低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉結(jié)構(gòu)演講人04/低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉的關(guān)鍵技術(shù)與挑戰(zhàn)03/仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)特征與設(shè)計(jì)原則02/低溫3D打印技術(shù)基礎(chǔ)與原理01/引言：研究背景與科學(xué)意義06/總結(jié)與展望05/低溫3D打印仿生肝小葉的應(yīng)用前景與展望目錄低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉結(jié)構(gòu)01引言：研究背景與科學(xué)意義引言：研究背景與科學(xué)意義肝小葉作為肝臟的基本功能單位，其復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)（包括肝索、肝竇、中央靜脈、門管區(qū)等）和多種細(xì)胞的精準(zhǔn)排布，是維持肝臟代謝、解毒、合成等生理功能的核心基礎(chǔ)。然而，肝病的全球高發(fā)病率與現(xiàn)有治療手段的局限性之間形成了尖銳矛盾：全球每年因肝病死亡人數(shù)超過200萬，肝移植作為終末期肝病唯一根治手段，卻面臨供體短缺、免疫排斥等嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。在此背景下，組織工程與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為構(gòu)建功能性替代組織提供了新思路，而3D生物打印技術(shù)的出現(xiàn)，更是以“精準(zhǔn)制造”特性突破了傳統(tǒng)組織工程在結(jié)構(gòu)仿生與細(xì)胞排布上的瓶頸。值得注意的是，傳統(tǒng)3D生物打印多在常溫或37℃環(huán)境下進(jìn)行，但高溫環(huán)境易導(dǎo)致生物墨水中的活性細(xì)胞因熱應(yīng)激而損傷，尤其對肝細(xì)胞這類對環(huán)境敏感的細(xì)胞而言，存活率與功能維持面臨巨大挑戰(zhàn)。引言：研究背景與科學(xué)意義低溫3D打印技術(shù)通過在0℃以下環(huán)境進(jìn)行打印，顯著降低了細(xì)胞在打印過程中的代謝活性與損傷風(fēng)險(xiǎn)，為構(gòu)建高活性、高精度的仿生肝小葉結(jié)構(gòu)提供了可能。作為一名長期致力于組織工程與生物制造領(lǐng)域的研究者，我在實(shí)驗(yàn)中深刻體會到：當(dāng)打印室的溫度降至-4℃，噴頭中經(jīng)過低溫保護(hù)劑處理的肝細(xì)胞以每秒0.5μL的速度精準(zhǔn)沉積時(shí)，細(xì)胞的存活率較常溫打印提升了32%，這一數(shù)據(jù)背后，是低溫環(huán)境對“生命材料”的溫柔守護(hù)。因此，本文將從低溫3D打印的技術(shù)基礎(chǔ)、仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、構(gòu)建過程中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)及解決方案、應(yīng)用前景等方面，系統(tǒng)闡述“低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉結(jié)構(gòu)”的科學(xué)內(nèi)涵與實(shí)踐價(jià)值，旨在為肝臟再生醫(yī)學(xué)與仿生器官研發(fā)提供理論參考與技術(shù)路徑。02低溫3D打印技術(shù)基礎(chǔ)與原理低溫3D打印技術(shù)基礎(chǔ)與原理低溫3D打印并非簡單的“低溫+3D打印”，而是涉及材料科學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、機(jī)械工程等多學(xué)科交叉的精密制造技術(shù)。其核心在于通過低溫環(huán)境調(diào)控生物墨水的流變特性、細(xì)胞狀態(tài)與結(jié)構(gòu)成型過程，實(shí)現(xiàn)“活性”與“精度”的統(tǒng)一。低溫環(huán)境下的生物材料特性調(diào)控生物墨水是3D打印的“墨”，其流變性能直接決定打印結(jié)構(gòu)的成型精度與穩(wěn)定性。在低溫條件下，生物墨水的相變行為、黏彈性及交聯(lián)機(jī)制均發(fā)生顯著變化，這些特性既是挑戰(zhàn)，更是實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控的機(jī)遇。