拉曼光譜技術(shù)概述1.1拉曼光譜原理1930年，在印度加爾各答大學(xué)工作的拉曼教授被授予當(dāng)年的諾貝爾物理學(xué)獎，表彰他發(fā)現(xiàn)了光的散射以及以他名字命名的拉曼散射定律。拉曼散射是指當(dāng)一束一定頻率的激光照射到樣品表面時，物質(zhì)中的分子與光子碰撞發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，改變了組成分子的原子團(tuán)振動態(tài)，從而發(fā)射出不同頻率的光的現(xiàn)象。因散射光的頻率只與原子團(tuán)的特性有關(guān)，不同的原子團(tuán)擁有獨(dú)一無二的振動方式，因此產(chǎn)生的光譜又被稱作指紋光譜，可應(yīng)用于物質(zhì)檢測與鑒別。利用拉曼光譜可以將處于紅外區(qū)的分子能譜轉(zhuǎn)移至可見光區(qū)，便利人對其觀測，是人們研究分子結(jié)構(gòu)的得力助手。圖1由圖1我們可以看到，入射光照射到樣品表面后，散射光將分為三個部分：一部分為頻率不變的瑞利散射光，另外兩部分分別為頻率變低與頻率變高的拉曼散射光。1930年，美國光譜學(xué)家.將頻率變低的散射光稱為斯托克斯拉曼散射光，頻率變高的散射光則稱為反斯托克斯拉曼散射光。在激光器出現(xiàn)以前，拉曼散射的強(qiáng)度微弱，僅為瑞利散射強(qiáng)度的千分之一，很難得到完善的光譜并投入實(shí)際應(yīng)用。激光器的出現(xiàn)很好地解決了這個問題，強(qiáng)單色性、方向性及高強(qiáng)度的激光成為了獲得拉曼光譜的理想光源。圖2圖2圖3拉曼作為拉曼散射這一反常散射的發(fā)現(xiàn)者，又身為印度這樣在當(dāng)時較為落后的第三世界國家的科學(xué)家，為科學(xué)做出了巨大貢獻(xiàn)，其發(fā)奮圖強(qiáng)、投身科研的精神令人欽佩。獲得諾貝爾物理學(xué)獎后，拉曼與其他學(xué)者一同創(chuàng)建了印度學(xué)院，為印度國內(nèi)的科技發(fā)展打下基石。基于其發(fā)現(xiàn)的拉曼散射，拉曼光譜這一技術(shù)也不斷在醫(yī)療、化工、文物修復(fù)等諸多領(lǐng)域得到應(yīng)用，推動著這些領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步與發(fā)展。拉曼光譜最大的特點(diǎn)，就是其光譜與入射光的頻率無關(guān)，只與被照射樣品本身的性質(zhì)有關(guān)。這種對應(yīng)關(guān)系使拉曼光譜得以被應(yīng)用于諸多場合的物質(zhì)分析與鑒別。此外，用拉曼光譜對樣品進(jìn)行檢測時，無需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，在檢測過程前中后也不會對樣品造成損壞，這極大地方便了檢測流程，也降低了對拉曼光譜儀本身以外其他檢測所需條件的要求。除了可以對物質(zhì)類別進(jìn)行分析，我們還可以通過對拉曼光譜的強(qiáng)度來分析待檢測物質(zhì)的濃度，這是由于線性拉曼散射過程中拉曼散射的光子數(shù)與被輻射的分子數(shù)量的正比關(guān)系。由此可見，基于拉曼光譜的物質(zhì)檢測與分析在簡便的同時，又可兼顧類別與濃度的分析，可謂面面俱到。將拉曼光譜應(yīng)用于本文所著重關(guān)注的人體皮膚生物組分檢測時，拉曼光譜的另一個特點(diǎn)也浮出水面。