免疫細(xì)胞培養(yǎng)操作流程及存儲(chǔ)注意事項(xiàng)免疫細(xì)胞培養(yǎng)作為細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)及細(xì)胞治療領(lǐng)域的核心技術(shù)，其操作規(guī)范性與存儲(chǔ)科學(xué)性直接影響細(xì)胞活性、功能及后續(xù)應(yīng)用效果（如細(xì)胞治療產(chǎn)品制備、基礎(chǔ)研究模型構(gòu)建等）。本文結(jié)合行業(yè)實(shí)踐與技術(shù)規(guī)范，系統(tǒng)梳理免疫細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程，并針對(duì)細(xì)胞存儲(chǔ)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)提出實(shí)操建議，為科研及產(chǎn)業(yè)端從業(yè)者提供參考。一、免疫細(xì)胞培養(yǎng)操作流程（一）前期準(zhǔn)備：試劑、耗材與環(huán)境質(zhì)控免疫細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)無菌環(huán)境要求嚴(yán)苛，需提前24小時(shí)開啟生物安全柜紫外燈消毒，超凈工作臺(tái)或細(xì)胞房需定期經(jīng)臭氧/甲醛熏蒸。試劑方面，需準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如RPMI-1640、IMDM，依細(xì)胞類型選擇）、胎牛血清（FBS）（需經(jīng)熱滅活及支原體檢測(cè)）、細(xì)胞因子（如IL-2、IL-15維持免疫細(xì)胞活化）、無酶消化液（避免蛋白酶損傷細(xì)胞表面受體）；耗材需選用無熱源、無內(nèi)毒素的離心管、培養(yǎng)瓶/板，使用前經(jīng)高壓滅菌或輻照處理。儀器需提前校準(zhǔn)CO?培養(yǎng)箱（溫度37℃、CO?濃度5%）、低速常溫離心機(jī)（避免細(xì)胞損傷）、倒置顯微鏡（觀察細(xì)胞形態(tài)）。（二）細(xì)胞獲取與分離免疫細(xì)胞來源包括外周血、臍帶血、組織（如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞TILs）等。以外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離為例：1.采集抗凝全血（EDTA或肝素抗凝），室溫靜置平衡后，緩慢疊加于等體積淋巴細(xì)胞分離液（密度1.077g/mL）上層，保持液面清晰；2.常溫下以2000rpm離心20分鐘（無剎車），使細(xì)胞分層（上層血漿、中間白膜層為PBMC、下層紅細(xì)胞）；3.用無菌吸管吸取白膜層細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至新離心管，加入5倍體積含2%FBS的PBS，室溫靜置5分鐘裂解殘留紅細(xì)胞；4.1500rpm離心5分鐘，棄上清，用含10%FBS的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后備用。若為組織來源（如腫瘤組織），需先剪碎組織，用膠原酶/透明質(zhì)酸酶混合液（37℃消化30分鐘），經(jīng)70μm濾網(wǎng)過濾后，再行密度梯度離心分離。（三）培養(yǎng)基配制與細(xì)胞接種完全培養(yǎng)基需依細(xì)胞類型優(yōu)化配方：如T細(xì)胞培養(yǎng)需在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10%FBS、100U/mL青霉素-鏈霉素、50μMβ-巰基乙醇（維持還原環(huán)境）、100IU/mLIL-2；NK細(xì)胞培養(yǎng)則需IL-15（50ng/mL）聯(lián)合IL-21（20ng/mL）。配制后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，4℃避光保存（不超過2周）。細(xì)胞接種密度需適配細(xì)胞類型：初始接種時(shí)，PBMC密度建議為1×10?cells/mL，T細(xì)胞活化后可調(diào)整至5×10?cells/mL。將細(xì)胞懸液加入預(yù)溫的培養(yǎng)瓶/板，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱，避免頻繁開啟箱門（穩(wěn)定環(huán)境減少污染風(fēng)險(xiǎn)）。（四）培養(yǎng)過程監(jiān)控與干預(yù)1.形態(tài)觀察：每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（如T細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，活化后可見聚團(tuán)；NK細(xì)胞多為分散的圓形或橢圓形），記錄細(xì)胞密度、活率（臺(tái)盼藍(lán)拒染法，活率低于80%需警惕凋亡或污染）；2.換液與傳代：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×10?cells/mL（或培養(yǎng)基顏色由紅變黃）時(shí)，需半量換液（保留部分舊培養(yǎng)基維持細(xì)胞因子濃度）或傳代。懸浮細(xì)胞可直接按1:2~1:3比例分瓶，貼壁細(xì)胞（如樹突狀細(xì)胞）需用無酶消化液輕柔消化后重懸接種；3.