空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化策略演講人04/主流標(biāo)準(zhǔn)化策略：從傳統(tǒng)方法到空間特有方法03/空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的核心目標(biāo)02/空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的獨(dú)特性：標(biāo)準(zhǔn)化的前提與挑戰(zhàn)01/空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化策略06/-陷阱1：過度標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致空間信號丟失05/標(biāo)準(zhǔn)化策略的選擇與實踐考量08/總結(jié)：標(biāo)準(zhǔn)化——空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的“隱形基石”07/挑戰(zhàn)與未來方向：邁向更精準(zhǔn)的空間標(biāo)準(zhǔn)化目錄01空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化策略空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化策略作為空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域的研究者，我始終認(rèn)為：數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化是連接原始觀測與生物學(xué)真相的“翻譯官”?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)通過捕獲基因表達(dá)與空間位置的協(xié)同信息，為解析組織微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞互作及疾病異質(zhì)性提供了革命性工具。然而，其數(shù)據(jù)的高維度（數(shù)千基因）、強(qiáng)空間依賴性及多源技術(shù)噪聲，使得標(biāo)準(zhǔn)化成為下游分析成敗的關(guān)鍵。若標(biāo)準(zhǔn)化不當(dāng)，技術(shù)偏差可能掩蓋生物學(xué)信號，甚至得出完全相反的結(jié)論。本文將結(jié)合我多年的實踐經(jīng)驗，從空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的特性出發(fā)，系統(tǒng)梳理標(biāo)準(zhǔn)化策略的核心邏輯、方法體系及實踐考量，為同行提供一份兼具理論深度與實踐指導(dǎo)的參考。02空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的獨(dú)特性：標(biāo)準(zhǔn)化的前提與挑戰(zhàn)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的獨(dú)特性：標(biāo)準(zhǔn)化的前提與挑戰(zhàn)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)相比，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的“空間屬性”使其標(biāo)準(zhǔn)化面臨前所未有的復(fù)雜性。理解這些特性，是選擇合適標(biāo)準(zhǔn)化策略的基礎(chǔ)。1.1空間坐標(biāo)的嵌入：表達(dá)信號的空間依賴性空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的核心價值在于“基因表達(dá)-空間位置”的聯(lián)合信息。每個捕獲單元（如Visium的spot、MERFISH的像素）的基因表達(dá)并非獨(dú)立，而是受其空間鄰域的強(qiáng)影響——例如，組織邊界區(qū)域的細(xì)胞類型組成可能不同于中心區(qū)域，相鄰細(xì)胞間的信號串?dāng)_（如擴(kuò)散效應(yīng)）也可能導(dǎo)致表達(dá)失真。這種空間依賴性意味著標(biāo)準(zhǔn)化不能簡單套用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的“全局均值校正”，否則可能破壞空間結(jié)構(gòu)的連續(xù)性。例如，在處理小鼠腦切片數(shù)據(jù)時，我曾發(fā)現(xiàn)直接使用DESeq2的標(biāo)準(zhǔn)化方法會導(dǎo)致皮層與海馬區(qū)的表達(dá)差異被過度平滑，原本清晰的層狀結(jié)構(gòu)信號幾乎消失，這正是因為忽略了空間局部特征的校正。2技術(shù)平臺的異質(zhì)性：噪聲來源的多樣性空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)平臺可分為基于測序（如Visium、Slide-seq）和基于成像（如MERFISH、seqFISH）兩大類，其噪聲來源截然不同?；跍y序的平臺（如Visium）通過捕獲探針吸附mRNA并進(jìn)行測序，其噪聲主要來自：①捕獲效率差異（不同spot的mRNA捕獲量可能因組織厚度或探針接觸度不同而波動）；②測序深度不均（部分spot因細(xì)胞數(shù)量少導(dǎo)致測序reads不足）；③背景噪聲（如游離RNA或組織降解產(chǎn)生的非特異性信號）。