ICS11.220CCSB4135DB35/T2024—2021鰻鱺皰疹病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范ProtocolofdiagnosistechnologyforHerpesvirusanguillaeinfection2022-02-23實施福建省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB35/T2024—2021前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 15主要試劑和材料 16主要儀器和設(shè)備 2 28實驗室分子診斷 29綜合判定 3附錄A（資料性）試劑配制 4附錄B（資料性）鰻鱺皰疹病毒陽性參考序列 6DB35/T2024—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學院提出。本文件由福建省海洋與漁業(yè)局歸口。本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所、福建省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所、福州海關(guān)技術(shù)中心、清流縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)中心。本文件主要起草人：饒秋華、葛均青、張志燈、羅土炎、黃文華、楊金先、劉洋、何肖云、陳強、宋鐵英、羅欽、黃薇。DB35/T2024—20211鰻鱺皰疹病毒感染診斷技術(shù)規(guī)范本文件適用于鰻鱺皰疹病毒感染的診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrithylammoniumbromide）dATP：脫氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脫氧胞苷三磷酸（Deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脫氧鳥苷三磷酸（Deoxyguanosinetriphosphate）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTP：脫氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）dTTP：脫氧胸苷三磷酸（Deoxythymidinetriphosphate）EB：溴化乙啶（Ethidiumbromide）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerasechainreaction）Taq酶：DNA聚合酶（ThermusAquaticusDNAPolymerase）TBE：三羥甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Tris-borate-EDTA）Tris：三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethylaminomethane）5主要試劑和材料5.1水：應(yīng)符合GB/T6682中一級水的規(guī)定。5.2Taq酶：2U/μL，-20℃保存。2DB35/T2024—20215.3dNTP：dCTP、dGTP、dATP、dTTP，濃度為2.5mmol/L。5.4引物：上游引物HVA-F：5,-GTGTCGGGCCTTTGTGGTGA-3,，下游引物HVA-R：5,-CATGCCGGGAGTCTTTTTGAT-3,，引物濃度為10μmol/L。5.5瓊脂糖：電泳級。6主要儀器和設(shè)備6.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度誤差±2℃。6.2高速離心機：12000g以上。6.3PCR儀。6.4水平電泳儀。6.5凝膠成像儀。6.6勻漿器。7臨床診斷7.1體表檢查觀察魚體是否出現(xiàn)下列癥狀：體表出現(xiàn)黏液脫落，鰓蓋、頜部、胸鰭和腹鰭等部位出現(xiàn)瘀血和出血，尤其頭部鰓蓋和頜部出血、淤血明顯，體表或形成明顯脫黏斑。7.2解剖檢查解剖病魚，觀察是否出現(xiàn)下列癥狀：鰓紅腫出血；肝臟腫大，有出血點和灰白色的壞死病灶；脾臟和腎臟腫大、出血；腸粘膜水腫、充血、發(fā)炎。7.3臨床判定體表檢查和解剖檢查中出現(xiàn)以上臨床癥狀，初步判斷為疑似鰻鱺皰疹病毒感染。8實驗室分子診斷8.1鰻鱺皰疹病毒的PCR檢測8.1.1采樣在鰻鱺的鰓、肝臟、脾臟、腎臟等部位及體表黏液，共取50mg～100mg樣品，置于1.5mL離心管8.1.2樣品處理首先加入150μLCTAB溶液（見附錄A的A.1），用小剪刀將樣品剪碎，再用勻漿器將樣品勻漿后，再加CTAB溶液到900μL，混勻后于室溫孵育2h，4000g離心5min，取上清液。