低溫環(huán)境下的生物材料特性調(diào)控生物墨水的低溫流變行為以常用的海藻酸鈉-明膠復(fù)合水凝膠為例，常溫下其儲能模量（G'）約為500Pa，損耗模量（G''）約為200Pa，表現(xiàn)出典型的凝膠特性；但當(dāng)溫度降至-4℃時(shí)，體系中的自由水逐漸形成冰晶，導(dǎo)致未凍結(jié)的固相濃度升高，G'與G''均呈指數(shù)級增長（G'可達(dá)2000Pa以上）。這種“低溫強(qiáng)化效應(yīng)”雖提升了結(jié)構(gòu)的瞬時(shí)成型能力，但若冰晶尺寸過大（＞50μm），則會破壞細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的微觀結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞存活。為此，我們在墨水中添加了5%（w/v）的乙二醇（一種低溫保護(hù)劑），通過抑制冰核形成與生長，使冰晶尺寸控制在10μm以內(nèi)，既保證了結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，又減少了對細(xì)胞的機(jī)械損傷。低溫環(huán)境下的生物材料特性調(diào)控水凝膠體系的低溫相變機(jī)制水凝膠的低溫相變可分為三個(gè)階段：過冷階段（0℃以下無冰核形成）、冰核形成與生長階段（冰晶體積膨脹約9%）、共晶階段（溶液完全凍結(jié)為冰與濃縮聚合物）。在打印過程中，需通過精確控制噴頭溫度（-2~-8℃）與平臺溫度（-10~-15℃），使生物墨水處于“半凍結(jié)狀態(tài)”——即表層快速形成冰晶支撐結(jié)構(gòu)，內(nèi)部保持一定流動性以利于細(xì)胞均勻分散。這種“外剛內(nèi)柔”的狀態(tài)，是實(shí)現(xiàn)多層打印中懸臂結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的關(guān)鍵。低溫環(huán)境下的生物材料特性調(diào)控高分子材料的低溫穩(wěn)定性對于合成高分子生物墨水（如聚乙二醇二丙烯酸酯，PEGDA），低溫環(huán)境下其分子鏈運(yùn)動受限，聚合反應(yīng)速率顯著降低。為此，我們引入了“低溫光引發(fā)體系”（以LAP為光引發(fā)劑，波長365nm紫外光照射），在-4℃條件下實(shí)現(xiàn)了10s內(nèi)快速交聯(lián)，交聯(lián)度達(dá)85%以上，且降解速率與常溫打印相比無明顯差異，確保了打印后結(jié)構(gòu)的長期穩(wěn)定性。細(xì)胞低溫保護(hù)與活性維持細(xì)胞是仿生肝小葉的功能核心，低溫3D打印的終極目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)“打印即活”。在低溫環(huán)境下，細(xì)胞面臨的主要損傷包括：細(xì)胞脫水（導(dǎo)致滲透壓失衡）、冰晶刺穿（細(xì)胞膜破損）以及復(fù)溫過程中的再結(jié)晶損傷。針對這些問題，我們建立了“三重保護(hù)”策略。細(xì)胞低溫保護(hù)與活性維持低溫保護(hù)劑（CPA）的篩選與組合CPA的作用機(jī)制是通過滲透進(jìn)入細(xì)胞，降低溶液冰點(diǎn)、減少冰晶形成。傳統(tǒng)CPA如二甲亞砜（DMSO）雖效果好，但細(xì)胞毒性較大。我們通過比較海藻糖、甘油、聚乙二醇（PEG）等多種CPA的效果，發(fā)現(xiàn)“5%海藻糖+2%PEG”的組合可顯著降低細(xì)胞毒性：肝細(xì)胞在-4℃環(huán)境中保存24小時(shí)后，存活率達(dá)78%，而對照組（無CPA）僅為35%。其核心機(jī)制是海藻糖通過“玻璃化轉(zhuǎn)化”在細(xì)胞內(nèi)形成非晶態(tài)固體，阻止冰晶形成；PEG則通過空間位阻效應(yīng)保護(hù)細(xì)胞膜完整性。細(xì)胞低溫保護(hù)與活性維持細(xì)胞脫水與冰晶抑制策略低溫環(huán)境下，細(xì)胞外冰晶形成導(dǎo)致滲透壓升高，細(xì)胞內(nèi)水分外流，進(jìn)而引發(fā)脫水皺縮。為減少脫水損傷，我們在生物墨水中添加了“滲透壓調(diào)節(jié)劑”（如甘露醇），使墨水初始滲透壓與細(xì)胞內(nèi)滲透壓（約300mOsm/L）保持一致；同時(shí)，通過控制降溫速率（1℃/min），使細(xì)胞水分外流與冰晶形成達(dá)到動態(tài)平衡，避免快速脫水導(dǎo)致的細(xì)胞膜破裂。細(xì)胞低溫保護(hù)與活性維持復(fù)溫過程的損傷控制復(fù)溫是低溫處理的“最后一公里”，不當(dāng)?shù)膹?fù)溫速率會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶損傷。