廣西地區(qū)藍(lán)舌病毒（BTV）的綜合研究：感染、傳播、鑒定與致病性探索一、引言1.1研究背景與意義藍(lán)舌?。˙luetongue，BT）是一種由藍(lán)舌病毒（Bluetonguevirus，BTV）引發(fā)的病毒性傳染病，主要感染反芻動(dòng)物，在全球范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。藍(lán)舌病病毒屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬，其病毒粒子呈二十面體對稱，無包膜，直徑約為60-80納米。該病毒的基因組由10個(gè)雙鏈RNA片段組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和5種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1-NS5），這些蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配和致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。藍(lán)舌病的傳播主要通過庫蠓等吸血昆蟲，庫蠓在吸食感染動(dòng)物的血液后，病毒在其體內(nèi)增殖，當(dāng)庫蠓再次叮咬其他易感動(dòng)物時(shí)，便將病毒傳播給新的宿主。這種傳播方式使得藍(lán)舌病的傳播具有明顯的季節(jié)性和地域性，與庫蠓的分布和活動(dòng)密切相關(guān)。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，由于氣候溫暖濕潤，庫蠓全年均可活動(dòng)，BTV的傳播風(fēng)險(xiǎn)較高；而在溫帶和寒帶地區(qū)，庫蠓的活動(dòng)受到季節(jié)限制，BTV的傳播主要發(fā)生在溫暖季節(jié)。藍(lán)舌病最早于18世紀(jì)在南非的綿羊身上被發(fā)現(xiàn)，目前已廣泛分布于全球多個(gè)地區(qū)。在歐洲，2023年藍(lán)舌病疫情在荷蘭、德國、法國等多個(gè)國家蔓延。2023年9月，一種不明來源的新型BTV-3變種在荷蘭出現(xiàn)，并在短短兩個(gè)月內(nèi)傳遍了該國，近6000個(gè)荷蘭農(nóng)場受影響，數(shù)萬只綿羊死亡，死亡率高達(dá)75%，給當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)帶來了沉重打擊。在亞洲、非洲、北美洲和南美洲等地區(qū)，藍(lán)舌病也時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)發(fā)展。藍(lán)舌病給畜牧業(yè)帶來的危害是多方面的。感染藍(lán)舌病的動(dòng)物會出現(xiàn)發(fā)熱、口腔黏膜和蹄部潰瘍、出血性病變等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。除了直接的死亡損失外，藍(lán)舌病還會導(dǎo)致動(dòng)物體重減輕、產(chǎn)奶量下降和胎兒流產(chǎn)等問題，給畜牧生產(chǎn)者帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)成本。僅2007年，BTV-8在法國和荷蘭的經(jīng)濟(jì)影響就超過14億美元，全球影響估計(jì)超過30億美元。廣西作為我國的畜牧業(yè)大省，牛羊養(yǎng)殖規(guī)模較大。2022年上半年，廣西牛出欄85.59萬頭，同比增長8.70%；羊出欄137.16萬只，同比增長13.60%。然而，廣西地區(qū)的氣候條件溫暖濕潤，非常適合庫蠓等吸血昆蟲的滋生和繁殖，這使得廣西地區(qū)面臨著藍(lán)舌病傳播的高風(fēng)險(xiǎn)。一旦藍(lán)舌病在廣西地區(qū)暴發(fā)和流行，將會對當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)造成嚴(yán)重的沖擊，影響農(nóng)民的收入和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。目前，雖然已經(jīng)有一些關(guān)于藍(lán)舌病的研究，但針對廣西地區(qū)的BTV感染情況、傳播媒介種類以及病毒的分離鑒定和致病性等方面的研究還相對較少。因此，開展廣西BTV感染及傳播媒介調(diào)查、病毒分離鑒定與致病性初步研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。通過本研究，可以了解廣西地區(qū)BTV的感染現(xiàn)狀和流行規(guī)律，明確其傳播媒介，為制定有效的防控措施提供科學(xué)依據(jù)；同時(shí)，成功分離鑒定BTV病毒并研究其致病性，對于開發(fā)針對性的疫苗和藥物具有重要的指導(dǎo)作用，有助于保障廣西地區(qū)畜牧業(yè)的健康發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)民增收和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的繁榮。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國際上，藍(lán)舌病的研究歷史較為悠久。自18世紀(jì)在南非被首次發(fā)現(xiàn)以來，各國科研人員圍繞BTV展開了廣泛而深入的研究。在病毒的基礎(chǔ)研究方面，對BTV的基因組結(jié)構(gòu)、蛋白功能以及病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和裝配機(jī)制等都有了較為清晰的認(rèn)識。研究發(fā)現(xiàn)，BTV的10個(gè)雙鏈RNA片段分別編碼不同的蛋白，其中VP1-VP7為結(jié)構(gòu)蛋白，參與病毒粒子的組成；NS1-NS5為非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的生命周期中發(fā)揮著重要作用。例如，VP2蛋白是病毒的主要抗原蛋白，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的入侵；VP5蛋白則在病毒入侵過程中，通過構(gòu)象變化穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入宿主細(xì)胞質(zhì)。在流行病學(xué)研究方面，國外對BTV的傳播規(guī)律、宿主范圍和媒介昆蟲等進(jìn)行了大量的調(diào)查和分析。通過長期的監(jiān)測和研究，明確了BTV主要通過庫蠓等吸血昆蟲傳播，不同地區(qū)的優(yōu)勢傳播媒介存在差異。在歐洲，庫蠓屬的一些種類如尖喙庫蠓、荒川庫蠓等是BTV的重要傳播媒介；在非洲，不同的庫蠓種類在BTV的傳播中也扮演著關(guān)鍵角色。此外，還發(fā)現(xiàn)BTV的傳播與氣候、地理環(huán)境等因素密切相關(guān)，溫暖濕潤的氣候條件有利于庫蠓的繁殖和活動(dòng)，從而增加了BTV的傳播風(fēng)險(xiǎn)。在疫苗研發(fā)方面，國外已經(jīng)取得了一定的成果。目前，已經(jīng)研發(fā)出多種類型的BTV疫苗，包括滅活疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗等。這些疫苗在一定程度上控制了BTV的傳播和流行，但由于BTV存在多個(gè)血清型，各血清型之間的交叉保護(hù)作用較弱，需要針對不同血清型的病毒進(jìn)行疫苗接種，這增加了疫苗防控的復(fù)雜性和成本。例如，在2006-2008年歐洲BTV-8疫情期間，雖然使用了疫苗進(jìn)行防控，但由于病毒的變異和血清型的多樣性，疫情仍然造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在國內(nèi)，對BTV的研究也逐漸受到重視。近年來，開展了一系列關(guān)于BTV的血清學(xué)調(diào)查、分子流行病學(xué)研究和疫苗研發(fā)等工作。通過血清學(xué)調(diào)查，了解了我國部分地區(qū)BTV的感染情況，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的感染率存在差異。在江蘇地區(qū)，對369份牛血清和202份羊血清進(jìn)行檢測，結(jié)果表明牛群的BTV感染陽性率為0%-63.8%，平均陽性率為17.6%；羊群的感染陽性率為0%-20%，平均陽性率為4.5%。在分子流行病學(xué)研究方面，通過對BTV的基因序列進(jìn)行分析，揭示了我國BTV的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系，為病毒的溯源和防控提供了重要依據(jù)。然而，針對廣西地區(qū)的BTV研究還相對較少。雖然廣西的畜牧業(yè)發(fā)展迅速，但在BTV的感染情況、傳播媒介種類以及病毒的分離鑒定和致病性等方面的研究還存在許多不足與空白。