8.1.3DNA抽提在上述上清液中先加600μL抽提液1（見附錄A的A.2），充分混合30s，12000g離心5min，取上層水相；再加700μL抽提液2（見附錄A的A.3），充分混合30s，12000g離心5min，取上層水相；然后加入1.5倍體積的異丙醇，混勻后，靜置5min，12000g離心10min，棄上清液；加入600μL75%DB35/T2024—20213乙醇，混勻后12000g離心10min，棄上清液，室溫靜置5min；最后加20μL水溶解沉淀，作為PCR模板。提取步驟也可采用等效商品化組織DNA提取試劑盒提取。8.1.4PCR擴增DNA在0.2mL離心管中加入10×PCR緩沖液（見附錄A的A.7）2.5μL、25mmol/L氯化鎂（MgCl2見附錄A的A.6）1μL、dNTP2μL、上下游引物各0.5μL、Taq酶2U、1μL待測樣品DNA為模板，補充水至總體積25μL，也可采用等效商品化試劑盒進行擴增。反應(yīng)液混勻后，離心使其集中在離心管底部，將離心管置于PCR擴增儀，按照94℃4min；再94℃30s，55℃30s，72℃30s，40次循環(huán)；然后72℃10min；最后4℃保溫的反應(yīng)條件進行PCR擴增。8.1.5瓊脂糖凝膠電泳用TBE電泳緩沖液（見附錄A的A.4）配制1%的瓊脂糖[含0.5μg/mLEB（見附錄A的A.5）]凝膠。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。取6μLPCR擴增產(chǎn)物和2μL電泳上樣緩沖液（見附錄A的A.8）混勻，加入樣品孔，5V/cm電泳約30min，當溴酚藍到達凝膠底部時停止電泳。在凝膠成像儀下觀察核酸條帶并判斷結(jié)果。8.1.6設(shè)立對照8.1.6.1取已知鰻鱺皰疹病毒感染陽性的組織DNA或鰻鱺皰疹病毒陽性克隆片段1μL為模板，作為陽性對照。8.1.6.2取已知鰻鱺皰疹病毒陰性的組織DNA1μL為模板，作為陰性對照。8.1.6.3用1μL水為模板，作為空白對照。8.2結(jié)果判定8.2.1PCR擴增后，陽性對照的PCR產(chǎn)物會出現(xiàn)一條約394bp的DNA條帶，陰性對照和空白對照沒有該條帶，則實驗結(jié)果成立。8.2.2待測樣品經(jīng)PCR擴增后，電泳后出現(xiàn)約394bp條帶的判定為陽性，沒有出現(xiàn)條帶或者條帶的大小不符合394bp的均判定為陰性。9綜合判定疑似鰻鱺皰疹病毒感染的樣品，經(jīng)PCR擴增出394bp片段，并經(jīng)測序比對分析后（見附錄B），同源性大于99%，判定為鰻鱺皰疹病毒病。無臨床癥狀和病理變化的樣品，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出394bp片段，并經(jīng)測序比對分析后（見附錄B同源性大于99%，判定為攜帶鰻鱺皰疹病毒。DB35/T2024—20214試劑配制A.1CTAB溶液按2%CTAB，1.4mmol/LNaCl，20mmol/LEDTA，20mmol/LTris-HClpH7.5配制。使用前加巰基乙醇至終濃度為0.25%。A.2抽提液1三氯甲烷/異戊醇（將三氯甲烷和異戊醇按24:1的比例混合，密閉避光保存）。A.3抽提液2混合，密閉避光保存）。A.4TBE電泳緩沖液（5X濃縮液）A.4.1成分表A.1TBE電泳緩沖液成分試劑名稱試劑含量Tris54.0g硼酸27.5gEDTA2.9gA.4.2制法將固體物質(zhì)溶解于蒸餾水,將總體積調(diào)整至1000mL，用5mol/L的HCl調(diào)pH至8.0。A.5溴化乙錠（EB）用水配制成10mg/mL的濃縮液。A.6氯化鎂（MgCl2）25mmol/L。A.710×PCR緩沖液（10×buffer）A.7.1成分DB35/T2024—20215表A.210×PCR緩沖液成分試劑名稱試劑含量Tris-HCl7.88g氯化鉀3.73gTritonX-100A.7.2制法將固體物質(zhì)溶解于蒸餾水,再加入1mLTritonX-100，將總體積調(diào)整至100mL。A.84×電泳上樣緩沖液每100mL溶液中含溴酚藍0.25g，蔗糖40g。DB35/T2024—20216鰻鱺皰疹病毒陽性參考序列以下為鰻鱺皰疹病毒陽性基因序列片段。CATGCCGGGAGTCTTTTTGATCACGTCCTCCACTATAAGGATCTTTTGTCGCCCCGAGAGCGTGGTCAACATCTGACAGATGCGATCCGATACGCCGTAGTGCGAGTTGGCGCAGATCTTCATCTCGTTCTGCAGCTGGTTGAAGTATTTTTTCAGTCCGGGGCTCTTGGCCGTCTTCAT