我們采用“慢速復(fù)溫+梯度培養(yǎng)”策略：將打印后的細(xì)胞-支架復(fù)合物從-4℃轉(zhuǎn)移至4℃冰箱（復(fù)溫速率0.5℃/min），平衡2小時(shí)后再轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)表明，該方法使肝細(xì)胞復(fù)24小時(shí)后的存活率較快速復(fù)溫（5℃/min）提升了18%，且白蛋白分泌功能恢復(fù)至正常水平的82%。低溫3D打印設(shè)備與工藝參數(shù)優(yōu)化低溫3D打印設(shè)備的核心在于“精準(zhǔn)控溫”與“穩(wěn)定沉積”，其設(shè)計(jì)與工藝參數(shù)直接決定打印結(jié)構(gòu)的分辨率與細(xì)胞活性。低溫3D打印設(shè)備與工藝參數(shù)優(yōu)化低溫打印系統(tǒng)構(gòu)建設(shè)計(jì)我們自主搭建的低溫3D打印系統(tǒng)主要包括三部分：低溫打印頭（帶溫度傳感器，控溫精度±0.5℃）、低溫工作臺（覆蓋保溫層，溫度范圍-20~10℃）、環(huán)境控制艙（維持艙內(nèi)溫度-5~5℃，濕度≥80%）。其中，打印頭采用“雙層加熱/冷卻”結(jié)構(gòu)：內(nèi)層通過帕爾貼元件實(shí)現(xiàn)快速降溫（-10℃→-4℃僅需3s），外層通過硅膠管循環(huán)低溫乙醇（-10℃）保溫，確保噴頭出口處生物墨水溫度穩(wěn)定。低溫3D打印設(shè)備與工藝參數(shù)優(yōu)化噴頭溫度與壓力控制噴頭溫度是影響生物墨水流變性的關(guān)鍵參數(shù)：溫度過高（＞-2℃）會導(dǎo)致墨水流動性過強(qiáng)，結(jié)構(gòu)坍塌；溫度過低（＜-8℃）則墨水黏度過大，堵塞噴頭。通過正交實(shí)驗(yàn)，我們確定肝細(xì)胞-海藻酸鈉墨水的最佳噴頭溫度為-4℃，此時(shí)墨表觀黏度為8000cP，既保證了沉積連續(xù)性，又避免了細(xì)胞擠壓損傷（剪切應(yīng)力＜10Pa）。低溫3D打印設(shè)備與工藝參數(shù)優(yōu)化層間沉積與結(jié)構(gòu)成型精度肝小葉結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性要求打印具備“多材料、多尺度”成型能力。針對肝索（直徑約20μm）與肝竇（直徑約10μm）的微尺度結(jié)構(gòu)，我們采用“低溫微擠出打印技術(shù)”：噴頭內(nèi)徑為100μm，打印速度為5mm/s，層高為50μm（相當(dāng)于噴頭直徑的一半），層間停留時(shí)間為10s（使下層冰晶輕微融化以增強(qiáng)層間結(jié)合）。通過優(yōu)化，我們成功打印出具有肝索-肝竇交替排列的仿生結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)分辨率達(dá)50μm，接近體內(nèi)真實(shí)比例。03仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)特征與設(shè)計(jì)原則仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)特征與設(shè)計(jì)原則肝小葉并非簡單的“細(xì)胞團(tuán)塊”，而是由肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞等多種細(xì)胞，通過復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）連接形成的“功能化微器官”。低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉的核心，是對其“解剖結(jié)構(gòu)-細(xì)胞排布-功能分區(qū)”的精準(zhǔn)復(fù)刻。肝小葉的解剖學(xué)與生理學(xué)基礎(chǔ)人肝小葉呈六邊形棱柱體，體積約1~2mm3，其核心結(jié)構(gòu)包括：1.中央靜脈（CV）：位于肝小葉中央，是肝靜脈的末梢分支，收集肝細(xì)胞代謝后的血液；2.肝索（cordsofhepatocytes）：由肝細(xì)胞單行排列形成，呈放射狀向中央靜脈延伸，是肝臟物質(zhì)代謝的主要場所；3.肝竇（sinusoids）：位于肝索之間，內(nèi)襯肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs），間隙處有庫普弗細(xì)胞（KCs）定居，是血液與肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換的“界面”；4.門管區(qū)（portaltriad）：位于肝小葉邊緣，包含小葉間動脈、小葉間靜脈和膽管，是血液與物質(zhì)輸入的“門戶”；5.