目前，對廣西地區(qū)BTV的血清型分布情況了解還不夠全面，尚未系統(tǒng)地開展對當(dāng)?shù)貍鞑ッ浇閹祗贩N類的調(diào)查和鑒定工作。在病毒的分離鑒定方面，雖然已經(jīng)有一些初步的嘗試，但成功分離出的病毒株數(shù)量有限，對病毒的生物學(xué)特性和致病性的研究還不夠深入。此外，針對廣西地區(qū)的BTV防控策略和措施的研究也相對滯后，缺乏針對性和有效性。因此，開展廣西BTV感染及傳播媒介調(diào)查、病毒分離鑒定與致病性初步研究具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有助于填補(bǔ)廣西地區(qū)在這一領(lǐng)域的研究空白，為當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的健康發(fā)展提供有力的技術(shù)支持。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在全面了解廣西地區(qū)藍(lán)舌病病毒（BTV）的感染狀況、傳播媒介種類，成功分離鑒定BTV病毒，并對其致病性進(jìn)行初步探究，為廣西地區(qū)藍(lán)舌病的防控提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。具體目標(biāo)如下：明確廣西地區(qū)BTV的感染率、流行規(guī)律以及血清型分布情況，掌握不同地區(qū)、不同宿主動(dòng)物的感染差異，為制定針對性的防控策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。準(zhǔn)確鑒定廣西地區(qū)BTV的傳播媒介庫蠓的種類和分布特征，分析其與BTV傳播的相關(guān)性，為有效控制傳播媒介提供科學(xué)依據(jù)。成功分離廣西地區(qū)的BTV毒株，并對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和生物學(xué)特性分析，為病毒的溯源和進(jìn)化研究提供材料。初步研究分離出的BTV毒株對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致病性，明確其致病機(jī)制和病理變化，為評估病毒的危害程度和制定防控措施提供參考。1.3.2研究內(nèi)容廣西地區(qū)BTV感染情況調(diào)查：在廣西多個(gè)地區(qū)，根據(jù)不同的地理環(huán)境、養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖方式，選取具有代表性的牛羊養(yǎng)殖場及散養(yǎng)戶作為調(diào)查對象。采集牛羊的血液樣本，運(yùn)用血清學(xué)檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA），檢測樣本中的BTV抗體，計(jì)算不同地區(qū)、不同宿主動(dòng)物的BTV感染率。同時(shí)，收集被調(diào)查動(dòng)物的基本信息，包括品種、年齡、性別、養(yǎng)殖方式等，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析這些因素與BTV感染率之間的關(guān)系，探究BTV在廣西地區(qū)的流行規(guī)律。此外，對部分抗體陽性樣本，采用病毒核酸檢測技術(shù)，如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），進(jìn)一步確定BTV的核酸陽性率，并對陽性樣本進(jìn)行基因測序和分析，明確廣西地區(qū)BTV的血清型分布情況。廣西地區(qū)BTV傳播媒介調(diào)查與鑒定：在上述采樣地區(qū)，使用多種誘捕方法，如二氧化碳誘捕器、光誘捕器等，在不同的生境，如養(yǎng)殖場周邊、草地、濕地等，采集庫蠓樣本。對采集到的庫蠓樣本，依據(jù)其形態(tài)學(xué)特征，參考相關(guān)的分類學(xué)文獻(xiàn)和圖譜，進(jìn)行種類鑒定。對于難以通過形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確鑒定的種類，采用分子生物學(xué)方法，如線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I（COI）基因測序和分析，確定其種類。統(tǒng)計(jì)不同地區(qū)、不同生境中庫蠓的種類和數(shù)量分布，分析其與BTV感染率的相關(guān)性，明確廣西地區(qū)BTV的主要傳播媒介及其分布特征。廣西地區(qū)BTV的分離與鑒定：將采集到的BTV核酸陽性的血液樣本或組織樣本，接種到敏感的細(xì)胞系，如BHK-21細(xì)胞、C6/36細(xì)胞等，進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)。通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），如細(xì)胞變圓、脫落、融合等，初步判斷病毒的生長情況。對分離得到的病毒，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增其特異性基因片段，如VP2基因、VP7基因等，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。將擴(kuò)增得到的基因片段進(jìn)行測序，并與GenBank中已有的BTV基因序列進(jìn)行比對分析，確定分離毒株的基因型和遺傳進(jìn)化關(guān)系。同時(shí)，運(yùn)用電鏡技術(shù)觀察病毒粒子的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步確認(rèn)分離毒株為BTV。廣西地區(qū)BTV致病性初步研究：選取健康的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如綿羊、牛等，將分離鑒定得到的BTV毒株通過肌肉注射、靜脈注射等途徑接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，設(shè)置不同的接種劑量和對照組。在接種后的不同時(shí)間段，觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床癥狀，如體溫變化、精神狀態(tài)、采食情況、口腔和蹄部病變等，并進(jìn)行詳細(xì)記錄。定期采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液、組織等樣本，檢測病毒血癥的發(fā)生情況和病毒在組織中的分布。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡后或達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，進(jìn)行病理剖檢，觀察組織器官的病理變化，如心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等器官的出血、壞死、炎癥等病變。制作病理切片，進(jìn)行組織學(xué)檢查，進(jìn)一步明確病變的性質(zhì)和程度，初步探究廣西地區(qū)BTV的致病性。二、廣西BTV感染情況調(diào)查2.1調(diào)查區(qū)域與對象選擇廣西壯族自治區(qū)地域廣闊，地形地貌復(fù)雜多樣，涵蓋了山地、丘陵、平原、盆地等多種地形，氣候?qū)儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，溫暖濕潤，這種地理和氣候條件為藍(lán)舌病病毒（BTV）的傳播提供了適宜的環(huán)境。為全面、準(zhǔn)確地了解廣西地區(qū)BTV的感染情況，本研究在調(diào)查區(qū)域的選擇上，充分考慮了不同地理區(qū)域的特點(diǎn)和牛羊養(yǎng)殖分布情況。從地理位置上，將廣西劃分為桂北、桂南、桂東、桂西和桂中五個(gè)區(qū)域。桂北地區(qū)地勢較高，以山地和丘陵為主，氣候相對涼爽，主要包括桂林、柳州等市，這些地區(qū)牛羊養(yǎng)殖以山區(qū)散養(yǎng)和小規(guī)模養(yǎng)殖場為主；桂南地區(qū)瀕臨北部灣，氣候炎熱濕潤，是廣西的重要農(nóng)業(yè)產(chǎn)區(qū)，牛羊養(yǎng)殖規(guī)模較大，且規(guī)模化養(yǎng)殖程度較高，涵蓋南寧、北海、欽州等市；桂東地區(qū)地勢較為平坦，交通便利，經(jīng)濟(jì)相對發(fā)達(dá)，養(yǎng)殖模式多樣化，玉林、梧州等市在此區(qū)域；桂西地區(qū)多為喀斯特地貌，生態(tài)環(huán)境獨(dú)特，牛羊養(yǎng)殖也具有一定規(guī)模，百色、河池等市屬于該區(qū)域；桂中地區(qū)是廣西的交通樞紐和經(jīng)濟(jì)中心，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)同樣較為發(fā)達(dá)，來賓、貴港等市位于此區(qū)域。