微小RNA-21對瘢痕疙瘩中MMP-2的調(diào)控機(jī)制及影響研究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1瘢痕疙瘩的危害與研究現(xiàn)狀瘢痕疙瘩是一種皮膚纖維組織過度生長的病變，常繼發(fā)于皮膚損傷后，導(dǎo)致機(jī)體纖維母細(xì)胞增殖、凋亡平衡被打破，進(jìn)而使得膠原過度沉積在真皮及皮下組織。其不僅影響患者的外觀，還會對患者的心理和生理健康造成多方面的危害。在外觀方面，瘢痕疙瘩常呈現(xiàn)出隆起、增厚的形態(tài)，顏色也可能與周圍正常皮膚不同，若發(fā)生在暴露部位，如面、頸和四肢等，會嚴(yán)重影響患者的外貌美觀，給患者的心理造成較大的負(fù)擔(dān)。當(dāng)瘢痕疙瘩增生明顯時(shí)，還可能累及關(guān)節(jié)部位，如肩關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)等，從而造成局部功能障礙，影響患者的正常生活和工作。此外，瘢痕疙瘩還可能伴有瘙癢、疼痛等不適癥狀，特別是在受到刺激或氣候變化時(shí)，這些癥狀可能會加重，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。并且，雖然瘢痕疙瘩發(fā)生惡變的風(fēng)險(xiǎn)較低，但仍有一定的癌變傾向，若長期受到搔抓刺激且未及時(shí)控制病變，有可能會形成瘢痕癌，危及患者生命安全。目前，瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全明確。一般認(rèn)為，瘢痕疙瘩的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，包括遺傳、免疫、細(xì)胞因子、信號通路等。從遺傳因素來看，瘢痕疙瘩具有一定的家族遺傳傾向，研究發(fā)現(xiàn)其可能與某些染色體上的易感位點(diǎn)相關(guān)。在免疫方面，瘢痕疙瘩的形成可能是一種特殊免疫反應(yīng)，瘢痕組織中存在大量的淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及免疫球蛋白，表明免疫機(jī)制參與了瘢痕疙瘩的形成與發(fā)展。在細(xì)胞和分子生物學(xué)層面，瘢痕疙瘩最主要的組織病理學(xué)特征是病變部位膠原等細(xì)胞外膠質(zhì)的過度沉積，這可能與膠原mRNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)的DNA編碼區(qū)的異常開啟或增加有關(guān)，或者是內(nèi)源性細(xì)胞生長因子參與的結(jié)果。在治療方面，目前常用的治療方法包括手術(shù)治療、物理療法、藥物治療等，但這些方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療雖然可以直接切除瘢痕疙瘩，但單純手術(shù)切除后的復(fù)發(fā)率較高，可達(dá)45%-100%。物理療法如壓力療法、放射療法、激光治療等，雖有一定效果，但也存在治療時(shí)間長、有后遺癥、復(fù)發(fā)率高等問題。藥物治療方面，傳統(tǒng)中藥如積雪草、苦參堿，西藥如皮質(zhì)類固醇藥物、抗代謝藥物、維甲酸類藥物等，雖能在一定程度上抑制瘢痕疙瘩的生長，但也難以達(dá)到根治的效果。因此，深入研究瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的治療方法具有重要的臨床意義。1.1.2微小RNA-21與MMP-2在瘢痕疙瘩研究中的重要性微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性染色體上非編碼蛋白的RNA，長度較短，通常在20-24個(gè)核苷酸左右，但其在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，在瘢痕疙瘩的形成過程中也不例外。微小RNA-21（miR-21）在瘢痕疙瘩的研究中備受關(guān)注。已有研究表明，與正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-21存在差異表達(dá)。miR-21可能通過調(diào)控多個(gè)靶基因參與瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展過程。它可以影響成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力，進(jìn)而影響瘢痕疙瘩中細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解平衡。例如，miR-21可能通過抑制某些促凋亡基因的表達(dá)，減少成纖維細(xì)胞的凋亡，使得成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，過度合成細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致瘢痕疙瘩的形成。此外，miR-21還可能參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，影響瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展。炎癥在瘢痕疙瘩的形成中起著重要作用，miR-21可能通過調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，影響炎癥細(xì)胞的浸潤和活化，從而間接影響瘢痕疙瘩的形成。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）是一種鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員。MMP-2在細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠特異性地降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、明膠等。在正常的生理狀態(tài)下，MMP-2的表達(dá)和活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡。然而，在瘢痕疙瘩中，MMP-2的表達(dá)和活性常常出現(xiàn)異常。研究表明，MMP-2的異常表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的降解失衡，使得膠原等細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，這與瘢痕疙瘩的主要病理特征相符。MMP-2還可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化等過程，進(jìn)一步影響瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展。例如，MMP-2可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，釋放出一些生長因子和細(xì)胞因子，這些因子可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，從而加速瘢痕疙瘩的形成。