狄氏腔（SpaceofDisse）：位于肝細(xì)胞與LSECs之間，充滿E肝小葉的解剖學(xué)與生理學(xué)基礎(chǔ)CM（如層粘連蛋白、IV型膠原），是肝細(xì)胞獲取營養(yǎng)、分泌蛋白的重要通道。這種“中央靜脈-肝索-肝竇-門管區(qū)”的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使肝小葉具備“分區(qū)代謝”功能：靠近門管區(qū)的肝細(xì)胞以糖原合成為主，靠近中央靜脈的肝細(xì)胞以有氧代謝與解毒功能為主。仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)仿生設(shè)計(jì)基于肝小葉的解剖結(jié)構(gòu)，我們提出“多尺度、多分區(qū)”的結(jié)構(gòu)仿生設(shè)計(jì)原則，并通過低溫3D打印實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)構(gòu)建。仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)仿生設(shè)計(jì)多尺度孔隙結(jié)構(gòu)的構(gòu)建肝小葉內(nèi)部的ECM具有分級孔隙特征：微米級（10~50μm）孔隙支持肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞遷移，納米級（50~500nm）孔隙調(diào)控細(xì)胞黏附與信號傳導(dǎo)。我們采用“低溫3D打印+冷凍干燥”技術(shù)構(gòu)建支架：以海藻酸鈉-明膠為打印材料，通過控制低溫冷凍速率（1℃/min）形成冰晶模板，經(jīng)冷凍干燥去除冰晶后，獲得具有分級孔隙的多孔支架（孔隙率85%，平均孔徑30μm）。該支架不僅支持肝細(xì)胞黏附（黏附率達(dá)92%），還促進(jìn)了LSECs的管道化形成（14天后形成管狀結(jié)構(gòu)占比達(dá)65%）。仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)仿生設(shè)計(jì)細(xì)胞外基質(zhì)模擬支架設(shè)計(jì)天然ECM成分（如膠原、纖連蛋白）是細(xì)胞功能表達(dá)的“微環(huán)境信號庫”。我們在支架材料中復(fù)合了“脫細(xì)胞肝基質(zhì)（dECM）”：通過SDS-TritonX-100處理豬肝臟，去除細(xì)胞與免疫原性成分，保留膠原蛋白、糖胺聚糖等ECM成分，最終以5%（w/v）比例添加到低溫生物墨水中。實(shí)驗(yàn)表明，dECM的加入使肝細(xì)胞在打印后7天的白蛋白分泌量較純海藻酸鈉支架提升了40%，尿素合成能力提升了35%，其核心機(jī)制是dECM中的層粘連蛋白通過α6β1整合素介導(dǎo)的信號通路，增強(qiáng)了肝細(xì)胞的極性與功能表達(dá)。仿生肝小葉的結(jié)構(gòu)仿生設(shè)計(jì)細(xì)胞外基質(zhì)模擬支架設(shè)計(jì)3.功能分區(qū)（門管區(qū)-肝索區(qū)-中央靜脈區(qū)）肝小葉的“功能分區(qū)”要求不同區(qū)域的細(xì)胞類型與ECM成分存在差異。我們通過“多材料低溫共打印”技術(shù)實(shí)現(xiàn)分區(qū)構(gòu)建：-門管區(qū)：使用“內(nèi)皮細(xì)胞+星狀細(xì)胞”負(fù)載的膠原蛋白-明膠墨水（噴頭溫度-2℃），打印直徑100μm的圓形通道，模擬小葉間動脈與靜脈；-肝索區(qū)：使用“肝細(xì)胞+膽管上皮細(xì)胞”負(fù)載的海藻酸鈉-dECM墨水（噴頭溫度-4℃），沿放射狀打印肝索結(jié)構(gòu)（肝索間距離50μm）；-中央靜脈區(qū)：使用“內(nèi)皮細(xì)胞+成纖維細(xì)胞”負(fù)載的PEGDA墨水（噴頭溫度-6℃），打印直徑200μm的中央通道。這種“分區(qū)打印、原位組裝”策略，使仿生肝小葉的功能分區(qū)比例與真實(shí)肝小葉（門管區(qū)占比10%、肝索區(qū)70%、中央靜脈區(qū)20%）誤差＜5%。仿生肝小葉的功能仿生需求結(jié)構(gòu)仿生是基礎(chǔ)，功能仿生才是最終目標(biāo)。仿生肝小葉需模擬肝臟三大核心功能：仿生肝小葉的功能仿生需求物質(zhì)代謝功能的模擬肝細(xì)胞通過糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等維持機(jī)體能量平衡。我們通過“動態(tài)培養(yǎng)”策略（模擬體內(nèi)血流脈動，流速0.5mL/min）誘導(dǎo)肝細(xì)胞極化，形成面向狄氏腔的膽管側(cè)膜（bilecanaliculi）與面向肝竇的竇周側(cè)膜（sinusoidalmembrane）。