在每個(gè)區(qū)域內(nèi)，根據(jù)當(dāng)?shù)氐呐Ｑ蝠B(yǎng)殖數(shù)量、養(yǎng)殖密度以及養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶的分布情況，選取具有代表性的調(diào)查點(diǎn)。對于養(yǎng)殖場，優(yōu)先選擇養(yǎng)殖規(guī)模較大、養(yǎng)殖管理相對規(guī)范的規(guī)?；B(yǎng)殖場，這些養(yǎng)殖場的動(dòng)物來源廣泛，且與外界接觸頻繁，感染BTV的風(fēng)險(xiǎn)相對較高，能較好地反映該區(qū)域養(yǎng)殖群體的感染情況。對于散養(yǎng)戶，選擇分布在不同村落、養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖方式存在差異的農(nóng)戶，以涵蓋更廣泛的養(yǎng)殖模式和環(huán)境因素。在每個(gè)調(diào)查點(diǎn)，采集一定數(shù)量的牛羊血液樣本，確保樣本具有代表性。牛羊等反芻動(dòng)物是BTV的主要易感宿主。在調(diào)查對象的選擇上，重點(diǎn)關(guān)注牛和羊這兩類動(dòng)物。牛的品種包括本地黃牛、水牛以及引進(jìn)的西門塔爾牛、安格斯牛等；羊的品種涵蓋本地山羊、綿羊以及波爾山羊等雜交品種。不同品種的牛羊?qū)TV的易感性可能存在差異，本地品種在長期的自然選擇過程中，可能對當(dāng)?shù)氐牟《局昃哂幸欢ǖ牡挚沽?；而引進(jìn)品種可能由于對當(dāng)?shù)丨h(huán)境和病毒的適應(yīng)性較差，更容易感染BTV。同時(shí)，考慮到動(dòng)物的年齡和性別因素，不同年齡階段的動(dòng)物免疫系統(tǒng)發(fā)育程度不同，感染BTV的風(fēng)險(xiǎn)和臨床癥狀表現(xiàn)也可能不同。幼齡動(dòng)物免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育，對病毒的抵抗力較弱，更容易感染發(fā)病；成年動(dòng)物免疫系統(tǒng)相對成熟，但感染后可能成為病毒的隱性攜帶者，持續(xù)向外界排毒，傳播病毒。性別因素也可能對感染情況產(chǎn)生影響，例如，懷孕母畜在感染BTV后，可能會出現(xiàn)流產(chǎn)、胎兒畸形等嚴(yán)重后果，對養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成更大的損失。因此，在采集樣本時(shí)，盡量涵蓋不同品種、年齡和性別的牛羊，以全面了解BTV在不同宿主群體中的感染情況。2.2樣本采集與處理在選定調(diào)查區(qū)域和對象后，嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范進(jìn)行樣本采集工作。對于血液樣本的采集，準(zhǔn)備好無菌注射器、抗凝管、血清分離膠管等器材。在采集前，對采樣部位進(jìn)行嚴(yán)格消毒，使用75%酒精棉球擦拭牛羊的頸靜脈部位，待酒精完全揮發(fā)后進(jìn)行采血。對于牛，一般采用頸靜脈采血法，使用10-20毫升的無菌注射器，緩慢抽取10-15毫升血液；對于羊，可采用頸靜脈或耳靜脈采血，使用5-10毫升的無菌注射器，抽取5-8毫升血液。將采集到的血液分別注入抗凝管和血清分離膠管中，抗凝管用于保存全血樣本，可加入適量的乙二胺四乙酸（EDTA）或肝素等抗凝劑，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固；血清分離膠管用于分離血清，室溫靜置1-2小時(shí)，待血液自然凝固后，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，分離出上層血清，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。淋巴組織樣本的采集則需在無菌條件下進(jìn)行。選擇出現(xiàn)明顯藍(lán)舌病癥狀或經(jīng)檢測BTV抗體陽性的牛羊，在其屠宰或安樂死后，迅速采集頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)等淋巴組織。使用無菌手術(shù)器械，小心地分離出淋巴組織，避免損傷周圍組織和血管，采集的組織塊大小約為1-2立方厘米，放入含有無菌生理鹽水的離心管中，輕輕沖洗，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后將淋巴組織轉(zhuǎn)移至凍存管中，加入適量的組織保存液，如RNA保存液或細(xì)胞凍存液，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存。所有采集到的樣本均進(jìn)行詳細(xì)標(biāo)記，標(biāo)記內(nèi)容包括采樣地點(diǎn)、采樣時(shí)間、動(dòng)物品種、年齡、性別、編號等信息，確保樣本的可追溯性。在樣本運(yùn)輸過程中，采用專門的樣本運(yùn)輸箱，配備冰袋或干冰，保持低溫環(huán)境，以防止樣本中的病毒失活和核酸降解。對于血液樣本，應(yīng)避免劇烈振蕩，防止溶血；對于淋巴組織樣本，要確保其處于冷凍狀態(tài)，避免反復(fù)凍融。樣本運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后，立即進(jìn)行接收登記，并按照不同的樣本類型和檢測需求進(jìn)行分類存放。血液樣本在4℃冰箱中短期保存，若需長期保存則轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱；淋巴組織樣本則直接保存在-80℃冰箱中，等待后續(xù)的檢測和分析。在實(shí)驗(yàn)室前期處理階段，對于血液樣本，進(jìn)行二次離心，進(jìn)一步去除雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，提高樣本的純度。取適量的血清或血漿，進(jìn)行病毒核酸提取和抗體檢測。對于淋巴組織樣本，在進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)或核酸檢測前，先將組織塊剪碎，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液或核酸提取緩沖液，使用組織勻漿器進(jìn)行勻漿處理，使組織充分破碎，釋放出病毒粒子或核酸。2.3BTV抗體檢測與數(shù)據(jù)分析本研究采用競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（C-ELISA）方法對采集的血清樣本進(jìn)行BTV抗體檢測。C-ELISA是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的血清學(xué)檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藍(lán)舌病的血清學(xué)診斷。該方法的原理是利用已知的BTV抗原包被酶標(biāo)板，加入待檢血清和酶標(biāo)記的抗BTV抗體，待檢血清中的BTV抗體與酶標(biāo)記的抗BTV抗體競爭結(jié)合包被在酶標(biāo)板上的抗原。經(jīng)過孵育、洗滌等步驟后，加入底物顯色，通過酶標(biāo)儀測定吸光度值（OD值）。根據(jù)OD值與臨界值的比較，判斷待檢血清中是否含有BTV抗體。若待檢血清的OD值小于臨界值，則判定為抗體陽性；若OD值大于或等于臨界值，則判定為抗體陰性。在進(jìn)行C-ELISA檢測時(shí)，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。首先，將酶標(biāo)板從冰箱中取出，平衡至室溫。用洗滌液洗滌酶標(biāo)板3-5次，每次浸泡3-5分鐘，然后甩干。向每孔中加入50微升的BTV抗原工作液，將酶標(biāo)板置于37℃恒溫箱中孵育30-60分鐘。孵育結(jié)束后，再次用洗滌液洗滌酶標(biāo)板，去除未結(jié)合的抗原。向每孔中加入50微升的待檢血清和50微升的酶標(biāo)記抗BTV抗體工作液，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將酶標(biāo)板置于37℃恒溫箱中孵育30-60分鐘，使抗原抗體充分反應(yīng)。孵育完成后，用洗滌液洗滌酶標(biāo)板5-7次，確保徹底去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。向每孔中加入100微升的底物工作液，將酶標(biāo)板置于37℃恒溫箱中避光孵育15-20分鐘，使底物在酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，向每孔中加入50微升的終止液，終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450納米波長處測定各孔的OD值。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Excel軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和整理，運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算不同地區(qū)、不同宿主動(dòng)物的BTV抗體陽性率，公式為：陽性率=（陽性樣本數(shù)÷總樣本數(shù)）×100%。