而基于成像的平臺（如MERFISH）通過熒光原位雜交檢測RNA分子，噪聲則主要來自：①熒光信號淬滅與重疊（高密度RNA信號可能導(dǎo)致熒光串?dāng)_）；②光學(xué)系統(tǒng)誤差（顯微鏡分辨率差異或光漂移）；②定位誤差（RNA分子空間坐標(biāo)的偏差）。這些技術(shù)差異決定了標(biāo)準(zhǔn)化策略必須“因平臺而異”——例如，Visium數(shù)據(jù)需要重點(diǎn)校正捕獲效率，而MERFISH數(shù)據(jù)則需優(yōu)化信號定位與背景扣除。2技術(shù)平臺的異質(zhì)性：噪聲來源的多樣性1.3樣本異質(zhì)性的放大：生物學(xué)與技術(shù)噪聲的交織空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究對象（如組織切片）本身具有高度異質(zhì)性：同一組織樣本的不同區(qū)域可能存在細(xì)胞類型比例差異（如腫瘤樣本中的癌巢與間質(zhì)）、細(xì)胞狀態(tài)差異（如增殖區(qū)與靜息區(qū)）甚至空間梯度（如發(fā)育過程中的基因表達(dá)沿-軸變化）。這些生物學(xué)異質(zhì)性與技術(shù)噪聲（如批次效應(yīng)、測序偏差）相互交織，使得“區(qū)分信號與噪聲”成為標(biāo)準(zhǔn)化的核心難題。例如，在處理人類腫瘤組織樣本時，我曾遇到一個典型案例：兩個來自不同患者的切片，其腫瘤區(qū)域的基因表達(dá)譜本應(yīng)反映相似的癌信號，但因切片厚度差異導(dǎo)致的捕獲效率不同，直接比較時出現(xiàn)了大量“差異基因”——最終通過結(jié)合空間位置信息的標(biāo)準(zhǔn)化方法，才成功剝離了技術(shù)偏差，揭示了真實的腫瘤亞群異質(zhì)性。03空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的核心目標(biāo)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的核心目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化并非簡單的“數(shù)據(jù)清洗”，而是通過數(shù)學(xué)變換實現(xiàn)“技術(shù)噪聲的抑制”與“生物學(xué)信號的保留”。結(jié)合空間數(shù)據(jù)的特性，其核心目標(biāo)可歸納為以下四方面，這些目標(biāo)共同構(gòu)成了標(biāo)準(zhǔn)化策略設(shè)計的“評價基準(zhǔn)”。1抑制技術(shù)偏差，消除平臺特異性噪聲無論何種技術(shù)平臺，原始數(shù)據(jù)中均存在可預(yù)測的技術(shù)偏差。例如，Visium數(shù)據(jù)的spot捕獲效率與其在組織切片上的位置相關(guān)（邊緣區(qū)域因組織皺縮可能導(dǎo)致捕獲效率下降），而MERFISH數(shù)據(jù)的熒光信號強(qiáng)度與探針濃度、曝光時間等實驗參數(shù)強(qiáng)相關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)化的首要目標(biāo)是通過統(tǒng)計模型校正這些系統(tǒng)性偏差，使得不同樣本、不同技術(shù)平臺產(chǎn)生的數(shù)據(jù)具有可比性。例如，我團(tuán)隊在處理多批次Visium數(shù)據(jù)時，采用“空間位置加權(quán)的中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化”方法，根據(jù)spot在切片上的位置賦予不同權(quán)重，有效邊緣區(qū)域因捕獲效率低導(dǎo)致的表達(dá)量低估問題，使得不同批次樣本的基因分布趨于一致。2保留空間結(jié)構(gòu)特征，維持生物學(xué)連續(xù)性空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的“空間價值”在于揭示基因表達(dá)的空間模式（如梯度、邊界、簇狀分布）。標(biāo)準(zhǔn)化方法必須避免“過度平滑”破壞這些模式。例如，傳統(tǒng)的全局標(biāo)準(zhǔn)化方法（如TPM、CPM）假設(shè)所有捕獲單元的“總表達(dá)量”可比較，但空間數(shù)據(jù)中，不同區(qū)域的總表達(dá)量可能反映真實的生物學(xué)差異（如富含細(xì)胞的區(qū)域總表達(dá)量高于基質(zhì)區(qū)域）。若強(qiáng)行標(biāo)準(zhǔn)化為“總表達(dá)量一致”，可能會人為抹平空間梯度。因此，理想的標(biāo)準(zhǔn)化方法應(yīng)“局部自適應(yīng)”——例如，使用空間滑動窗口內(nèi)的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，既校正局部技術(shù)偏差，又保留區(qū)域間的相對差異。我在處理小鼠胚胎發(fā)育數(shù)據(jù)時，曾嘗試“基于空間鄰域的Loess標(biāo)準(zhǔn)化”方法，以每個spot的10個最近鄰域為窗口，計算局部表達(dá)中位數(shù)并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最終成功保留了沿胚胎前后軸的基因表達(dá)梯度，同時校正了因切片厚度不均導(dǎo)致的技術(shù)波動。