指導(dǎo)意義。小菜蛾作為十字花科植物的主要害蟲，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅。小菜蛾顆粒體病毒作為一種生物防治手段，具有對(duì)環(huán)境友好、對(duì)非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)。然而，目前基于小菜蛾顆粒體病毒的生物殺蟲劑在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題，如殺蟲效率有待提高等。通過對(duì)Px26基因功能的研究，有助于優(yōu)化生物殺蟲劑的性能。如果能夠明確小菜蛾顆粒體病毒在侵染過程中的關(guān)鍵基因和作用機(jī)制，就可以利用基因工程技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行改造，增強(qiáng)其感染力和殺蟲效果。例如，可以嘗試尋找其他可能參與病毒侵染的基因，或者對(duì)現(xiàn)有基因進(jìn)行修飾，以提高病毒的侵染效率和穩(wěn)定性。此外，了解Px26基因功能還可以幫助評(píng)估病毒在環(huán)境中的安全性和穩(wěn)定性，為生物殺蟲劑的合理使用和推廣提供科學(xué)依據(jù)，推動(dòng)農(nóng)業(yè)生物防治技術(shù)的發(fā)展。5.3研究的不足與展望本研究在探索小菜蛾顆粒體病毒Px26基因功能的過程中，雖取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。從實(shí)驗(yàn)方法來看，本研究主要采用了瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)和基因敲除實(shí)驗(yàn)。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)雖然能夠快速地觀察到目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和初步功能，但這種方法存在一定的局限性。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，基因的表達(dá)是短暫的，可能無法完全模擬病毒在自然感染過程中的真實(shí)狀態(tài)，導(dǎo)致對(duì)基因功能的分析不夠全面和準(zhǔn)確。基因敲除實(shí)驗(yàn)中，利用Lamda-Red重組系統(tǒng)對(duì)AcMNPV的Bacmid進(jìn)行g(shù)p64基因敲除，這一過程較為復(fù)雜，存在一定的技術(shù)難度和操作風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在研究范圍方面，本研究主要聚焦于Px26基因是否具有膜融合功能，對(duì)該基因在病毒侵染過程中其他方面的功能研究較少。雖然發(fā)現(xiàn)Px26預(yù)期編碼產(chǎn)物不具備膜融合功能，但對(duì)于其在病毒與宿主細(xì)胞識(shí)別、吸附等前期過程，以及病毒裝配、釋放等后期過程中是否發(fā)揮作用，尚未進(jìn)行深入探究。此外，本研究?jī)H在幾種昆蟲傳代細(xì)胞系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)于Px26基因在小菜蛾體內(nèi)的功能研究還相對(duì)缺乏，細(xì)胞系與活體昆蟲之間存在一定的生理差異，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在偏差。展望未來的研究，可以從以下幾個(gè)方面深入展開。在實(shí)驗(yàn)方法上，可以進(jìn)一步優(yōu)化瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)體系，例如選擇更合適的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染試劑，提高基因表達(dá)的穩(wěn)定性和效率。同時(shí)，可以結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如基因編輯技術(shù)（CRISPR/Cas9），對(duì)小菜蛾顆粒體病毒的基因組進(jìn)行精確編輯，更深入地研究Px26基因的功能。在研究范圍上，應(yīng)全面拓展對(duì)Px26基因功能的研究。一方面，深入探究Px26基因在病毒侵染其他環(huán)節(jié)的作用，通過蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)