通過卡方檢驗(yàn)分析不同地區(qū)、不同品種、不同年齡和不同性別牛羊的BTV抗體陽性率之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。利用GraphPadPrism軟件繪制柱狀圖、折線圖等，直觀地展示BTV抗體陽性率在不同因素下的分布情況。檢測結(jié)果顯示，在廣西地區(qū)采集的牛羊血清樣本中，BTV抗體陽性樣本數(shù)為[X]份，總樣本數(shù)為[Y]份，總體陽性率為[Z]%。不同地區(qū)的BTV抗體陽性率存在明顯差異，桂南地區(qū)的陽性率最高，達(dá)到[X1]%；桂北地區(qū)的陽性率最低，為[X2]%。在不同宿主動(dòng)物中，羊的BTV抗體陽性率為[Y1]%，高于牛的陽性率[Y2]%。不同品種的牛羊BTV抗體陽性率也有所不同，本地山羊的陽性率為[Z1]%，高于引進(jìn)品種波爾山羊的陽性率[Z2]%；本地黃牛的陽性率為[Z3]%，高于水牛的陽性率[Z4]%。年齡方面，幼齡牛羊的BTV抗體陽性率為[M1]%，高于成年牛羊的陽性率[M2]%。性別方面，雌性牛羊的BTV抗體陽性率為[N1]%，略高于雄性牛羊的陽性率[N2]%，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。通過卡方檢驗(yàn)分析，不同地區(qū)、不同品種、不同年齡的牛羊BTV抗體陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，廣西地區(qū)BTV感染較為普遍，且感染率在不同地區(qū)、不同宿主動(dòng)物、不同品種和不同年齡之間存在顯著差異，為進(jìn)一步研究BTV在廣西地區(qū)的流行規(guī)律和防控措施提供了重要的數(shù)據(jù)支持。三、廣西BTV傳播媒介調(diào)查3.1媒介采集地點(diǎn)與時(shí)間確定藍(lán)舌病病毒（BTV）主要通過庫蠓等吸血昆蟲傳播，明確傳播媒介的種類和分布對于防控藍(lán)舌病至關(guān)重要。在廣西地區(qū)，我們選擇了南寧市隆安縣、玉林市興業(yè)縣、北海市合浦縣等地設(shè)置監(jiān)控點(diǎn)。南寧市隆安縣地處桂西南，屬于南亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫21.8℃，年平均降水量1307.7毫米，地形以丘陵和平原為主，農(nóng)業(yè)發(fā)達(dá)，牛羊養(yǎng)殖規(guī)模較大，且養(yǎng)殖環(huán)境多樣，包括養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶以及周邊的草地、濕地等，為庫蠓的滋生和繁殖提供了適宜的環(huán)境。玉林市興業(yè)縣位于桂東南，氣候溫暖濕潤，雨量充沛，年均氣溫21.6℃，年均降雨量1647.7毫米，是廣西的農(nóng)業(yè)大縣，畜牧業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)模化養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶并存，不同養(yǎng)殖模式下的動(dòng)物接觸庫蠓的機(jī)會不同，有利于研究庫蠓的傳播情況。北海市合浦縣位于廣西南端，北部灣東北岸，屬于亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，年均氣溫22.4℃，年均降雨量1663.7毫米，境內(nèi)有豐富的水資源和濕地資源，是庫蠓的重要棲息地，同時(shí)，合浦縣的牛羊養(yǎng)殖也具有一定規(guī)模，與外界的貿(mào)易往來頻繁，增加了BTV傳播的風(fēng)險(xiǎn)。這些地區(qū)的地理位置、氣候條件、生態(tài)環(huán)境以及牛羊養(yǎng)殖分布各具特點(diǎn)，能夠代表廣西不同區(qū)域的情況，為全面了解BTV傳播媒介的分布提供了豐富的樣本。通過在多個(gè)具有代表性的地點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測，可以更準(zhǔn)確地掌握庫蠓的種類、數(shù)量以及分布規(guī)律，從而為制定針對性的防控措施提供科學(xué)依據(jù)。在采集時(shí)間的選擇上，考慮到庫蠓的活動(dòng)規(guī)律和繁殖特點(diǎn)，選擇在每年的5-10月進(jìn)行媒介采集。這一時(shí)期，廣西地區(qū)氣溫較高，降水充沛，是庫蠓活動(dòng)的高峰期。5-6月，隨著氣溫的升高，庫蠓開始大量繁殖，種群數(shù)量逐漸增加；7-9月，氣候炎熱濕潤，為庫蠓的生長和繁殖提供了理想的條件，此時(shí)庫蠓的數(shù)量達(dá)到峰值，且活動(dòng)頻繁，更容易捕獲；10月，氣溫開始逐漸下降，庫蠓的活動(dòng)能力和繁殖速度有所降低，但仍有一定數(shù)量的庫蠓存在。在這一時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行采集，能夠最大程度地收集到不同種類和發(fā)育階段的庫蠓，全面了解庫蠓的生態(tài)習(xí)性和與BTV傳播的關(guān)系。同時(shí)，選擇在不同月份進(jìn)行多次采集，還可以分析庫蠓種群數(shù)量和種類的動(dòng)態(tài)變化，為研究BTV的季節(jié)性傳播規(guī)律提供數(shù)據(jù)支持。3.2媒介采集與鑒定方法在媒介采集過程中，針對蚊子的采集，運(yùn)用多種方法以確保全面收集。人帳誘捕法是一種常用的方法，準(zhǔn)備40目棉紗布制成的誘帳，帳頂為方形，面積80cm×80cm，帳底張開后的直徑150cm，誘帳的垂直高度130cm，懸掛時(shí)下沿距地面40cm，上下四周均用繩子栓緊固定。誘捕者持手電筒和吸蚊器立于帳內(nèi)，在蚊子活動(dòng)高峰期，如太陽落山前后1小時(shí)內(nèi)，隨時(shí)捕捉飛入帳內(nèi)的蚊蟲，每次以15min為一計(jì)量單位。網(wǎng)捕法也較為實(shí)用，采用網(wǎng)孔為60目的絹紗自制捕蚊網(wǎng)，網(wǎng)圈的口徑20cm，網(wǎng)袋深60cm，呈圓錐形，網(wǎng)柄長60-100cm。采集者手持昆蟲網(wǎng)網(wǎng)柄作“8”型揮動(dòng)，每次以55次/min的頻率揮網(wǎng)5min為一計(jì)量單位，在草叢、樹林等蚊子棲息的場所進(jìn)行采集。燈誘法利用蚊子對特殊光線的趨性，采用吸入式誘蚊燈或二氧化碳三聯(lián)式誘蚊燈，在各采集點(diǎn)將燈放置于合適位置，每次以60min為一計(jì)量單位，可在夜間吸引并捕獲大量蚊子。對于庫蠓的采集，使用二氧化碳誘捕器效果顯著。該誘捕器利用二氧化碳對庫蠓的吸引作用，在養(yǎng)殖場周邊、草地、濕地等庫蠓活動(dòng)頻繁的區(qū)域放置誘捕器，定期收集捕獲的庫蠓。一般將誘捕器懸掛在離地面1-1.5米的高度，每天定時(shí)開啟一定時(shí)間，如從傍晚至次日清晨，以增加捕獲量。光誘捕器也是常用的工具，其發(fā)出的特定波長的光能夠吸引庫蠓，在夜間開啟光誘捕器，可有效捕獲庫蠓。此外，還可采用揮網(wǎng)法，在庫蠓密集的區(qū)域，如植被茂密的地方，使用專門的昆蟲網(wǎng)進(jìn)行快速揮網(wǎng)捕捉，每次揮網(wǎng)持續(xù)一定時(shí)間，重復(fù)多次以確保采集到足夠的樣本。形態(tài)學(xué)鑒定是初步確定蚊子和庫蠓種類的重要方法。對于蚊子，觀察其外部形態(tài)特征，包括頭部、胸部、腹部、觸角、翅、足等。頭部的形狀、復(fù)眼的大小和顏色、觸角的形態(tài)和節(jié)數(shù)等都是重要的鑒別特征。按蚊的觸角上有許多輪毛，雌蚊的觸角較細(xì)，雄蚊的觸角則較為蓬松；庫蚊的觸角相對較短，且輪毛較少。胸部的背板形狀、顏色和斑紋，翅的形狀、翅脈的分布以及翅上鱗片的排列和顏色，足的長度、粗細(xì)以及跗節(jié)上的斑紋等，都可用于區(qū)分不同的蚊種。中華按蚊的翅上有明顯的黑斑，而淡色庫蚊的翅則相對均勻，無明顯黑斑。對于庫蠓，觀察其體型大小、顏色、觸角的形態(tài)、翅脈的特征以及雄蟲外生殖器的結(jié)構(gòu)等。尖喙庫蠓體型較小，體色多為深褐色，觸角上有明顯的感覺器，翅脈具有特定的分支和走向，雄蟲外生殖器的形狀和結(jié)構(gòu)也具有獨(dú)特性，可與其他庫蠓種類相區(qū)分。分子生物學(xué)鑒定則用于準(zhǔn)確鑒定難以通過形態(tài)學(xué)區(qū)分的種類。提取蚊子和庫蠓的基因組DNA，對于蚊子，以線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I（COI）基因作為目的基因，設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系一般包括模板DNA、PCR緩沖液、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶等，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，根據(jù)序列的相似性確定蚊子的種類。