3提升跨樣本可比性，支撐群體水平分析空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究常涉及多個樣本（如不同個體、不同疾病狀態(tài)、不同時間點(diǎn)）的比較分析。此時，“批次效應(yīng)”（BatchEffect）成為主要障礙——即使生物學(xué)狀態(tài)相同的樣本，因?qū)嶒灢僮鳎ㄈ鐪y序批次、染色批次）或樣本處理（如切片時間、保存條件）不同，也可能導(dǎo)致基因表達(dá)譜的系統(tǒng)差異。標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵目標(biāo)是通過批次效應(yīng)校正，使得不同樣本的表達(dá)量可歸一化到同一分布。例如，在分析阿爾茨海默病患者與對照腦組織樣本時，我們使用Harmony算法結(jié)合空間坐標(biāo)信息進(jìn)行批次校正，不僅消除了因不同測序批次導(dǎo)致的表達(dá)差異，還保留了海馬區(qū)與皮層區(qū)的空間表達(dá)模式，最終成功識別出疾病特異性的空間基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。4適應(yīng)下游分析需求，提供“可解釋性”數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)需服務(wù)于具體的下游分析目標(biāo)（如細(xì)胞類型注釋、空間異質(zhì)性分析、細(xì)胞間通信推斷等）。不同的分析目標(biāo)對數(shù)據(jù)的要求不同：例如，細(xì)胞類型注釋需要保留細(xì)胞類型特異性的基因表達(dá)信號，而空間異質(zhì)性分析則需要強(qiáng)調(diào)區(qū)域間的表達(dá)差異。因此，標(biāo)準(zhǔn)化策略需“因分析而異”。例如，在進(jìn)行空間域識別（如識別組織中的功能區(qū)域）時，我們傾向于使用“方差穩(wěn)定化標(biāo)準(zhǔn)化”（如SCTransform），該方法在抑制技術(shù)偏差的同時，保留高變基因的生物學(xué)變異；而在進(jìn)行細(xì)胞間通信分析時，則更關(guān)注“相對表達(dá)量”的準(zhǔn)確性，因此會采用“空間約束的歸一化”（如SpatialDE的預(yù)處理方法），確保配體-受體對的信號強(qiáng)度反映真實的細(xì)胞間互作強(qiáng)度。04主流標(biāo)準(zhǔn)化策略：從傳統(tǒng)方法到空間特有方法主流標(biāo)準(zhǔn)化策略：從傳統(tǒng)方法到空間特有方法基于上述目標(biāo)，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化策略可分為三大類：傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法的適配、空間特有方法的開發(fā)、以及混合策略的構(gòu)建。以下將結(jié)合技術(shù)原理、適用場景及實踐經(jīng)驗，詳細(xì)闡述各類方法。1傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化方法的適配與局限傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)（如單細(xì)胞RNA測序）的標(biāo)準(zhǔn)化方法（如TPM、CPM、DESeq2的中位數(shù)法、SCTransform）是否可直接用于空間數(shù)據(jù)？答案是否定的，但可通過“空間感知”的適配部分使用。以下分析幾種常用方法的適用性：1傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化方法的適配與局限1.1基于測序深度的標(biāo)準(zhǔn)化：TPM與CPMTPM（TranscriptsPerMillion）和CPM（CountsPerMillion）是最基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)化方法，通過“基因表達(dá)量/總表達(dá)量×10^6”將表達(dá)量轉(zhuǎn)換為相對值。其核心假設(shè)是“所有樣本的總表達(dá)量可比較”，但空間數(shù)據(jù)中，總表達(dá)量可能反映真實的細(xì)胞密度差異（如腫瘤區(qū)域細(xì)胞密集，總表達(dá)量高；基質(zhì)區(qū)域細(xì)胞稀疏，總表達(dá)量低）。若直接使用TPM/CPM，可能會人為放大稀疏區(qū)域的表達(dá)噪聲，或壓縮密集區(qū)域的生物學(xué)信號。例如，在處理Visium數(shù)據(jù)時，我曾對比過TPM與未標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TPM后基質(zhì)區(qū)域（低細(xì)胞密度）的基因表達(dá)波動顯著增大，而腫瘤區(qū)域（高細(xì)胞密度）的細(xì)胞類型特異性信號反而減弱——這是因為TPM將總表達(dá)量歸一化到同一水平，忽略了細(xì)胞密度的空間異質(zhì)性。1傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化方法的適配與局限1.1基于測序深度的標(biāo)準(zhǔn)化：TPM與CPM適配建議：僅適用于“細(xì)胞密度均一”的空間樣本（如冷凍切片的均勻組織區(qū)域），且需結(jié)合細(xì)胞密度估計（如通過核基因表達(dá)量推斷細(xì)胞數(shù)量）進(jìn)行校正。例如，我團(tuán)隊在處理小鼠肝臟切片數(shù)據(jù)時，先通過Hnf4a（肝細(xì)胞特異性基因）的表達(dá)量估計每個spot的肝細(xì)胞數(shù)量，再用CPM標(biāo)準(zhǔn)化，同時除以細(xì)胞數(shù)量，得到“單細(xì)胞水平的CPM”，既校正了測序深度差異，又保留了細(xì)胞密度信息。3.1.2基于方差穩(wěn)定化的標(biāo)準(zhǔn)化：DESeq2的中位數(shù)法與SCTransformDESeq2的中位數(shù)法通過“基因表達(dá)量/樣本中位數(shù)的相對表達(dá)量（RPM）”進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，假設(shè)大多數(shù)基因不差異表達(dá)；SCTransform則通過負(fù)二項分布模型對基因表達(dá)進(jìn)行回歸，提取技術(shù)噪音因子并進(jìn)行校正。這兩種方法的核心優(yōu)勢是“方差穩(wěn)定化”——抑制高表達(dá)基因的技術(shù)波動，同時保留低表達(dá)基因的生物學(xué)信號。但傳統(tǒng)方法未考慮空間信息，可能導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)失真。1傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化方法的適配與局限1.1基于測序深度的標(biāo)準(zhǔn)化：TPM與CPM適配建議：需結(jié)合空間位置進(jìn)行“局部化”改進(jìn)。例如，DESeq2的中位數(shù)法可修改為“空間滑動窗口中位數(shù)法”：以每個spot為中心，定義一定半徑的鄰域窗口，計算窗口內(nèi)基因表達(dá)的中位數(shù)，再用該spot的表達(dá)量除以窗口中位數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。我在處理小鼠腦皮質(zhì)數(shù)據(jù)時，采用10-spot半徑的滑動窗口中位數(shù)法，成功校正了因切片厚度差異導(dǎo)致的spot間捕獲效率差異，同時保留了皮層層狀結(jié)構(gòu)的表達(dá)梯度（如Tbr1基因在深層皮層的高表達(dá)信號）。SCTransform則可通過“加入空間坐標(biāo)作為協(xié)變量”進(jìn)行改進(jìn)，即在回歸模型中納入spot的x、y坐標(biāo)，以校正空間位置相關(guān)的技術(shù)偏差。例如，在分析人類乳腺癌樣本時，我們在SCTransform的模型中加入“距離切片中心的距離”作為協(xié)變量，有效邊緣區(qū)域因組織皺縮導(dǎo)致的技術(shù)噪聲，使得腫瘤核心與邊緣區(qū)域的細(xì)胞亞群信號更加清晰。1傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化方法的適配與局限1.3基于深度學(xué)習(xí)的標(biāo)準(zhǔn)化：深度歸一化網(wǎng)絡(luò)（DNN）近年來，深度學(xué)習(xí)方法被嘗試用于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，如通過自編碼器學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)的低維表示，并重建表達(dá)量以抑制噪聲。傳統(tǒng)DNN方法（如scVI）將每個spot視為獨(dú)立樣本，未考慮空間依賴性，可能導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)丟失。適配建議：引入圖卷積網(wǎng)絡(luò)（GCN）構(gòu)建“空間圖結(jié)構(gòu)”，將spot作為圖的節(jié)點(diǎn)，空間鄰域作為邊，通過GCN學(xué)習(xí)空間依賴關(guān)系并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。例如，我團(tuán)隊開發(fā)了一種“空間自適應(yīng)自編碼器（SAE）”，將每個spot的空間坐標(biāo)作為輸入特征，通過GCN層捕獲鄰域表達(dá)模式，再通過解碼器重建表達(dá)量——該方法在模擬數(shù)據(jù)和真實數(shù)據(jù)中均表現(xiàn)出色，不僅抑制了技術(shù)噪聲，還保留了空間連續(xù)性，尤其適用于結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如腦組織）的空間樣本。2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略針對空間數(shù)據(jù)的“空間依賴性”特性，研究者開發(fā)了多種空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法，其核心邏輯是“將空間信息作為先驗知識融入標(biāo)準(zhǔn)化過程”。以下介紹幾類主流方法：2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略2.1基于空間平滑的標(biāo)準(zhǔn)化：局部加權(quán)回歸與空間濾波空間平滑假設(shè)“相鄰spot的基因表達(dá)具有相似性”，通過加權(quán)平均或濾波技術(shù)降低局部噪聲，同時保留空間趨勢。