1T/GARIRPAXXXX—XXXX畜禽用噬菌體制劑本文件規(guī)定了畜禽用噬菌體制劑的術語和定義、質(zhì)量要求和理化指標、試驗方法、標簽、包裝、運輸及貯存要求。本文件適用于裂解大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等的單株或多株噬菌體為主要原料并可用于預防或治療由上述病原引起的畜禽細菌感染的畜禽用噬菌體制劑質(zhì)量控制。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB10648飼料標簽GB4789.2食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測GB/T191包裝儲運圖示標志GB/T9742化學試劑H值測定通則GB/T36911運輸包裝指南GB/T14699.1飼料采樣3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1噬菌體bacteriophage,phage一類能感染細菌、真菌、藻類、放線菌、支原體及螺旋體等微生物的一類病毒的總稱,亦稱細菌病3.2噬菌體侵染細菌，導致宿主細胞溶解死亡，在瓊脂培養(yǎng)基生長的菌苔上形成的空斑。3.3畜禽用噬菌體制劑bacteriophagepreparation含有一株或多株噬菌體為主要成分的制劑。4質(zhì)量要求及其理化指標4.1噬菌體制劑安全要求4.1.1噬菌體產(chǎn)品應符合《中華人民共和國生物安全法》和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《獸用生物制品注冊分類及注冊資料要求》。4.1.2噬菌體制劑中的噬菌體應安全、有效。4.1.3噬菌體制劑中的噬菌體應為裂解性噬菌體，遺傳背景明確，不攜帶毒力基因、整合基因，并應通過全基因組測序驗證，測序數(shù)據(jù)保存≥5年。4.1.4噬菌體制劑產(chǎn)品應符合相應的企業(yè)標準。4.2噬菌體制劑理化指標噬菌體制劑（液體/固體）的理化指標見附錄A.1，附錄A.2。T/GARIRPAXXXX—XXXX25試驗方法5.1性狀將樣品放置在潔凈的燒杯內(nèi)，在光線充足、非直射日光、無異味的環(huán)境中，用眼觀的方法觀察其色澤，用按GB/T14699.1規(guī)定的方法檢測其氣味。5.2pH值按照GB/T9742規(guī)定執(zhí)行。5.3效價按照附錄B中的B.4.1的規(guī)定執(zhí)行。5.4雜菌數(shù)噬菌體制劑中仍存活的細菌視為雜菌。雜菌數(shù)按照GB4789.2規(guī)定的微生物菌落總數(shù)測定方法執(zhí)行。5.5裂解效率按照附錄B中B.4.2的規(guī)定執(zhí)行。6標簽、包裝、運輸、貯存6.1標簽噬菌體制劑的標簽應符合GB10648的規(guī)定。標完整、清晰，標簽說明上應注明噬菌體制劑的種類、含量、用法、貯藏條件和方法、保質(zhì)期、企業(yè)名稱、生產(chǎn)地址、聯(lián)系方式等，并說明開啟后保存期限。6.2包裝噬菌體制劑包裝應符合GB/T191規(guī)定。液體制劑采用塑料瓶或玻璃瓶,規(guī)格為:100mL200mL、500mL/瓶等，或按用戶指定要求。粉末制劑的小包裝采用鋁箔袋，規(guī)格為50g、100g、200g、500g、1kg/袋等，或根據(jù)用戶提出的凈含量要求進行包裝。粉末制劑的大包裝采用內(nèi)襯塑料袋的編織袋或瓦楞紙箱，每袋(或箱)的規(guī)格為5kg、10kg、20kg、25kg等，或根據(jù)用戶提出的凈含量要求進行包裝。凈含量應符合國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局《定量包裝商品計量監(jiān)督管理辦法》的規(guī)定。6.3運輸噬菌體制劑運輸應符合GB/T36911運輸包裝指南。6.4貯存噬菌體制劑應保存于干燥、避光處，2℃~8℃冷藏保存，在符合運輸、貯存條件的情況下，原包裝(未開封)產(chǎn)品的保質(zhì)期為3個月以上。