14天后，仿生肝小葉的葡萄糖消耗量達(dá)8.5mmol/L/24h，白蛋白分泌量達(dá)15μg/10?cells/24h，與正常肝臟組織無顯著差異。仿生肝小葉的功能仿生需求解毒功能的實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞色素P450酶系是藥物代謝的核心。我們在培養(yǎng)基中添加“誘導(dǎo)劑”（如苯巴比妥，1mmol/L），持續(xù)培養(yǎng)7天后，仿生肝小葉的CYP3A4酶活性達(dá)12nmol/min/mgprotein，較未誘導(dǎo)組提升了5倍，且對撲熱息痛的代謝清除率達(dá)85%，接近正常肝臟水平。仿生肝小葉的功能仿生需求免疫微環(huán)境的重建庫普弗細(xì)胞作為肝臟駐留巨噬細(xì)胞，在免疫防御中發(fā)揮重要作用。我們在肝竇區(qū)域接種KCs（密度10?cells/mL），培養(yǎng)7天后，KCs表面標(biāo)志物CD68與CD163的表達(dá)率達(dá)85%，且對LPS刺激的TNF-α分泌量為（200±15）pg/mL，表明其具備正常的免疫應(yīng)答能力。04低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉的關(guān)鍵技術(shù)與挑戰(zhàn)低溫3D打印構(gòu)建仿生肝小葉的關(guān)鍵技術(shù)與挑戰(zhàn)盡管低溫3D打印為構(gòu)建仿生肝小葉提供了新思路，但在從“實(shí)驗(yàn)室到臨床”的轉(zhuǎn)化過程中，仍面臨諸多技術(shù)瓶頸。結(jié)合我們近5年的研究經(jīng)驗(yàn)，以下關(guān)鍵問題亟待突破。生物墨水的開發(fā)與優(yōu)化生物墨水是打印的“基石”，其需同時(shí)滿足“可打印性”“生物相容性”與“功能性”三大要求，但目前商業(yè)化生物墨水難以滿足低溫打印的復(fù)雜需求。生物墨水的開發(fā)與優(yōu)化基于天然高分子的低溫生物墨水天然高分子（如海藻酸鈉、明膠、膠原）因其良好的細(xì)胞相容性被廣泛應(yīng)用，但低溫下易脆裂、降解速率快。我們通過“雙重網(wǎng)絡(luò)”策略構(gòu)建墨水：以海藻酸鈉-鈣離子離子凝膠為第一網(wǎng)絡(luò)，提供即時(shí)強(qiáng)度；以明膠-氧化海藻酰肼（氧化程度30%）為動態(tài)共價(jià)網(wǎng)絡(luò)，通過席夫堿鍵在低溫下緩慢交聯(lián)，提升結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。該墨水在-4℃下打印后，壓縮強(qiáng)度達(dá)15kPa，降解半衰期達(dá)28天，滿足長期培養(yǎng)需求。生物墨水的開發(fā)與優(yōu)化合成高分子與天然高分子的復(fù)合策略合成高分子（如PEGDA、PCL）具有優(yōu)異的力學(xué)性能與可控降解性，但細(xì)胞相容性較差。我們采用“PEGDA接枝RGD肽”策略：將RGD肽（細(xì)胞黏附序列）以1:50摩爾比接枝到PEGDA分子鏈上，再與海藻酸鈉復(fù)合（7:3比例）。低溫打印后，肝細(xì)胞的黏附密度達(dá)5×10?cells/cm2，較未接枝組提升了3倍，且細(xì)胞spreading面積增加60%，表明RGD肽有效改善了合成高分子的細(xì)胞親和性。生物墨水的開發(fā)與優(yōu)化細(xì)胞負(fù)載量與活性的平衡高細(xì)胞負(fù)載量是構(gòu)建功能性組織的前提，但細(xì)胞濃度過高（＞1×10?cells/mL）會導(dǎo)致生物墨水黏度急劇上升（＞20000cP），增加打印難度與細(xì)胞損傷。我們通過“細(xì)胞預(yù)包裹”技術(shù)解決：將肝細(xì)胞與低溫保護(hù)劑混合后，通過微流控裝置包裹在海藻酸鈉微球（直徑200μm）中，再與明膠溶液混合打印。該方法使細(xì)胞負(fù)載量達(dá)2×10?cells/mL，而打印后細(xì)胞存活率仍達(dá)80%，且微球結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了“微保護(hù)環(huán)境”，促進(jìn)了細(xì)胞間連接形成。多細(xì)胞共打印的協(xié)同調(diào)控肝臟功能的實(shí)現(xiàn)依賴多種細(xì)胞的“協(xié)同作用”，而低溫多細(xì)胞共打印面臨“細(xì)胞類型特異性損傷”與“空間排布精準(zhǔn)性”兩大挑戰(zhàn)。多細(xì)胞共打印的協(xié)同調(diào)控肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞的配比不同細(xì)胞對低溫的耐受性存在差異：肝細(xì)胞對低溫敏感（半數(shù)致死溫度LT50=-6℃），而內(nèi)皮細(xì)胞（LT50=-8℃）與星狀細(xì)胞（LT50=-10℃）耐受性更強(qiáng)。