人體皮膚作為人體活性組織的一部分，起到保護(hù)、緩沖等重要作用，因而我們希望能在不破壞其生物組織活性的情況下進(jìn)行檢測。我們知道，人體皮膚內(nèi)含有共占人體內(nèi)全部水量20%-30%的水，對人體皮膚做生物組分檢測時，必須考慮水的影響。水的拉曼光譜微弱（如圖4所示），且譜線簡單，幾乎不影響對其他組分的拉曼光譜檢測。水干擾小這一特性也使拉曼光譜成為醫(yī)療領(lǐng)域重要的研究手段。圖圖41.2拉曼光譜技術(shù)面臨的困境與解決辦法在將拉曼光譜實(shí)際應(yīng)用于生物活體檢測時，科學(xué)家們遇到了諸多困難，首當(dāng)其沖的便是容易影響拉曼光譜檢測結(jié)果的熒光效應(yīng)。為了解決這一問題，我們需要一種能有效抑制熒光效應(yīng)、提高信噪比的拉曼光譜技術(shù)。熒光來自于樣品在某些激光照射波長下具有較高的熒光激發(fā)效率時發(fā)射出的背景光，強(qiáng)度約為拉曼散射光的106～108倍，若不加以抑制，將完全覆蓋我們想要通過拉曼光譜檢測技術(shù)得到的信息。常用的物理或化學(xué)抑制熒光法包括使用熒光猝滅劑、光漂白法和表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)。熒光猝滅劑顧名思義，指將一些物質(zhì)加入樣品內(nèi)，通過降低熒光強(qiáng)度或者直接熄滅熒光來達(dá)到抑制熒光的效果。鹵素離子、重金屬離子、硝基化合物和羰基化合物等都是較為有效的猝滅劑。這是一種操作簡便、成本也較為低廉的熒光抑制法，但無法確保猝滅劑的加入會否影響樣品本身的性質(zhì)，本末倒置。光漂白法通過在數(shù)據(jù)記錄開始前先用激光對樣品預(yù)照射進(jìn)行“脫色”，降低數(shù)據(jù)記錄期間被照射表面的熒光效應(yīng)從而達(dá)到提升信噪比的效果。然而這種辦法也可能影響樣品本身，無法確保在“脫色”階段長時間被高能量激光照射的物體不發(fā)生變性。表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)得益于對單分子的發(fā)現(xiàn)，并與吡啶分子在粗糙的銀電極表面能產(chǎn)生很強(qiáng)的拉曼信號這一特性結(jié)合，卻失去了拉曼光譜技術(shù)原有的不需預(yù)處理和不破壞樣品本身的優(yōu)勢。物理或化學(xué)方法都無法很好地解決熒光背景干擾結(jié)果拉曼信號的問題，甚至可能讓拉曼光譜失去自身相較于其他檢測方法的優(yōu)勢。為此，我們需要從根本上對比熒光與拉曼散射光的不同，從而在不放棄拉曼光譜技術(shù)原有優(yōu)勢的情況下實(shí)現(xiàn)對熒光光譜的抑制。拉曼散射光的壽命（皮秒級別）與熒光的壽命（納秒級別）不同，響應(yīng)時間因而存在一定的先后差異。拉曼散射光通常在激光照射到待測物表面的瞬間就發(fā)射出來，而熒光的發(fā)射則慢于拉曼散射光的發(fā)射（如圖5）。圖5利用這一時間差，我們可以設(shè)置一個控件，讓先生成的拉曼散射光通過，而后生成的熒光被阻攔，從而達(dá)到抑制熒光背景的效果?；谶@一原理，克爾門控件與光電倍增管被引入使用?？藸栭T控件運(yùn)用當(dāng)激光照射克爾晶體，使之產(chǎn)生短暫的各向異性從而將線偏振光的偏振方向旋轉(zhuǎn)過90?圖5此外，我們還可以利用拉曼散射光與熒光對高頻入射光響應(yīng)的不同，來對熒光進(jìn)行高頻調(diào)制。