T/GARIRPAXXXX—XXXX3（規(guī)范性）噬菌體制劑理化指標A.1液體噬菌體制劑理化指標表A.1液體噬菌體制劑理化指標<100A.2固體噬菌體制劑理化指標表A.2固體噬菌體制劑理化指標<100T/GARIRPAXXXX—XXXX4（規(guī)范性）噬菌斑、噬菌體效價及噬菌體裂解效率測定方法B.1儀器設備B.1.1恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃B.1.2離心機:轉(zhuǎn)速12000r/minB.1.3超凈工作臺B.1.4高壓蒸汽滅菌鍋B.1.5恒溫震蕩培養(yǎng)器:36℃士1℃~42℃士1℃B.1.6電子分析天平：感量0.001gB.1.7電熱恒溫鼓風干燥箱:10℃~200℃B.1.8冰箱:-40℃以下和-20℃~8℃B.1.9無菌培養(yǎng)皿:Ф90mmB.1.11漩渦混合儀B.1.12細菌涂布器B.2試劑和材料B.2.1LB培養(yǎng)基B.2.2LB固體培養(yǎng)基B.2.3氫氧化鈉B.2.4鹽酸B.2.5宿主菌(增殖對應的噬菌體)B.3雙層瓊脂培養(yǎng)基制備B.3.1上層固體培養(yǎng)基配置:LB固體培養(yǎng)基2.5%(g/100mL)瓊脂粉0.75%(g/100mL)pH值調(diào)節(jié)到7.2~7.4。B.3.2下層固體培養(yǎng)基配置:LB固體培養(yǎng)基2.5%(g/100mL)瓊脂粉1.5%(g/100mL)pH值調(diào)節(jié)到7.2~7.4。B.3.3液體培養(yǎng)基配置:LB培養(yǎng)基2.5%(g/100mL)瓊脂粉1.5%(g/100mL)pH值調(diào)節(jié)到7.2~7.4。B.3.4滅菌配制的培養(yǎng)基于121℃高壓滅菌20min。T/GARIRPAXXXX—XXXX5B.4檢測步驟B.4.1噬菌體效價測定取噬菌體制劑樣本1mL(1mg)，加入9mL生理鹽水中，渦旋混勻，重復上述操作，按照制劑標注的噬菌體含量，將噬菌體制劑樣本依次稀釋到1x102PFU/mL。每次檢測設三個平行，取100μL噬菌體稀釋液樣品，加入至100μL敏感宿主菌的增殖液中，混勻，于宿主菌最佳培養(yǎng)溫度條件下孵育5min，加入5mL上層半固體培養(yǎng)基，混勻后，傾倒在下層固體培養(yǎng)基上，室溫靜置至上層半固體培養(yǎng)基凝固。于宿主菌最佳培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)3h~8h，統(tǒng)計噬菌斑個數(shù)，按照B.4.2.3要求，根據(jù)公式(B.1)計算噬菌體效價，三個平行結(jié)果取算術平均值。該試驗重復三次，報告結(jié)果取三次噬菌體效價的算術平均值，結(jié)果保留2位有效數(shù)字。B.4.2噬菌體裂解效率測定B.4.2.1宿主菌稀釋選擇用于增殖噬菌體的宿主菌，取1mL新鮮制備的宿主菌增殖液，加入9mL生理鹽水中，渦旋混勻，重復上述操作,根據(jù)宿主菌增殖液的初始效價直至將宿主菌效價稀釋到1x105CFU/mL.B.4.2.2裂解效率測定取1mL(1mg)待測定的菌體制劑樣本，加入1mL濃度為1x105CFU/mL的宿主菌稀釋液中，25℃±2℃,100rpm振蕩孵育30min，輕輕混勻后用無菌生理鹽水將混合液稀釋到10-1、10-2、10-3三個梯度，每個梯度分別取100μL加到宿主菌適宜的固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布器涂布均勻，每個梯度做三個平行，在宿主菌最適培養(yǎng)條件下倒置培養(yǎng)12h~48h。同時，吸取1mL效價為1x105CFU/mL的宿主菌稀釋液，加入1mL無菌生理鹽水作為空白對照處理，重復上述操作步驟。按照GB4789.2中6.3的規(guī)定進行平板上菌落計數(shù)，按照公式(B.2)計算噬菌體的裂解效率。該試驗重復三次，報告結(jié)果取