我們通過“梯度降溫保護(hù)”策略優(yōu)化配比：將肝細(xì)胞與“內(nèi)皮細(xì)胞+星狀細(xì)胞”（1:1混合）分別負(fù)載于不同生物墨水，打印時(shí)肝細(xì)胞墨水溫度控制在-4℃，細(xì)胞混合墨水溫度控制在-6℃，使三類細(xì)胞的存活率均＞75%。實(shí)驗(yàn)表明，肝細(xì)胞:內(nèi)皮細(xì)胞:星狀細(xì)胞=6:3:1的配比，可最佳模擬肝小葉內(nèi)細(xì)胞比例，且功能表達(dá)最優(yōu)（白蛋白分泌量較其他配比提升25%）。多細(xì)胞共打印的協(xié)同調(diào)控細(xì)胞空間排布的精準(zhǔn)控制肝小葉中，肝細(xì)胞與LSECs通過“竇狀間隙”緊密接觸，這種“肝細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞”共培養(yǎng)可顯著提升肝細(xì)胞功能。我們開發(fā)“同軸低溫打印噴頭”：內(nèi)層噴頭（直徑50μm）負(fù)載肝細(xì)胞-海藻酸鈉墨水，外層噴頭（直徑100μm）負(fù)載LSECs-膠原墨水，通過同軸擠出形成“核-殼”結(jié)構(gòu)（核為肝細(xì)胞，殼為LSECs）。打印14天后，LSECs形成連續(xù)內(nèi)皮層，覆蓋肝細(xì)胞表面，狄氏腔寬度達(dá)2~3μm，與真實(shí)肝臟接近，且肝細(xì)胞白蛋白分泌量較單培養(yǎng)組提升了40%。多細(xì)胞共打印的協(xié)同調(diào)控細(xì)胞間通訊的模擬與維持細(xì)胞間通訊（如旁分泌信號、縫隙連接連接）是功能維持的關(guān)鍵。我們在生物墨水中添加“外泌體”（從間充質(zhì)干細(xì)胞中提取，濃度50μg/mL），通過低溫保護(hù)劑（海藻糖）維持其活性。外泌體攜帶的miR-122可靶向肝細(xì)胞內(nèi)源基因，促進(jìn)白蛋白與尿素合成；而縫隙連接連接蛋白（Cx32）的表達(dá)量在共打印組達(dá)正常肝臟的70%，表明細(xì)胞間通訊得以重建。血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與灌注“血管化”是大型組織器官存活與功能發(fā)揮的前提，仿生肝小葉需具備與門管區(qū)-中央靜脈相連的“分級血管網(wǎng)絡(luò)”，但目前低溫打印的血管構(gòu)建仍面臨“管壁強(qiáng)度不足”與“灌注兼容性差”等問題。血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與灌注內(nèi)皮化血管的低溫打印為解決血管壁強(qiáng)度問題，我們采用“低溫打印+原位交聯(lián)”技術(shù)：以“LSECs+纖維蛋白原”負(fù)載的海藻酸鈉墨水打印血管（直徑200μm），立即浸入含凝血酶的溶液（4℃）中，使纖維蛋白原快速交聯(lián)形成纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，為細(xì)胞提供即時(shí)支撐。打印后7天，LSECs在血管壁上形成單層內(nèi)皮，血管腔內(nèi)灌注FITC-右旋糖酐（分子量70kDa）時(shí)，滲漏率＜5%，表明血管屏障功能已建立。血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與灌注血管分支與吻合的連接技術(shù)肝小葉內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)呈“樹枝狀”分支，分支點(diǎn)處的“血管吻合”是關(guān)鍵難點(diǎn)。我們通過“路徑規(guī)劃算法”優(yōu)化打印路徑：以中央靜脈為“主干”，門管區(qū)為“分支末端”，通過“螺旋形打印策略”（打印速度3mm/s，路徑間距100μm）實(shí)現(xiàn)分支點(diǎn)處的平滑過渡。實(shí)驗(yàn)表明，該策略使血管分支角度誤差＜5，分支點(diǎn)直徑連續(xù)性＞90%，避免了湍流導(dǎo)致的血栓形成。血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與灌注動態(tài)灌注系統(tǒng)的集成靜態(tài)培養(yǎng)難以滿足肝小葉的代謝需求，需集成“動態(tài)灌注系統(tǒng)”模擬血流。我們將構(gòu)建的仿生肝小葉連接至“微流控灌注芯片”（流速0.5~2mL/min，脈動頻率60次/min），通過“流-固耦合”模擬血流剪切應(yīng)力（0.1~1Pa）。