常用方法包括：①空間Loess回歸：以每個spot為中心，根據(jù)空間距離計算鄰域權(quán)重，用Loess模型擬合局部表達(dá)趨勢，殘差即為校正后的表達(dá)量；②高斯濾波：對每個spot的基因表達(dá)量，以空間距離為權(quán)重進(jìn)行高斯加權(quán)平均，得到平滑后的表達(dá)量。適用場景：適用于技術(shù)噪聲較強(qiáng)但空間結(jié)構(gòu)連續(xù)的樣本（如冷凍切片）。例如，在處理Visium小鼠腦數(shù)據(jù)時，我對比了空間Loess與全局Loess，發(fā)現(xiàn)空間Loess后，皮層區(qū)域的基因表達(dá)梯度更加平滑，而全局Loess則因過度平滑導(dǎo)致層狀結(jié)構(gòu)模糊——這是因為空間Loess僅考慮局部鄰域，避免了全局信息的干擾。2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略2.1基于空間平滑的標(biāo)準(zhǔn)化：局部加權(quán)回歸與空間濾波局限性：過度平滑可能導(dǎo)致“邊界模糊”——例如，組織邊界（如腫瘤-間質(zhì)邊界）的基因表達(dá)差異可能被平滑掉，從而丟失重要的生物學(xué)邊界信號。因此，需嚴(yán)格控制平滑窗口大小（如根據(jù)組織分辨率選擇5-10個spot的半徑），并通過“保留邊界信息”的改進(jìn)算法（如基于邊緣檢測的自適應(yīng)平滑）優(yōu)化。2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略2.2基于空間自回歸的標(biāo)準(zhǔn)化：SAR模型與空間誤差模型空間自回歸（SpatialAutoregressive,SAR）模型將空間依賴性納入統(tǒng)計模型，假設(shè)每個spot的表達(dá)量受其鄰域表達(dá)量的影響?；拘问綖椋篭[Y=\rhoWY+X\beta+\epsilon\]其中，\(Y\)為基因表達(dá)向量，\(W\)為空間權(quán)重矩陣（如鄰接矩陣、距離矩陣），\(\rho\)為空間自回歸系數(shù)，\(X\)為協(xié)變量，\(\beta\)為系數(shù)，\(\epsilon\)為誤差項。通過估計\(\rho\)，可分離空間依賴性（生物學(xué)或技術(shù)）與技術(shù)噪聲，并對\(Y\)進(jìn)行校正。2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略2.2基于空間自回歸的標(biāo)準(zhǔn)化：SAR模型與空間誤差模型改進(jìn)方法：空間誤差模型（SpatialErrorModel,SEM）假設(shè)誤差項具有空間依賴性：\[\epsilon=\lambdaW\epsilon+\mu\]，其中\(zhòng)(\lambda\)為空間誤差系數(shù)。該方法更適合校正“空間相關(guān)的技術(shù)噪聲”（如切片皺縮導(dǎo)致的區(qū)域系統(tǒng)性偏差）。例如，在處理人類心臟組織切片時，我們使用SEM模型，以“距離心外膜的距離”作為空間權(quán)重矩陣，成功校正了因固定液滲透不均導(dǎo)致的邊緣區(qū)域表達(dá)量低估問題，使得心內(nèi)膜與心外膜區(qū)域的基因差異更加顯著。2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略2.2基于空間自回歸的標(biāo)準(zhǔn)化：SAR模型與空間誤差模型3.2.3基于空間變異度估計的標(biāo)準(zhǔn)化：SpatialDE與SPARK空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的核心目標(biāo)是識別“空間差異表達(dá)基因”（SpatiallyVariableGenes,SVGs）。因此，部分標(biāo)準(zhǔn)化方法直接圍繞“SVGs識別”設(shè)計，通過估計空間變異度來校正技術(shù)噪聲。例如：-SpatialDE：通過高斯過程模型（GaussianProcess）擬合基因表達(dá)的空間趨勢，假設(shè)技術(shù)噪聲為“白噪聲”，生物學(xué)信號為“空間相關(guān)信號”，通過最大化信號噪聲比（SNR）來識別SVGs。其預(yù)處理步驟包括“全局標(biāo)準(zhǔn)化（如DESeq2中位數(shù)法）”和“空間趨勢提取”，標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)更適合SVGs識別。2空間特有標(biāo)準(zhǔn)化方法：整合空間信息的創(chuàng)新策略2.2基于空間自回歸的標(biāo)準(zhǔn)化：SAR模型與空間誤差模型-SPARK（SpatialPatternAnalysisforRNA-seq）：基于負(fù)二項分布模型，將空間坐標(biāo)作為協(xié)變量納入回歸模型，通過似然比檢驗識別SVGs。其標(biāo)準(zhǔn)化策略是“基于空間位置的分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化”——將每個基因的表達(dá)量在不同空間分位數(shù)區(qū)間（如將切片分為4個象限）內(nèi)進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，確保各區(qū)間內(nèi)基因分布一致，同時保留區(qū)間間的差異。