基于這個原理的熒光抑制方法包括頻率調(diào)制法和頻率相位歸零法。然而這兩種辦法因高頻調(diào)制與檢測技術(shù)難度較大的緣故，且需要較強(qiáng)的拉曼光信號以覆蓋熒光背景，大多數(shù)時候只適用于熒光壽命足夠長的場合，在泛用性上不占優(yōu)勢。運(yùn)用拉曼光與熒光在波長性質(zhì)上的不同，也可以對熒光進(jìn)行抑制。小范圍內(nèi)，熒光光譜不會隨激發(fā)光頻率的變化產(chǎn)生較大的波動，以波長表示的拉曼光譜則會隨激光頻率的變化發(fā)生改變?；谶@一原理，可以將不同頻率激發(fā)光獲得的光譜進(jìn)行相減，消去熒光光譜的部分，達(dá)到熒光抑制的效果。常用的基于波長性質(zhì)不同熒光抑制法包括移頻激發(fā)法、波長調(diào)制拉曼光譜法和差移拉曼光譜法。移頻激發(fā)法考慮到拉曼光譜對激發(fā)光頻率的位移恒定而在波長方面的相關(guān)性則并不恒定這一特性，用兩組波長相近的激發(fā)光激發(fā)樣品，將得到兩組譜線（包括拉曼光譜譜線與背景光譜），相減后可基本消去背景光譜，再對相差光譜做進(jìn)一步的數(shù)學(xué)處理即可得到真實(shí)的拉曼光譜。這種辦法不僅可以消去不受激發(fā)光頻率的以波長表示的熒光光譜，也可以消去其他多余的系統(tǒng)雜音，很好地提高了拉曼光譜的信噪比。波長調(diào)制拉曼光譜法的基本原理與移頻激發(fā)法相似，不過其用于生成光譜譜線的是一組波長可連續(xù)調(diào)制的多通道激發(fā)光組。這種方法已逐漸成為最簡便易操作的熒光背景消除法。差移拉曼光譜法用可旋轉(zhuǎn)位置的光柵，用檢測單元的改變?nèi)〈ぐl(fā)光頻率的改變，簡化了操作，但得到的圖譜需要經(jīng)過處理才能轉(zhuǎn)化回常規(guī)光譜圖，這是一個可能引入雜音圖譜的過程。熒光與拉曼散射光偏振態(tài)的差異也是可以應(yīng)用于熒光抑制的基本原理。大部分熒光為偏振光，拉曼散射光則為部分偏振光。使用偏振斬波器將光路分為輸入信號與參考信號兩路，經(jīng)過鎖相放大器檢測并區(qū)分出熒光與拉曼散射光，再對被區(qū)分出的熒光進(jìn)行過濾即可。需要注意的是，并不是所有熒光都是偏振光，因此使用此偏振調(diào)制法時需要注意條件。計(jì)算機(jī)處理也是一種較為常用的熒光抑制方法。通常，我們有多項(xiàng)式擬合、小波變換與求導(dǎo)數(shù)法，智能模擬手動去除熒光背景光譜的過程，適用于拉曼信號沒有完全被熒光光譜淹沒的情況。采用近紅外光或紫外光作為激發(fā)光也可以有效地抑制熒光背景。近紅外波段與分子的主吸收區(qū)間并不重合，分子很難吸收光子引起基態(tài)原子躍遷發(fā)出熒光。紫外光作為一種能量較強(qiáng)的光則可能損傷操作人員的身體健康，一般較少用于實(shí)際操作。參考文獻(xiàn)[1]CaspersPJ,LucassenGW,PuppelsGJ.CombinedInVivoConfocalRamanSpectroscopyandConfocalMicroscopyofHumanSkin[J].BiophysicalJournal,2003,85(1):572-580.[2]Scott,I.R.,andC.R.Harding.1986.Filaggrinbreakdowntowaterbinding

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