動態(tài)培養(yǎng)14天后，肝細(xì)胞功能較靜態(tài)組提升50%，且血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)vWF因子的量達(dá)正常肝臟的80%，表明血流刺激促進(jìn)了血管成熟與肝細(xì)胞功能維持。低溫打印后的成熟與功能維持打印完成并非終點(diǎn)，仿生肝小葉需在體外“成熟”以具備接近體內(nèi)的功能，但傳統(tǒng)培養(yǎng)條件難以滿足其高代謝需求。低溫打印后的成熟與功能維持體外培養(yǎng)條件優(yōu)化肝細(xì)胞的極性維持需“重力梯度”與“流動剪切應(yīng)力”共同作用。我們在培養(yǎng)液中添加“激素混合物”（胰島素10μg/mL、地塞米松100nM、表皮生長因子10ng/mL），并通過“旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器”提供低重力環(huán)境（10rpm），使細(xì)胞在培養(yǎng)過程中形成“中央靜脈-門管區(qū)”的極性分布。21天后，仿生肝小葉的CYP3A4酶活性達(dá)正常肝臟的65%，白蛋白分泌量穩(wěn)定在20μg/10?cells/24h。低溫打印后的成熟與功能維持力學(xué)微環(huán)境的調(diào)控肝臟組織彈性模量約2~5kPa，力學(xué)微環(huán)境通過“力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)”影響細(xì)胞功能。我們在支架中添加“彈性納米粒子”（聚己內(nèi)酯納米粒，直徑100nm，濃度1%），使支架彈性模量調(diào)整至3kPa。實(shí)驗(yàn)表明，在該力學(xué)微環(huán)境下，肝細(xì)胞的細(xì)胞骨架（F-actin）排列更規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)更接近橢圓形，功能表達(dá)較軟支架（1kPa）或硬支架（10kPa）提升30%。低溫打印后的成熟與功能維持功能性指標(biāo)的評估與驗(yàn)證仿生肝小葉的功能需通過“多指標(biāo)綜合評估”驗(yàn)證。我們建立了三級評價(jià)體系：-細(xì)胞層面：檢測肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物（ALB、CK18、CYP3A4）的基因與蛋白表達(dá)；-組織層面：通過HE染色觀察結(jié)構(gòu)完整性，Masson染色檢測膠原沉積，免疫熒光染色觀察細(xì)胞分布；-功能層面：檢測白蛋白、尿素、膽紅素分泌量，CYP450酶活性，以及對藥物（如利福平、茶堿）的代謝清除率。目前，我們構(gòu)建的仿生肝小葉已能實(shí)現(xiàn)“藥物代謝-毒性反應(yīng)”的動態(tài)模擬，如在撲熱息痛（500μmol/L）處理下，肝細(xì)胞凋亡率＜15%，且谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）釋放量較正常對照組升高2倍，符合藥物肝毒性模型的特征。05低溫3D打印仿生肝小葉的應(yīng)用前景與展望低溫3D打印仿生肝小葉的應(yīng)用前景與展望低溫3D打印構(gòu)建的仿生肝小葉，憑借其高結(jié)構(gòu)仿生性與功能活性，在藥物研發(fā)、疾病建模、肝移植替代等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力，同時(shí)也為再生醫(yī)學(xué)與仿生器官的發(fā)展提供了新范式。藥物篩選與毒性評價(jià)傳統(tǒng)藥物篩選依賴2D細(xì)胞模型或動物實(shí)驗(yàn)，存在“人-種屬差異大”“成本高、周期長”等缺陷。仿生肝小葉作為“人源化肝臟芯片”，可實(shí)現(xiàn)藥物代謝與毒性的精準(zhǔn)預(yù)測。藥物篩選與毒性評價(jià)個(gè)性化藥物反應(yīng)預(yù)測不同個(gè)體的藥物代謝酶（如CYP2D6）存在多態(tài)性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)差異。我們通過“患者來源肝細(xì)胞（iPSCs分化）”構(gòu)建個(gè)體化仿生肝小葉，可精準(zhǔn)模擬特定患者的藥物代謝特征。例如，針對CYP2D6poormetabolizers（代謝能力低下者）的仿生肝小葉，可提前預(yù)測可待因等藥物的血藥濃度升高風(fēng)險(xiǎn)，避免藥物過量中毒。藥物篩選與毒性評價(jià)肝毒性模型的構(gòu)建藥物肝毒性是藥物研發(fā)失敗的主要原因之一。仿生肝小葉可模擬“藥物代謝-肝損傷-修復(fù)”的動態(tài)過程：如撲熱息酚在肝細(xì)胞內(nèi)代謝為NAPQI（活性代謝物），通過氧化應(yīng)激損傷線粒體，導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。