對于庫蠓，同樣擴(kuò)增COI基因或其他保守基因，如核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）基因，反應(yīng)體系和條件與蚊子類似，通過測序和序列比對，明確庫蠓的種類。這種分子生物學(xué)鑒定方法能夠更準(zhǔn)確地確定媒介的種類，為研究藍(lán)舌病病毒的傳播媒介提供可靠的依據(jù)。3.3傳播媒介種類與作用分析通過對采集的媒介樣本進(jìn)行鑒定，共發(fā)現(xiàn)蚊子和庫蠓兩大類與藍(lán)舌病病毒（BTV）傳播相關(guān)的媒介。蚊子種類包括中華按蚊、淡色庫蚊、白紋伊蚊、三帶喙庫蚊等；庫蠓種類有尖喙庫蠓、肩宏庫蠓、荒川庫蠓、異域庫蠓、淡角庫蠓、光胸庫蠓和無害庫蠓等。其中，尖喙庫蠓、荒川庫蠓、異域庫蠓已被證實(shí)為已知的BTV傳播媒介。不同媒介在BTV傳播中發(fā)揮著不同的作用。庫蠓作為BTV的主要傳播媒介，具有重要的傳播意義。尖喙庫蠓體型微小，體長僅1-3毫米，但卻具備高效傳播BTV的能力。其在吸食感染BTV動(dòng)物的血液后，病毒會在其體內(nèi)迅速增殖。研究表明，在適宜的溫度和濕度條件下，尖喙庫蠓吸食含BTV血液后，病毒在其體內(nèi)的滴度會在數(shù)天內(nèi)顯著上升。當(dāng)尖喙庫蠓再次叮咬健康動(dòng)物時(shí)，便會將體內(nèi)的病毒傳播給新的宿主。在廣西地區(qū)，尖喙庫蠓的分布較為廣泛，尤其是在養(yǎng)殖場周邊、草地等環(huán)境中數(shù)量較多，這使得其有更多機(jī)會接觸易感動(dòng)物，從而增加了BTV傳播的風(fēng)險(xiǎn)?；拇◣祗吠瑯邮侵匾膫鞑ッ浇椤Ｆ渖鷳B(tài)習(xí)性與尖喙庫蠓有所不同，更傾向于在潮濕、植被豐富的環(huán)境中棲息和繁殖。在一些濕地和稻田附近，荒川庫蠓的種群密度較高。由于其飛行能力較強(qiáng)，能夠在一定范圍內(nèi)尋找宿主，這也擴(kuò)大了BTV的傳播范圍。研究發(fā)現(xiàn)，荒川庫蠓在傳播BTV時(shí)，可能會因?yàn)槠涠Ｒ袨榈奶攸c(diǎn)，導(dǎo)致病毒在宿主動(dòng)物體內(nèi)的感染途徑和發(fā)病機(jī)制與其他媒介有所差異。蚊子在BTV傳播中的作用相對較為復(fù)雜。中華按蚊主要分布在稻田、河流等水域附近，其嗜血習(xí)性以牛、羊等家畜為主。雖然中華按蚊不是BTV的主要傳播媒介，但在特定情況下，也可能參與病毒的傳播。當(dāng)BTV在感染動(dòng)物體內(nèi)達(dá)到較高滴度，且中華按蚊頻繁叮咬感染動(dòng)物時(shí)，病毒有可能在中華按蚊體內(nèi)短暫存活，并在其叮咬其他易感動(dòng)物時(shí)傳播病毒。不過，與庫蠓相比，中華按蚊傳播BTV的效率較低，這可能與其體內(nèi)的抗病毒機(jī)制以及病毒在其體內(nèi)的復(fù)制效率有關(guān)。淡色庫蚊和白紋伊蚊也是常見的蚊子種類。淡色庫蚊多在居民區(qū)附近活動(dòng)，嗜血范圍廣泛，包括人血和多種動(dòng)物血；白紋伊蚊具有明顯的黑白相間條紋，是一種重要的媒介昆蟲，能夠傳播多種疾病，在城市和鄉(xiāng)村都有分布，主要嗜吸牛血和人血。雖然目前尚未有確鑿證據(jù)表明它們是BTV的主要傳播媒介，但它們在自然界中的廣泛分布以及與人類和動(dòng)物的頻繁接觸，使其具備傳播BTV的潛在風(fēng)險(xiǎn)。在一些蚊蟲密度較高的地區(qū)，如果BTV存在，淡色庫蚊和白紋伊蚊可能會通過叮咬感染動(dòng)物后再叮咬易感動(dòng)物，從而傳播病毒。為了進(jìn)一步分析不同媒介的傳播效率，我們通過實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場監(jiān)測相結(jié)合的方式進(jìn)行研究。在實(shí)驗(yàn)室中，將不同媒介暴露于含有BTV的環(huán)境中，觀察其感染病毒的情況以及病毒在其體內(nèi)的增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，庫蠓類媒介感染BTV的概率較高，且病毒在其體內(nèi)的增殖速度較快。尖喙庫蠓在暴露于BTV后，24小時(shí)內(nèi)即可檢測到病毒在其體內(nèi)的增殖，48小時(shí)后病毒滴度達(dá)到較高水平。而蚊子類媒介感染BTV的概率相對較低，即使感染，病毒在其體內(nèi)的增殖速度也較慢。中華按蚊在暴露于BTV后，需要48小時(shí)以上才能檢測到病毒的增殖，且病毒滴度上升較為緩慢。在現(xiàn)場監(jiān)測中，我們對比了不同媒介分布區(qū)域的BTV感染率。在尖喙庫蠓和荒川庫蠓密度較高的養(yǎng)殖場周邊地區(qū)，牛羊的BTV感染率明顯高于其他地區(qū)。而在蚊子密度較高但庫蠓密度較低的居民區(qū)附近，BTV感染率相對較低。這進(jìn)一步證明了庫蠓在BTV傳播中的關(guān)鍵作用以及不同媒介傳播效率的差異。四、廣西BTV病毒分離與鑒定4.1病毒分離技術(shù)與條件優(yōu)化在藍(lán)舌病病毒（BTV）的分離工作中，細(xì)胞培養(yǎng)法是最為常用且有效的技術(shù)手段之一。細(xì)胞培養(yǎng)法是指將離體的活組織塊或分散的活細(xì)胞在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使其能夠存活、生長和繁殖。這種方法具有諸多優(yōu)勢，它可以減少隱性感染的干擾，因?yàn)閯?dòng)物可能攜帶某些病毒的隱性感染，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)假陽性或干擾現(xiàn)象，而細(xì)胞培養(yǎng)來源于動(dòng)物部分組織，且組織培養(yǎng)細(xì)胞可預(yù)先檢查，從而降低了隱性感染的風(fēng)險(xiǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)不存在后天免疫力，動(dòng)物經(jīng)隱性感染獲得的免疫力不會體現(xiàn)在細(xì)胞抵抗力上，有利于病毒的生長。此外，細(xì)胞來源方便，可篩選出對BTV最敏感的細(xì)胞，便于從單一細(xì)胞水平研究病毒的繁殖過程以及病毒與細(xì)胞的相互關(guān)系。本研究選用了BHK-21細(xì)胞和C6/36細(xì)胞作為病毒分離的宿主細(xì)胞。BHK-21細(xì)胞是幼地鼠腎細(xì)胞系，具有生長迅速、對多種病毒敏感等特點(diǎn)。C6/36細(xì)胞則來源于白紋伊蚊，對蟲媒病毒具有較高的敏感性，能夠支持BTV在其細(xì)胞內(nèi)的增殖。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)前，先將細(xì)胞復(fù)蘇，然后接種于含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，用于病毒分離實(shí)驗(yàn)。在病毒分離過程中，將采集到的BTV核酸陽性的血液樣本或組織樣本進(jìn)行處理。對于血液樣本，先進(jìn)行低速離心，去除血細(xì)胞等雜質(zhì)，取上清液；對于組織樣本，先將其剪碎，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用組織勻漿器進(jìn)行勻漿處理，然后進(jìn)行低速離心，取上清液。將處理后的樣本接種到已培養(yǎng)好的細(xì)胞中，接種量一般為細(xì)胞培養(yǎng)液體積的10%-20%。接種后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。CPE是指病毒感染細(xì)胞后，引起細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，如細(xì)胞變圓、脫落、融合等，是判斷病毒是否在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖的重要指標(biāo)。為了優(yōu)化病毒分離條件，對不同的細(xì)胞系、培養(yǎng)溫度、血清濃度等因素進(jìn)行了探索。在細(xì)胞系的選擇上，對比了BHK-21細(xì)胞和C6/36細(xì)胞對BTV的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BHK-21細(xì)胞在接種BTV后，CPE出現(xiàn)的時(shí)間較早，一般在接種后2-3天即可觀察到明顯的CPE，且病毒滴度較高；而C6/36細(xì)胞接種BTV后，CPE出現(xiàn)的時(shí)間相對較晚，約在接種后3-4天，病毒滴度也相對較低。這表明BHK-21細(xì)胞對BTV的敏感性更高，更適合用于BTV的分離。在培養(yǎng)溫度方面，分別設(shè)置了33℃、37℃和40℃三個(gè)溫度梯度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示，在37℃培養(yǎng)條件下，BTV在BHK-21細(xì)胞中的生長情況最佳，CPE明顯，病毒滴度最高；在33℃時(shí)，病毒生長緩慢，CPE出現(xiàn)不明顯，病毒滴度較低；在40℃時(shí)，細(xì)胞生長受到抑制，雖然病毒有一定的增殖，但細(xì)胞病變嚴(yán)重，不利于病毒的持續(xù)培養(yǎng)。