污染防控：若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基渾濁、出現(xiàn)菌絲/顆粒，需立即移走污染樣本，對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒（75%乙醇擦拭托盤，更換水盤無菌水）。定期對(duì)培養(yǎng)箱、生物安全柜進(jìn)行支原體、細(xì)菌、真菌檢測(cè)（如PCR法檢測(cè)支原體，革蘭染色排查細(xì)菌）。（五）細(xì)胞收獲與質(zhì)控當(dāng)細(xì)胞達(dá)到預(yù)期數(shù)量或功能狀態(tài)（如T細(xì)胞經(jīng)CAR轉(zhuǎn)染后），需收獲細(xì)胞：1.收集細(xì)胞懸液，1500rpm離心5分鐘，棄上清；2.用PBS洗滌2次（去除殘留血清及細(xì)胞因子），重懸于凍存液或?qū)嶒?yàn)用緩沖液；3.質(zhì)控環(huán)節(jié)需檢測(cè)細(xì)胞活率（≥90%）、表型純度（流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3?、CD4?等標(biāo)志物）、功能活性（如殺傷實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子分泌ELISA）、無菌性（需氧/厭氧培養(yǎng)14天，支原體檢測(cè)陰性）。二、免疫細(xì)胞存儲(chǔ)注意事項(xiàng)（一）短期存儲(chǔ)（≤72小時(shí)）若需短期存放（如運(yùn)輸至合作實(shí)驗(yàn)室），可將細(xì)胞懸液置于4℃冰箱，密度維持在1×10?cells/mL，每12小時(shí)輕柔混勻一次（避免細(xì)胞沉降缺氧）。需注意：4℃環(huán)境下細(xì)胞代謝減緩，但仍會(huì)消耗營(yíng)養(yǎng)，因此存放時(shí)間不宜超過3天，且需在復(fù)蘇后重新評(píng)估活率（通常需≥85%）。（二）長(zhǎng)期凍存（液氮或-196℃環(huán)境）長(zhǎng)期存儲(chǔ)需依賴程序降溫與液氮凍存，核心要點(diǎn)包括：1.凍存液配方：常用90%FBS+10%DMSO（或無血清凍存液，如STEM-CELLBAMBANKER），DMSO需現(xiàn)用現(xiàn)配（避免氧化），且需在4℃預(yù)冷；2.梯度降溫：將細(xì)胞懸液（密度1×10?~5×10?cells/mL）裝入凍存管，先置于4℃平衡30分鐘，再轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱（或程序降溫儀，以1℃/min速率降溫）過夜，次日移入液氮罐氣相區(qū)（避免液氮直接浸泡導(dǎo)致凍存管破裂）；3.凍存管選擇：需使用耐低溫的聚丙乙烯凍存管，外旋蓋設(shè)計(jì)（防止液氮滲入），且需標(biāo)記清晰（細(xì)胞類型、代數(shù)、凍存日期、操作者）；4.液氮罐管理：定期（每周）檢查液氮液位，補(bǔ)充液氮至安全線以上；每月記錄罐內(nèi)溫度（氣相區(qū)需≤-150℃），并對(duì)凍存管進(jìn)行盤點(diǎn)，避免樣本混淆或丟失。（三）細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)復(fù)蘇是凍存細(xì)胞活性恢復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，操作需快速：1.從液氮罐取出凍存管，立即放入37℃水?。ㄋ娴陀诠苌w，避免污染），快速晃動(dòng)至僅剩少量冰晶（約1分鐘）；2.用含20%FBS的培養(yǎng)基（預(yù)溫）稀釋細(xì)胞懸液（1:10比例，緩慢加入以降低DMSO濃度），1500rpm離心5分鐘，棄上清；3.用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并檢測(cè)活率（凍存復(fù)蘇后活率通常需≥80%，若低于70%需分析凍存過程是否存在失誤）；4.復(fù)蘇后細(xì)胞需在37℃、5%CO?環(huán)境中靜置2~4小時(shí)，待細(xì)胞貼壁或恢復(fù)懸浮狀態(tài)后，再進(jìn)行換液或傳代。（四）存儲(chǔ)質(zhì)控與追溯建立細(xì)胞庫管理系統(tǒng)：對(duì)每支凍存管進(jìn)行唯一編號(hào)，記錄細(xì)胞來源、培養(yǎng)代數(shù)、凍存密度、質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（活率、表型、功能）；定期（每6個(gè)月）復(fù)蘇一支凍存管，驗(yàn)證細(xì)胞活性與功能，確保存儲(chǔ)穩(wěn)定性。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性下降，需排查凍存液配方、降溫速率或液氮罐維護(hù)是否存在問題。三、總結(jié)與實(shí)踐建議免疫細(xì)胞培養(yǎng)的核心在于無菌操作、精準(zhǔn)的細(xì)胞因子調(diào)控及穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，而存儲(chǔ)環(huán)節(jié)則需平衡凍存保護(hù)劑的毒性與細(xì)胞活性的維持。實(shí)踐中，建議：1.新研究者需在資深人員指導(dǎo)下完成首次培養(yǎng)，重點(diǎn)掌握無菌操作與細(xì)胞狀態(tài)判斷；2.建立標(biāo)準(zhǔn)化SOP（標(biāo)準(zhǔn)操作流程），記錄每一步操作的時(shí)間、試劑批號(hào)、細(xì)胞密度等，便于問