微小RNA-21和MMP-2在瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展過程中都具有潛在的重要作用。深入研究它們之間的相互關(guān)系以及對瘢痕疙瘩形成的影響，有望為瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制研究提供新的視角，也為開發(fā)針對瘢痕疙瘩的新型治療方法提供理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在瘢痕疙瘩的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者圍繞微小RNA-21和MMP-2開展了諸多研究，取得了一定的成果。國外方面，有研究運(yùn)用高通量測序技術(shù)對瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-21在瘢痕疙瘩組織中顯著高表達(dá)。在對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)染miR-21模擬物或抑制劑來改變miR-21的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-21能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，抑制其凋亡，而下調(diào)miR-21則產(chǎn)生相反的效果。關(guān)于MMP-2，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕疙瘩的形成過程中，MMP-2的活性和表達(dá)水平均發(fā)生了明顯變化。在瘢痕疙瘩組織中，MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)量顯著高于正常皮膚組織，且其活性也明顯增強(qiáng)。通過對瘢痕疙瘩動物模型的研究，進(jìn)一步證實(shí)了MMP-2在瘢痕疙瘩形成中的關(guān)鍵作用，抑制MMP-2的活性可以減少瘢痕疙瘩的形成面積和厚度。國內(nèi)的研究也在不斷深入。有學(xué)者通過對大量瘢痕疙瘩患者的組織樣本進(jìn)行檢測，同樣發(fā)現(xiàn)miR-21在瘢痕疙瘩組織中的高表達(dá)現(xiàn)象，并且與瘢痕疙瘩的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在探討miR-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能影響的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-21可能通過靶向調(diào)控某些關(guān)鍵基因，如PTEN等，來影響成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為，進(jìn)而參與瘢痕疙瘩的形成。在MMP-2的研究上，國內(nèi)學(xué)者不僅對其在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)和活性進(jìn)行了檢測，還深入研究了MMP-2與其他細(xì)胞因子和信號通路之間的相互作用。研究表明，MMP-2可能與TGF-β信號通路相互關(guān)聯(lián)，TGF-β可以通過激活相關(guān)信號分子，上調(diào)MMP-2的表達(dá)，從而促進(jìn)瘢痕疙瘩的形成。盡管國內(nèi)外在微小RNA-21、MMP-2與瘢痕疙瘩關(guān)系的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足與空白。目前對于miR-21調(diào)控瘢痕疙瘩形成的具體分子機(jī)制尚未完全明確，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些可能的靶基因，但miR-21與這些靶基因之間的上下游關(guān)系以及它們在復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。對于MMP-2，雖然已知其在瘢痕疙瘩中表達(dá)和活性異常，但如何精準(zhǔn)地調(diào)控MMP-2的表達(dá)和活性，以達(dá)到治療瘢痕疙瘩的目的，目前還缺乏有效的手段和深入的研究。此外，關(guān)于miR-21和MMP-2之間是否存在直接或間接的相互作用，以及這種相互作用對瘢痕疙瘩形成的影響，目前相關(guān)研究較少，這也是未來研究需要重點(diǎn)關(guān)注的方向。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究微小RNA-21對瘢痕疙瘩中MMP-2的影響及具體作用機(jī)制，為瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)，并為其臨床治療提供潛在的分子靶點(diǎn)和新思路。在具體研究內(nèi)容方面，本研究將從多個(gè)層面展開。首先，會進(jìn)行組織樣本檢測分析，收集瘢痕疙瘩組織樣本和正常皮膚組織樣本，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測微小RNA-21和MMP-2在兩種組織中的表達(dá)水平，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確微小RNA-21和MMP-2在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)差異情況，初步了解它們與瘢痕疙瘩發(fā)病的相關(guān)性。接著，開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染微小RNA-21模擬物、抑制劑以及相應(yīng)的陰性對照，構(gòu)建微小RNA-21過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。利用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)水平，通過明膠酶譜法分析MMP-2的活性變化，以此探究微小RNA-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2表達(dá)和活性的直接調(diào)控作用。還將進(jìn)一步深入探討微小RNA-21調(diào)控MMP-2的潛在分子機(jī)制，通過生物信息學(xué)預(yù)測微小RNA-21與MMP-2之間可能存在的靶向關(guān)系，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證微小RNA-21是否直接作用于MMP-2的3'-UTR區(qū)域，確認(rèn)二者的靶向結(jié)合關(guān)系。此外，運(yùn)用RNA干擾技術(shù)敲低或過表達(dá)細(xì)胞中與微小RNA-21/MMP-2相關(guān)的上下游信號分子，觀察對MMP-2表達(dá)和活性的影響，深入解析微小RNA-21調(diào)控MMP-2的信號通路和分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)方法，從組織、細(xì)胞和分子水平探究微小RNA-21對瘢痕疙瘩中MMP-2的影響及作用機(jī)制，具體研究方法如下：組織樣本檢測分析：從醫(yī)院整形美容外科收集瘢痕疙瘩組織樣本30例，患者年齡范圍為18-50歲，其中男性18例，女性12例。