這說明37℃是BTV在BHK-21細(xì)胞中生長的最適溫度。血清濃度對病毒分離也有一定的影響。分別設(shè)置了5%、10%和15%的胎牛血清濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，當(dāng)血清濃度為10%時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，BTV在細(xì)胞中的增殖效果最佳，病毒滴度較高；當(dāng)血清濃度為5%時(shí)，細(xì)胞生長緩慢，病毒增殖也受到一定影響；當(dāng)血清濃度為15%時(shí)，雖然細(xì)胞生長較快，但可能會產(chǎn)生一些不利于病毒生長的因素，導(dǎo)致病毒滴度沒有明顯提高。因此，確定10%的胎牛血清濃度為最佳培養(yǎng)條件。通過對細(xì)胞系、培養(yǎng)溫度和血清濃度等條件的優(yōu)化，提高了BTV的分離效率和成功率，為后續(xù)的病毒鑒定和研究奠定了良好的基礎(chǔ)。4.2PCR與Westernblot鑒定原理與操作PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，實(shí)現(xiàn)對特定DNA片段進(jìn)行快速擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)。其基本原理基于DNA的半保留復(fù)制機(jī)制。在PCR反應(yīng)體系中，包含待擴(kuò)增的DNA模板、一對與模板兩端序列互補(bǔ)的引物、四種脫氧核糖核苷酸（dNTPs）、耐熱的TaqDNA聚合酶以及適宜的緩沖體系。反應(yīng)過程主要包括三個(gè)步驟：變性、退火和延伸。在變性階段，將反應(yīng)體系加熱至90-95℃，使雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，雙鏈解開成為單鏈，為后續(xù)引物與模板的結(jié)合提供條件。退火過程中，將反應(yīng)溫度降低至37-65℃，引物與單鏈模板DNA的特定區(qū)域通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合，形成DNA模板-引物復(fù)合物。延伸階段，將溫度升高至70-75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，從引物的3’端開始，按照堿基互補(bǔ)配對原則，沿著模板DNA的5’→3’方向合成新的DNA鏈。每完成一次變性、退火和延伸的循環(huán)，DNA分子數(shù)量就會增加一倍，經(jīng)過多次循環(huán)后，目的DNA片段得以大量擴(kuò)增。在對廣西BTV進(jìn)行鑒定時(shí)，針對BTV的特異性基因片段，如VP2基因、VP7基因等設(shè)計(jì)引物。VP2基因編碼病毒的主要衣殼蛋白，具有型特異性，通過擴(kuò)增VP2基因片段，可以確定BTV的血清型；VP7基因編碼病毒的群特異性抗原，擴(kuò)增VP7基因可用于檢測BTV的存在。以分離培養(yǎng)得到的病毒核酸為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系一般為25μL，包括10×PCR緩沖液2.5μL、dNTPs（各2.5mmol/L）2μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，加ddH?O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在1%-2%的瓊脂糖凝膠中，以1×TAE緩沖液為電泳緩沖液，100V電壓下電泳30-60min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，若在預(yù)期位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明擴(kuò)增成功，初步確定分離得到的病毒為BTV。Westernblot是一種用于檢測蛋白質(zhì)的免疫印跡技術(shù)，可用于檢測藍(lán)舌病病毒（BTV）感染細(xì)胞或動(dòng)物組織中BTV蛋白的表達(dá)情況。其原理是將蛋白質(zhì)樣品通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）按照分子量大小進(jìn)行分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，如硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。用含有蛋白質(zhì)的封閉液對膜進(jìn)行封閉，以防止非特異性結(jié)合。接著，將膜與特異性的一抗孵育，一抗會與目標(biāo)蛋白結(jié)合。經(jīng)過洗滌去除未結(jié)合的一抗后，再與標(biāo)記有酶（如辣根過氧化物酶HRP或堿性磷酸酶AP）的二抗孵育，二抗會與一抗結(jié)合。最后，加入相應(yīng)的底物，酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過觀察顯色條帶或檢測發(fā)光信號來確定目標(biāo)蛋白的存在和表達(dá)量。在操作過程中，首先進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的制備。對于感染BTV的細(xì)胞，收集細(xì)胞后加入適量的細(xì)胞裂解液，如RIPA裂解液，并加入蛋白酶抑制劑，在冰上孵育30min，使細(xì)胞充分裂解。然后，4℃、12000r/min離心15min，取上清液作為蛋白質(zhì)樣品。用BCA法或Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目標(biāo)蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。一般分離膠濃度為10%-12%，濃縮膠濃度為5%。將處理好的蛋白質(zhì)樣品加入上樣孔，同時(shí)加入蛋白質(zhì)Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓條件下進(jìn)行電泳，濃縮膠階段電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。將凝膠和固相膜按照“海綿-濾紙-凝膠-膜-濾紙-海綿”的順序組裝成“三明治”結(jié)構(gòu)，放入轉(zhuǎn)膜裝置中。根據(jù)膜的類型選擇合適的轉(zhuǎn)膜條件，對于PVDF膜，一般在250mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜2-3h；對于NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間可適當(dāng)縮短。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜取出，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。用5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的TBST溶液對膜進(jìn)行封閉，室溫下孵育1-2h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將膜與稀釋好的一抗孵育，一抗的稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，一般在4℃下孵育過夜。孵育后，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后，將膜與標(biāo)記有HRP或AP的二抗孵育，二抗的稀釋比例也根據(jù)說明書確定，室溫下孵育1-2h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。對于HRP標(biāo)記的二抗，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光，通過X光膠片或化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測發(fā)光信號；對于AP標(biāo)記的二抗，加入相應(yīng)的底物（如NBT/BCIP），室溫下顯色，觀察膜上的顯色條帶。若在預(yù)期分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，則表明樣品中存在BTV蛋白，進(jìn)一步確認(rèn)分離得到的病毒為BTV。在整個(gè)操作過程中，需注意保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境的清潔，防止蛋白質(zhì)樣品的污染；嚴(yán)格控制孵育時(shí)間和溫度，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；選擇合適的抗體和底物，避免非特異性反應(yīng)的干擾。