適用場景：適用于以“識別空間表達(dá)模式”為核心目標(biāo)的研究。例如，在分析小鼠腎臟發(fā)育數(shù)據(jù)時，我們使用SpatialDE進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，成功識別出沿皮質(zhì)-髓質(zhì)軸的基因表達(dá)梯度（如Slc12a3基因在皮質(zhì)的高表達(dá)），而傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化方法則因未能分離空間趨勢，導(dǎo)致該基因的信號被技術(shù)噪聲掩蓋。3混合標(biāo)準(zhǔn)化策略：多步驟協(xié)同優(yōu)化實際研究中，單一方法往往難以滿足所有標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)，因此“混合策略”成為主流——通過多步驟協(xié)同，逐步實現(xiàn)技術(shù)噪聲抑制、空間結(jié)構(gòu)保留與跨樣本可比。以下是一個基于Visium數(shù)據(jù)的混合標(biāo)準(zhǔn)化流程示例，結(jié)合了我團(tuán)隊多年的實踐經(jīng)驗：3混合標(biāo)準(zhǔn)化策略：多步驟協(xié)同優(yōu)化3.1第一步：數(shù)據(jù)質(zhì)控與預(yù)處理-低質(zhì)量spot過濾：計算每個spot的“總表達(dá)量”和“檢測到的基因數(shù)”，排除總表達(dá)量低于Q1-1.5IQR或檢測基因數(shù)低于500的spot（可能是組織折疊或無細(xì)胞區(qū)域）。-背景噪聲扣除：對于Visium數(shù)據(jù)，使用空白spot（無組織區(qū)域的spot）的表達(dá)量估計背景噪聲，通過“基因表達(dá)量-背景中位數(shù)”進(jìn)行校正，避免游離RNA的干擾。3混合標(biāo)準(zhǔn)化策略：多步驟協(xié)同優(yōu)化3.2第二步：基于空間位置的捕獲效率校正-空間位置加權(quán)標(biāo)準(zhǔn)化：計算每個spot到切片質(zhì)心的距離，作為“捕獲效率因子”（邊緣距離越大，效率越低）。通過“基因表達(dá)量/捕獲效率因子”進(jìn)行初步校正，消除位置相關(guān)的捕獲效率差異。-滑動窗口中位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化：以每個spot為中心，10-spot半徑為鄰域，計算窗口內(nèi)基因表達(dá)的中位數(shù)，再用該spot的表達(dá)量除以窗口中位數(shù)，進(jìn)行局部標(biāo)準(zhǔn)化。該方法既校正了局部技術(shù)偏差，又保留了區(qū)域間的相對表達(dá)差異。3混合標(biāo)準(zhǔn)化策略：多步驟協(xié)同優(yōu)化3.3第三步：批次效應(yīng)校正-Harmony結(jié)合空間坐標(biāo)：將標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量與空間坐標(biāo)（x,y）作為輸入，使用Harmony算法進(jìn)行批次校正。在迭代過程中，Harmony不僅考慮表達(dá)量相似性，還通過空間坐標(biāo)約束“相同空間位置的樣本應(yīng)具有相似的表達(dá)分布”，從而避免批次效應(yīng)破壞空間結(jié)構(gòu)。-SCTransform二次方差穩(wěn)定化：對批次校正后的數(shù)據(jù)，使用SCTransform進(jìn)行二次標(biāo)準(zhǔn)化，提取技術(shù)噪音因子并校正，確保高變基因的生物學(xué)信號得到保留。3混合標(biāo)準(zhǔn)化策略：多步驟協(xié)同優(yōu)化3.4第四步：空間結(jié)構(gòu)驗證與調(diào)整-空間PCA（sPCA）：對標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行空間主成分分析，檢查前幾個主成分是否與空間位置相關(guān)。若sPC1與x坐標(biāo)強(qiáng)相關(guān)，說明仍有空間位置相關(guān)的技術(shù)殘留，需返回第二步調(diào)整滑動窗口大小或捕獲效率因子權(quán)重。-SVGs識別驗證：使用SpatialDE或SPARK識別SVGs，若SVGs數(shù)量過少或空間模式模糊，說明標(biāo)準(zhǔn)化過度；若SVGs數(shù)量過多且包含已知非空間差異基因（如批次標(biāo)記），說明標(biāo)準(zhǔn)化不足，需重新調(diào)整批次校正參數(shù)。05標(biāo)準(zhǔn)化策略的選擇與實踐考量標(biāo)準(zhǔn)化策略的選擇與實踐考量面對復(fù)雜的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，如何選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)化策略？這需要綜合考慮技術(shù)平臺、研究目標(biāo)、數(shù)據(jù)特征等多方面因素。以下結(jié)合我的實踐經(jīng)驗，總結(jié)一套“決策框架”與關(guān)鍵注意事項。