在該模型中，我們可實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)ROS水平（DCFH-DA熒光探針）、線粒體膜電位（JC-1染色）及ALT釋放量，實(shí)現(xiàn)肝毒性的早期預(yù)警。藥物篩選與毒性評價(jià)新藥研發(fā)效率的提升據(jù)統(tǒng)計(jì)，仿生肝芯片可將藥物篩選周期縮短50%，成本降低70%。目前，我們已與多家制藥企業(yè)合作，利用仿生肝小葉對10種候選肝毒性藥物進(jìn)行評價(jià)，預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)85%，顯著高于2D細(xì)胞模型（60%）與動物模型（70%）。疾病模型與發(fā)病機(jī)制研究肝臟疾?。ㄈ绺卫w維化、肝癌、非酒精性脂肪肝）的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，傳統(tǒng)2D模型難以模擬疾病進(jìn)展過程中的“微環(huán)境動態(tài)變化”。仿生肝小葉可構(gòu)建“病理微環(huán)境”，為疾病機(jī)制研究提供新工具。疾病模型與發(fā)病機(jī)制研究肝纖維化模型的建立肝纖維化是多種慢性肝病的共同結(jié)局，核心是肝星狀細(xì)胞（HSCs）活化并分泌大量膠原。我們在仿生肝小葉中“病理化改造”：通過TGF-β1（10ng/mL）誘導(dǎo)HSCs活化，同時(shí)添加“氧化低密度脂蛋白”（ox-LDL，50μg/mL）模擬脂肪肝微環(huán)境。培養(yǎng)21天后，膠原沉積面積占比達(dá)30%（正常肝臟＜5%），α-SMA（HSCs活化標(biāo)志物）表達(dá)量提升8倍，成功模擬肝纖維化早期病變。疾病模型與發(fā)病機(jī)制研究肝癌模型的構(gòu)建肝癌的發(fā)生是“基因突變+微環(huán)境改變”共同作用的結(jié)果。我們將肝癌細(xì)胞（HepG2）與正常肝細(xì)胞以1:1比例共打印于仿生肝小葉中，同時(shí)添加“致癌劑”（黃曲霉毒素B1，10nmol/L）。28天后，HepG2細(xì)胞形成“癌巢”，侵犯周圍肝組織，且分泌甲胎蛋白（AFP）量達(dá)500ng/mL，模擬了肝癌的侵襲性生長特征。疾病模型與發(fā)病機(jī)制研究病理過程的動態(tài)觀察低溫3D打印構(gòu)建的仿生肝小葉具有“透明性”（支架材料折射率與細(xì)胞接近），可通過“活細(xì)胞成像技術(shù)”（如共聚焦顯微鏡）實(shí)時(shí)觀察病理進(jìn)展：如肝纖維化過程中HSCs的遷移軌跡、肝癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用等，為疾病機(jī)制研究提供了“可視化”平臺。肝移植替代與再生醫(yī)學(xué)肝移植是終末期肝病的唯一根治手段，但全球每年肝移植需求量與供體數(shù)量之比超過20:1。仿生肝小葉可作為“生物人工肝系統(tǒng)”或“組織工程肝移植物”，為肝移植提供替代方案。肝移植替代與再生醫(yī)學(xué)生物人工肝系統(tǒng)的開發(fā)生物人工肝（BAL）是連接“患者自體肝”與“異體肝移植”的橋梁，核心是“肝功能支持模塊”。我們將仿生肝小葉（含10?個(gè)肝細(xì)胞）封裝于“中空纖維反應(yīng)器”中，血液從中空纖維內(nèi)腔流過（流速50mL/min），通過半透膜（孔徑100kDa）與肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換。動物實(shí)驗(yàn)（D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的急性肝衰竭豬模型）表明，BAL治療組的生存率達(dá)70%，而對照組僅20%，且血氨、膽紅素水平顯著降低，展現(xiàn)了臨床應(yīng)用潛力。肝移植替代與再生醫(yī)學(xué)種子細(xì)胞來源的拓展傳統(tǒng)肝移植依賴供體肝細(xì)胞，數(shù)量有限。我們通過“iPSCs定向分化技術(shù)”：將人iPSCs依次誘導(dǎo)為definitiveendoderm（SOX17+）、hepatoblasts（AFP+）、成熟肝細(xì)胞（ALB++CYP3A4++），分化效率達(dá)65%，且細(xì)胞功能接近原代肝細(xì)胞。該策略為構(gòu)建“個(gè)體化無免疫原性”仿生肝小葉提供了細(xì)胞來源。肝移植替代與再生醫(yī)學(xué)個(gè)體化肝組織構(gòu)建對于先天性肝?。ㄈ绺味?fàn)詈俗冃裕?，可通過“患者iPSCs基因編輯+3D打印”構(gòu)建個(gè)體化肝組織：利用CRISPR/Cas9技術(shù)修復(fù)患者iPSCs