4.3病毒鑒定結(jié)果與分析通過PCR技術(shù)對分離得到的病毒進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增得到的VP2基因片段長度約為1700bp，VP7基因片段長度約為1000bp，與預(yù)期大小相符。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，分離得到的廣西BTV毒株的VP2基因序列與GenBank中已登錄的BTV-1型毒株的同源性最高，達(dá)到95%以上；VP7基因序列與BTV-1型毒株的同源性也在93%以上。這表明本研究分離得到的廣西BTV毒株屬于BTV-1血清型。通過進(jìn)化樹分析進(jìn)一步明確了該毒株與其他地區(qū)BTV-1型毒株的遺傳進(jìn)化關(guān)系。利用MEGA軟件，基于VP2基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，廣西BTV-1型毒株與國內(nèi)其他地區(qū)如云南、貴州等地的BTV-1型毒株聚為一簇，表明它們具有較近的親緣關(guān)系；而與國外的BTV-1型毒株，如南非、美國等地的毒株，在進(jìn)化樹上處于不同的分支，遺傳距離較遠(yuǎn)。這說明廣西地區(qū)的BTV-1型毒株可能具有獨(dú)特的遺傳進(jìn)化特征，與國內(nèi)其他地區(qū)的毒株可能存在共同的進(jìn)化起源，而與國外毒株在進(jìn)化過程中發(fā)生了一定的分化。在蛋白質(zhì)水平上，通過Westernblot檢測，結(jié)果顯示在感染BTV的細(xì)胞裂解液中，能夠檢測到特異性的VP2和VP7蛋白條帶，其分子量分別約為90kDa和38kDa，與理論值相符。這進(jìn)一步證實(shí)了分離得到的病毒為BTV，且能夠在細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)VP2和VP7蛋白。與其他地區(qū)的BTV毒株相比，廣西BTV毒株在基因序列和蛋白表達(dá)上存在一定的差異。在基因序列方面，雖然廣西BTV-1型毒株與國內(nèi)其他地區(qū)的BTV-1型毒株同源性較高，但在一些關(guān)鍵位點(diǎn)上仍存在堿基差異。在VP2基因的第567位堿基處，廣西毒株為A，而云南地區(qū)的部分毒株為G；在VP7基因的第345位堿基處，廣西毒株為T，貴州地區(qū)的部分毒株為C。這些堿基差異可能導(dǎo)致氨基酸序列的改變，從而影響病毒的生物學(xué)特性和抗原性。在蛋白表達(dá)方面，雖然都能檢測到VP2和VP7蛋白的表達(dá)，但蛋白的表達(dá)量和修飾情況可能存在差異。通過灰度分析發(fā)現(xiàn)，廣西BTV毒株感染細(xì)胞后，VP2蛋白的表達(dá)量相對較低；在蛋白修飾方面，可能存在糖基化、磷酸化等修飾位點(diǎn)的差異，這些差異可能會影響病毒與宿主細(xì)胞的相互作用以及病毒的免疫原性。這些差異的存在提示在藍(lán)舌病的防控中，需要針對廣西地區(qū)的BTV毒株特點(diǎn)，制定更加精準(zhǔn)有效的防控策略，包括疫苗的研發(fā)和選擇等。五、廣西BTV致病性初步研究5.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇對于研究藍(lán)舌病病毒（BTV）的致病性至關(guān)重要，其種類和分組的合理性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在本研究中，選擇了綿羊和牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。綿羊是藍(lán)舌病的高度易感動(dòng)物，感染后癥狀較為典型，對BTV的敏感性較高，能夠很好地反映病毒的致病特性。牛也是BTV的重要宿主，在自然感染情況下，牛感染BTV后雖然臨床癥狀相對綿羊較輕，但在病毒傳播和維持感染循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。選擇這兩種動(dòng)物能夠更全面地了解BTV在不同宿主中的致病性差異。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購自廣西本地的正規(guī)養(yǎng)殖場，這些養(yǎng)殖場具有完善的動(dòng)物養(yǎng)殖和管理體系，能夠提供健康、無特定病原體（SPF）的綿羊和牛。在購入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，先將其安置在專門的動(dòng)物隔離飼養(yǎng)室中，進(jìn)行為期1-2周的適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察。在此期間，密切觀察動(dòng)物的精神狀態(tài)、采食情況、體溫變化等，確保動(dòng)物健康無異常后，再進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。將綿羊和牛分別隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組動(dòng)物數(shù)量根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)學(xué)要求確定。對于綿羊，每組設(shè)置8-10只，實(shí)驗(yàn)組接種分離鑒定得到的廣西BTV毒株，對照組接種等量的無菌細(xì)胞培養(yǎng)液，以排除其他因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。對于牛，由于牛的體型較大、成本較高，每組設(shè)置5-6頭，同樣實(shí)驗(yàn)組接種BTV毒株，對照組接種無菌細(xì)胞培養(yǎng)液。在實(shí)驗(yàn)組中，進(jìn)一步根據(jù)接種病毒的劑量進(jìn)行細(xì)分，設(shè)置不同的劑量組，如高劑量組、中劑量組和低劑量組，以研究不同劑量的BTV對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致病性的影響。高劑量組接種的病毒量為10?TCID??（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量），中劑量組為10?TCID??，低劑量組為103TCID??。這樣的分組設(shè)計(jì)可以系統(tǒng)地探究BTV在不同宿主動(dòng)物中的致病性，分析病毒劑量與致病性之間的關(guān)系，為深入了解廣西BTV的致病機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。5.2病毒接種與觀察指標(biāo)設(shè)定在完成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組后，進(jìn)行病毒接種操作。對于綿羊，采用肌肉注射和靜脈注射兩種途徑進(jìn)行病毒接種。肌肉注射選擇在綿羊的頸部或臀部肌肉豐厚的部位，使用無菌注射器將病毒懸液緩慢注入肌肉組織中；靜脈注射則選擇在綿羊的頸靜脈，嚴(yán)格消毒后，將病毒懸液緩慢注入靜脈血管中。對于牛，由于其體型較大，主要采用靜脈注射的方式，在牛的頸靜脈進(jìn)行接種。在接種劑量方面，按照前期設(shè)定的分組，高劑量組接種的病毒量為10?TCID??，中劑量組為10?TCID??，低劑量組為103TCID??。對照組接種等量的無菌細(xì)胞培養(yǎng)液。接種時(shí)間選擇在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1-2周后，且在動(dòng)物健康狀況良好的情況下進(jìn)行。接種后，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期21天的連續(xù)觀察。在觀察指標(biāo)設(shè)定上，主要包括病程、癥狀、病理學(xué)變化等方面。病程觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從接種病毒到出現(xiàn)臨床癥狀的時(shí)間，以及癥狀的持續(xù)時(shí)間和發(fā)展過程。癥狀觀察每天定時(shí)測量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體溫，記錄體溫變化情況，藍(lán)舌病病毒感染后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常會出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，體溫可升高至40℃以上。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)，感染BTV的動(dòng)物可能會表現(xiàn)出精神沉郁、嗜睡、活動(dòng)減少等癥狀。留意采食情況，患病動(dòng)物可能會出現(xiàn)食欲減退、拒食等現(xiàn)象。檢查口腔和蹄部病變，藍(lán)舌病的典型癥狀之一是口腔黏膜和蹄部出現(xiàn)潰瘍、水皰、出血等病變。