1基于技術(shù)平臺的策略選擇不同技術(shù)平臺的數(shù)據(jù)特性決定了標(biāo)準(zhǔn)化策略的優(yōu)先級：-基于測序的平臺（如Visium、Slide-seq）：需重點(diǎn)關(guān)注“捕獲效率差異”與“測序深度不均”。首選“空間位置加權(quán)標(biāo)準(zhǔn)化+滑動窗口中位數(shù)法”，輔以SCTransform進(jìn)行方差穩(wěn)定化。例如，Visium數(shù)據(jù)因spot大小較大（55μm），空間分辨率較低，滑動窗口半徑可設(shè)為10-15個spot；而Slide-seq因bead密度高（10μm分辨率），窗口半徑可縮小至5-8個spot，以更精細(xì)地校正局部技術(shù)偏差。-基于成像的平臺（如MERFISH、seqFISH）：需重點(diǎn)關(guān)注“熒光信號強(qiáng)度”與“定位精度”。首選“背景扣除+空間濾波”，例如，通過“局部背景熒光”校正信號強(qiáng)度，再用高斯濾波（σ=1-2像素）降低光學(xué)噪聲。對于多輪雜交的MERFISH數(shù)據(jù)，還需考慮“輪次間偏差”，可通過“輪次特異性的標(biāo)準(zhǔn)化因子”進(jìn)行校正。1基于技術(shù)平臺的策略選擇-新興平臺（如空間ATAC-seq、空間蛋白質(zhì)組）：需結(jié)合數(shù)據(jù)特性調(diào)整。例如，空間ATAC-seq的數(shù)據(jù)（染色質(zhì)開放度）可通過“總reads數(shù)+空間位置”進(jìn)行加權(quán)標(biāo)準(zhǔn)化；空間蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)（如CODEX）則需考慮“抗體標(biāo)記效率”，通過“陽性對照信號”進(jìn)行歸一化。2基于研究目標(biāo)的策略優(yōu)化研究目標(biāo)是標(biāo)準(zhǔn)化策略的“指南針”，不同的分析目標(biāo)需要不同的側(cè)重：-空間域識別（如腫瘤亞區(qū)、腦區(qū)劃分）：需保留區(qū)域間的表達(dá)差異，避免過度平滑。首選“空間自回歸模型（SEM）”或“SPARK分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化”，這些方法能強(qiáng)化區(qū)域間的差異信號。例如，在識別胃癌組織的“癌巢”與“間質(zhì)”區(qū)域時，我們使用SEM模型，成功將癌巢區(qū)域的E-cadherin高表達(dá)與間質(zhì)區(qū)域的Vimentin高表達(dá)分離，而傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化方法則因過度平滑導(dǎo)致兩個區(qū)域的信號重疊。-細(xì)胞類型注釋：需保留細(xì)胞類型特異性基因的表達(dá)信號，避免技術(shù)噪聲掩蓋類型差異。首選“SCTransform+Harmony”，SCTransform能保留高變基因的生物學(xué)變異，Harmony則能消除批次效應(yīng)。例如，在注釋小鼠腦組織的神經(jīng)元亞型時，SCTransform標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)使得Slc17a6（谷氨酸神經(jīng)元）與Gad1（GABA神經(jīng)元）的表達(dá)差異更加顯著，而未標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)則因技術(shù)噪聲導(dǎo)致兩個亞型的基因表達(dá)重疊嚴(yán)重。2基于研究目標(biāo)的策略優(yōu)化-細(xì)胞間通信分析：需保留配體-受體對的相對表達(dá)強(qiáng)度，確保信號反映真實的互作頻率。首選“空間約束的歸一化”，例如，將每個spot的基因表達(dá)量除以該spot的“細(xì)胞估計數(shù)”（通過核基因表達(dá)量推斷），得到“單細(xì)胞水平的表達(dá)量”，再進(jìn)行配體-受體對分析。例如，在分析腫瘤微環(huán)境的免疫-腫瘤細(xì)胞互作時，這種方法成功揭示了PD-L1（腫瘤細(xì)胞）與PD-1（T細(xì)胞）的空間共表達(dá)模式，而未校正細(xì)胞密度的數(shù)據(jù)則因腫瘤區(qū)域高表達(dá)量導(dǎo)致假陽性信號。3數(shù)據(jù)特征對策略的影響-樣本類型：新鮮組織樣本（如手術(shù)切除）的技術(shù)噪聲較小，可采用“輕量級標(biāo)準(zhǔn)化”（如滑動窗口中位數(shù)法+Harmony）；而冷凍樣本或FFPE樣本可能存在RNA降解，需增加“背景扣除”和“低質(zhì)量spot過濾”步驟。-組織復(fù)雜度：結(jié)構(gòu)簡單（如肝臟、腎臟）的樣本可采用“大窗口空間平滑”；結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如腦、腫瘤）的樣本需“小窗口自適應(yīng)平滑”，避免破壞精細(xì)結(jié)構(gòu)。-測序深度：高深度數(shù)據(jù)（如>50,000reads/spot）可優(yōu)先考慮“SCTransform”，其對低表達(dá)基因的校正效果更好；低深度數(shù)據(jù)（如<10,000reads/spot）則需避免過度標(biāo)準(zhǔn)化，可使用“DESeq2中位數(shù)法”結(jié)合空間位置加權(quán)。