T/YNSOZACodeofPracticeforRhinopithecusstrykeripopulationgeneticarchives2025-12-02發(fā)布I 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 5 6 7本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。1怒江金絲猴種群遺傳檔案建立技術規(guī)程線粒體控制區(qū)mitochondrialcontrolr微衛(wèi)星序列microsatellitesSSR）。這類序列中，其重復單元數(shù)目在個體間存在差異的多態(tài)性位點，可作為微衛(wèi)星標記用于遺傳分指利用動物組織或糞便提取的基因組DNA，本標準中是指利用怒江金絲猴組織（如毛2怒江金絲猴糞便中進行總DNA提取，提取的DNA樣本進行質(zhì)量檢測。合格的DNA樣本應滿足以下標準：A260/A280比值介于1.7-2.1之間，足上述所有指標的樣本視為不合格。瓊脂糖凝膠電泳檢測與成像方法詳見附錄B。對線粒體標記PCR擴增成功的個體進行個體識別，使用附錄C中的10個微衛(wèi)星序列將7.1規(guī)定的怒江金絲猴線粒體標記序列送至可選用多種適用于PCR反應的酶進行PCR擴增，PCR反應體體系組成與反應時間等參數(shù)，重新進行擴增并完成質(zhì)量驗證。對符合質(zhì)量標準的PCR產(chǎn)物進行測序，隨后利用專業(yè)生物學軟件對測序成功獲得的序列進行校對3利用NCBI(美國國立生物技術信息中心)的GenBank數(shù)據(jù)庫的Blast搜索程序?qū)Υb定個體的DNA序可選用多種適用于PCR反應的酶進行PCR擴增，PCR反應體4℃條件下保存，以備后續(xù)基因分型使用；未通過質(zhì)量檢測的樣本，則需系統(tǒng)優(yōu)化PCR反應條件，重新進行擴增與質(zhì)檢流程。9.4微衛(wèi)星分型9.4.1將符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物送至有關公司進9.4.2應使用相同型號的設備和分子內(nèi)標對所有樣品進行基因分型，獲得的數(shù)據(jù)應使用同一軟件進行9.5個體識別采用Cervus軟件對10個微衛(wèi)星位點的分型數(shù)據(jù)開展個體識別分析，設定最小匹配位點數(shù)為9，允許模糊匹配數(shù)為1。個體判定標準如下：若兩個及以上樣本的微衛(wèi)星分型結果完全一致，則判定為同一來位點存在分型差異，則對該差異位點進行2-3次重復PCR擴增與基因分型驗證——若重復結果一致，判定為同一來源個體；若重復結果仍存在差異，則判定為不同4包括樣品編號、微衛(wèi)星序列編號、分型圖、個體識別微衛(wèi)星分型數(shù)5本文件用商用試劑盒進行總DNA樣品的提取，提取步驟如下（按照說明書進行）：20將QIAampspincolumn置于1.5μL的離心A.2瓊脂糖凝膠電泳檢測及成像方法A.2.1配置1%的瓊脂糖凝膠，100mL1×TAE電泳緩沖液加1g瓊脂入膠槽，插上樣品梳，靜置。配置2%的瓊脂糖凝膠100mL1×TAE電泳緩沖液中需加加2g瓊脂A.2.2將瓊脂糖凝膠和膠板置于電泳槽中，使點樣孔位于負極，取2μL圖B.1怒江金絲猴DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測圖6引物序列5’-3’5‘-3’℃1F:GCAAAGACACACACATAGR:ATGCCTTCTTTGTCTCT2F:AGAGAGAATCCCCCTGR:GAGCAAGACTCCATCT3F:TTCCAACTAACACTAAAAR:CACAGGGGTGAAAATA4F:GACAACCCAGAGCCATCTR:TGGGTGACAGAGTAAG5R:GCCTGGACAACAGAGT6F:GCTTCTGAATTCTTCCAA7F:GTCTACTGTGGGTGAAC8F:AGAGGTTGCAGTGAGCR:GGACTACTGCTAAGCAA9F:GGGTATCAGTCTGCTTTG7 本標準使用2x