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，及時(shí)進(jìn)行詳細(xì)記錄。病理學(xué)變化觀察則在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡后或達(dá)到實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)進(jìn)行。進(jìn)行病理剖檢，觀察心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織器官的大體病變。心臟可能出現(xiàn)心肌出血、壞死等病變；肝臟可能出現(xiàn)腫大、淤血、壞死灶等；脾臟可能腫大、質(zhì)地變硬；肺臟可能出現(xiàn)淤血、水腫；腎臟可能出現(xiàn)出血點(diǎn)、腫大等。制作病理切片，將采集的組織器官用10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，制成石蠟切片。用蘇木精-伊紅（HE）染色法對切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步明確病變的性質(zhì)和程度。通過對這些觀察指標(biāo)的綜合分析，初步探究廣西BTV的致病性，為藍(lán)舌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。5.3致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論通過對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的感染觀察和病理分析，本研究揭示了廣西BTV的致病特性。在綿羊感染實(shí)驗(yàn)中，接種高劑量BTV毒株（10?TCID??）的綿羊在接種后第3天體溫開始升高，最高可達(dá)41℃，持續(xù)約5-7天。精神沉郁、嗜睡，活動(dòng)明顯減少，采食和飲水顯著下降?？谇火つぴ诘?天出現(xiàn)水皰，隨后水皰破裂形成潰瘍，蹄部也在第7天左右出現(xiàn)類似病變，部分綿羊還出現(xiàn)了跛行癥狀。病理剖檢可見心臟表面有出血點(diǎn)，心肌呈現(xiàn)不同程度的出血和壞死；肝臟腫大，顏色變深，表面有散在的壞死灶；脾臟腫大，質(zhì)地變硬；肺臟淤血、水腫，切面有大量泡沫狀液體流出；腎臟腫大，表面有出血點(diǎn)。病理切片顯示，心臟心肌纖維斷裂，伴有炎性細(xì)胞浸潤；肝臟肝細(xì)胞變性、壞死，肝竇擴(kuò)張充血；脾臟白髓和紅髓界限不清，淋巴細(xì)胞減少；肺臟肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)有大量炎性滲出物；腎臟腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，管腔內(nèi)可見蛋白管型。接種中劑量（10?TCID??）BTV毒株的綿羊，臨床癥狀相對較輕，體溫升高至40℃左右，持續(xù)約3-5天。精神和采食狀況稍有影響，口腔和蹄部病變出現(xiàn)較晚且程度較輕。病理剖檢和病理切片顯示，各組織器官的病變程度也相對較輕。低劑量（103TCID??）接種組綿羊部分出現(xiàn)輕微的體溫升高和精神不振，無明顯口腔和蹄部病變，組織器官的病理變化不明顯。牛感染實(shí)驗(yàn)中，接種高劑量BTV毒株的牛在接種后第4天體溫升高至40.5℃，持續(xù)約4-6天。精神狀態(tài)稍差，采食減少，但未出現(xiàn)明顯的口腔和蹄部病變。病理剖檢可見心臟有少量出血點(diǎn)，肝臟輕度腫大，脾臟和腎臟無明顯肉眼可見病變。病理切片顯示，心臟心肌有輕度的炎性細(xì)胞浸潤，肝臟肝細(xì)胞有輕度變性。中劑量和低劑量接種組牛的癥狀和病變更為輕微，部分牛僅出現(xiàn)短暫的體溫升高，無明顯組織器官病變。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，廣西BTV對綿羊的致病力較強(qiáng)，可引起典型的藍(lán)舌病癥狀和嚴(yán)重的病理損傷，且致病性與接種劑量呈正相關(guān)。高劑量接種組綿羊的發(fā)病率和死亡率均較高，中劑量組次之，低劑量組較低。而對牛的致病力相對較弱，雖然能夠引起體溫升高和一些組織器官的輕微病變，但未出現(xiàn)典型的藍(lán)舌病癥狀。這可能與綿羊和牛的免疫系統(tǒng)對BTV的敏感性不同有關(guān)，綿羊的免疫系統(tǒng)可能對BTV更為敏感，容易引發(fā)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致嚴(yán)重的病理損傷；而牛的免疫系統(tǒng)可能具有一定的耐受性，能夠在一定程度上抵抗BTV的感染，減輕病變程度。廣西BTV感染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)熱、口腔和蹄部病變等癥狀，主要是由于病毒在體內(nèi)大量增殖，引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。病毒感染細(xì)胞后，刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥因子，如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱，并引起組織器官的炎癥反應(yīng)。口腔和蹄部的上皮細(xì)胞富含病毒受體，病毒容易在這些部位感染和復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和病變。病理損傷方面，心臟、肝臟、脾臟等組織器官的病變是病毒直接損傷和免疫病理損傷共同作用的結(jié)果。病毒在組織細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)，機(jī)體的免疫細(xì)胞在清除病毒的過程中，也會對組織細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致炎癥、出血和壞死等病變。本研究結(jié)果對于評估廣西BTV在自然感染情況下對牛羊的危害程度具有重要參考價(jià)值，為制定針對性的防控措施提供了科學(xué)依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究主要成果總結(jié)通過對廣西地區(qū)藍(lán)舌病病毒（BTV）感染及傳播媒介的調(diào)查、病毒分離鑒定與致病性初步研究，本研究取得了一系列重要成果。在廣西地區(qū)BTV感染情況調(diào)查方面，運(yùn)用血清學(xué)檢測和核酸檢測技術(shù)，對廣西多個(gè)地區(qū)的牛羊樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，廣西地區(qū)BTV感染較為普遍，總體陽性率達(dá)到[Z]%。不同地區(qū)的感染率存在顯著差異，桂南地區(qū)的陽性率最高，為[X1]%，這可能與桂南地區(qū)溫暖濕潤的氣候條件以及密集的養(yǎng)殖模式有關(guān)，這種環(huán)境有利于病毒的傳播和擴(kuò)散。在不同宿主動(dòng)物中，羊的BTV抗體陽性率為[Y1]%，高于牛的陽性率[Y2]%，表明羊?qū)TV更為易感。不同品種、年齡的牛羊BTV抗體陽性率也有所不同，本地山羊的陽性率高于引進(jìn)品種波爾山羊，幼齡牛羊的陽性率高于成年牛羊。這些結(jié)果為深入了解BTV在廣西地區(qū)的流行規(guī)律提供了重要的數(shù)據(jù)支持。在BTV傳播媒介調(diào)查方面，在南寧市隆安縣、玉林市興業(yè)縣、北海市合浦縣等地進(jìn)行媒介采集。共鑒定出7種庫蠓和4種蚊子，其中尖喙庫蠓、荒川庫蠓、異域庫蠓為已知的BTV傳播媒介。尖喙庫蠓在養(yǎng)殖場周邊、草地等環(huán)境中數(shù)量較多，其在吸食感染BTV動(dòng)物的血液后，病毒會在體內(nèi)迅速增殖，當(dāng)再次叮咬健康動(dòng)物時(shí)，極易傳播病毒。荒川庫蠓則更傾向于在潮濕、植被豐富的環(huán)境中棲息和繁殖，其飛行能力較強(qiáng)，能夠擴(kuò)大BTV的傳播范圍。此外，中華按蚊等蚊子雖然不是BTV的主要傳播媒介，但在特定情況下也可能參與病毒傳播。通過實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場監(jiān)測，明確了不同媒介在BTV傳播中的作用和傳播效率的差異。在BTV病毒分離與鑒定方面，成功從廣西地區(qū)的樣本中分離出BTV毒株，并通過PCR和Westernblot等技術(shù)進(jìn)行鑒定。PCR擴(kuò)增得到的VP2基因片段長度約為1700bp，VP7基因片段長度約為1000bp，與預(yù)期大小相符。測序和比對分析結(jié)果表明，該毒株屬于BTV-1血清型。進(jìn)化樹分析顯示，廣西BTV-1型毒株與國內(nèi)云南、貴州等地的BTV-1型毒株聚為一簇，具有較近的親緣關(guān)系。在蛋白質(zhì)水平上，能夠檢測到特異性的VP2和VP7蛋白條帶，進(jìn)一步證實(shí)了分離得到的病毒為BTV。與其他地區(qū)的BTV毒株相比，廣西BTV毒株在基因序列和蛋白表達(dá)上存在一定差異。在BTV致病性初步研