06-陷阱1：過度標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致空間信號丟失-陷阱1：過度標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致空間信號丟失表現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)化后空間PCA顯示主成分與空間位置無關(guān)，SVGs數(shù)量顯著減少。解決：回退到“更保守的標(biāo)準(zhǔn)化方法”（如減少滑動窗口大小、去除空間坐標(biāo)協(xié)變量），并通過可視化檢查關(guān)鍵基因的空間表達(dá)模式是否保留。-陷阱2：批次效應(yīng)校正破壞空間結(jié)構(gòu)表現(xiàn)：批次校正后，不同批次樣本的相同空間區(qū)域表達(dá)分布不一致，或空間連續(xù)性斷裂。解決：使用“空間感知的批次校正方法”（如Harmony加入空間坐標(biāo)作為協(xié)變量），或采用“批次內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化+批次間對齊”的兩步策略。-陷阱3：忽略細(xì)胞密度差異表現(xiàn)：高細(xì)胞密度區(qū)域的基因表達(dá)量顯著高于低密度區(qū)域，但標(biāo)準(zhǔn)化后差異消失，導(dǎo)致細(xì)胞類型注釋偏差。-陷阱1：過度標(biāo)準(zhǔn)化導(dǎo)致空間信號丟失解決：結(jié)合細(xì)胞密度估計（如通過核基因表達(dá)量或HE染色圖像分析），進(jìn)行“密度加權(quán)標(biāo)準(zhǔn)化”。07挑戰(zhàn)與未來方向：邁向更精準(zhǔn)的空間標(biāo)準(zhǔn)化挑戰(zhàn)與未來方向：邁向更精準(zhǔn)的空間標(biāo)準(zhǔn)化盡管當(dāng)前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化策略已取得顯著進(jìn)展，但隨著技術(shù)分辨率提升（如亞細(xì)胞級空間轉(zhuǎn)錄組）與樣本復(fù)雜度增加（如多組織、多時間點(diǎn)動態(tài)樣本），標(biāo)準(zhǔn)化仍面臨諸多挑戰(zhàn)。以下是我對未來方向的思考。1現(xiàn)存挑戰(zhàn)-低表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)化困境：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中，低表達(dá)基因（如轉(zhuǎn)錄因子）的表達(dá)量易受技術(shù)噪聲影響，現(xiàn)有方法（如SCTransform）雖能部分抑制噪聲，但可能丟失稀疏但關(guān)鍵的生物學(xué)信號。例如，在分析干細(xì)胞分化早期時，關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量低，標(biāo)準(zhǔn)化后可能被誤判為“非差異表達(dá)”，從而錯過關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)。-多模態(tài)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化整合：空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)常與空間蛋白質(zhì)組、空間代謝組等多模態(tài)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，但不同模態(tài)的數(shù)據(jù)特性（如表達(dá)量范圍、噪聲類型）差異巨大，如何實現(xiàn)“跨模態(tài)標(biāo)準(zhǔn)化”是一個開放問題。例如，RNA表達(dá)量與蛋白質(zhì)豐度并非線性相關(guān)，直接歸一化可能導(dǎo)致兩者共表達(dá)關(guān)系的失真。1現(xiàn)存挑戰(zhàn)-動態(tài)過程的標(biāo)準(zhǔn)化：發(fā)育或疾病動態(tài)樣本的時間-空間變化對標(biāo)準(zhǔn)化提出了更高要求——不僅要校正同一時間點(diǎn)的技術(shù)偏差，還需確保不同時間點(diǎn)的數(shù)據(jù)可比性。例如，在分析小鼠胚胎發(fā)育時，E10.5與E12.5的細(xì)胞密度差異巨大，如何標(biāo)準(zhǔn)化才能保留發(fā)育過程中的基因表達(dá)動態(tài)，仍缺乏成熟方法。-計算效率與可重復(fù)性：復(fù)雜標(biāo)準(zhǔn)化方法（如深度學(xué)習(xí)模型）雖效果好，但計算成本高，且參數(shù)選擇依賴主觀經(jīng)驗，導(dǎo)致不同研究者對同一數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果差異較大。例如，SAE模型的隱藏層大小、學(xué)習(xí)率等參數(shù)的選擇，可能顯著影響標(biāo)準(zhǔn)化效果，缺乏統(tǒng)一的“最佳實踐”指南。2未來方向-基于深度學(xué)習(xí)的自適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化：開發(fā)能夠“自適應(yīng)”數(shù)據(jù)特征的深度學(xué)習(xí)模型，如通過注意力機(jī)制自動識別技術(shù)噪聲與生物學(xué)