同時(shí)，收集同一患者手術(shù)切除的距瘢痕疙瘩邊緣3cm以上的正常皮膚組織作為對照樣本。樣本采集后，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用TRIzol試劑提取組織總RNA，通過NanoDrop2000c檢測RNA的純度和濃度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。采用PrimeScriptRTreagentKit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。微小RNA-21的上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATCAA-3'；MMP-2的上游引物序列為5'-CCCTGAAGAAGATGACGACG-3'，下游引物序列為5'-CCATCTTCATCCGCTTCTCC-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算微小RNA-21和MMP-2的相對表達(dá)量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究：從瘢痕疙瘩組織中分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，采用組織塊貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)。將組織塊剪成1mm3大小，均勻接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為空白對照組、陰性對照組、微小RNA-21模擬物組、微小RNA-21抑制劑組。使用Lipofectamine3000將微小RNA-21模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，加入MMP-2一抗（1:1000稀釋）和內(nèi)參β-actin一抗（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算MMP-2蛋白的相對表達(dá)量。按照明膠酶譜試劑盒說明書進(jìn)行操作。制備含1%明膠的10%SDS凝膠，將細(xì)胞培養(yǎng)上清與上樣緩沖液混合，不進(jìn)行加熱變性，直接上樣。電泳結(jié)束后，將凝膠置于2.5%TritonX-100溶液中漂洗2次，每次15min，以去除SDS。然后將凝膠放入孵育緩沖液中，37℃孵育18-24h。孵育結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1h，再用脫色液脫色至背景清晰。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，MMP-2活性條帶表現(xiàn)為藍(lán)色背景下的白色條帶，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，半定量分析MMP-2的活性。分子機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件如TargetScan、miRanda等預(yù)測微小RNA-21與MMP-2之間可能存在的靶向關(guān)系。構(gòu)建含有MMP-23'-UTR野生型和突變型序列的雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將載體與微小RNA-21模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。若微小RNA-21模擬物組的熒光素酶活性顯著低于陰性對照組，則說明微小RNA-21與MMP-2的3'-UTR存在靶向結(jié)合關(guān)系。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測和文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出可能參與微小RNA-21調(diào)控MMP-2的上下游信號分子。設(shè)計(jì)針對這些信號分子的siRNA或過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中。通過qRT-PCR和Westernblot檢測信號分子的干擾或過表達(dá)效率，以及對MMP-2表達(dá)和活性的影響。使用信號通路抑制劑處理細(xì)胞，觀察對微小RNA-21調(diào)控MMP-2的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證信號通路。本研究技術(shù)路線如圖1所示：樣本采集與準(zhǔn)備：收集瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織樣本，分離培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞。組織水平檢測：采用qRT-PCR檢測微小RNA-21和MMP-2在組織中的表達(dá)水平。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)：構(gòu)建微小RNA-21過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型，通過Westernblot檢測MMP-2蛋白表達(dá)，明膠酶譜法分析MMP-2活性。分子機(jī)制研究：生物信息學(xué)預(yù)測靶向關(guān)系，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，RNA干擾和信號通路抑制劑實(shí)驗(yàn)解析分子機(jī)制。結(jié)果分析與討論：對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，討論微小RNA-21對瘢痕疙瘩中MMP-2的影響及作用機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖圖1技術(shù)路線圖二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1瘢痕疙瘩概述2.1.1瘢痕疙瘩的定義與特征瘢痕疙瘩是一種由皮膚損傷引發(fā)的病理性瘢痕，在傷口愈合過程中，由于機(jī)體調(diào)控失衡，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，從而形成超出原始損傷范圍的異常瘢痕組織。瘢痕疙瘩外觀上通常表現(xiàn)為隆起于皮膚表面，呈紅色或暗紅色，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面光滑發(fā)亮，形狀多樣，常見的有圓形、卵圓形、條索狀或不規(guī)則形，部分瘢痕疙瘩還會呈現(xiàn)出蟹足狀向周圍正常皮膚伸展。瘢痕疙瘩具有持續(xù)性生長的特性，即使在傷口愈合后，仍會不斷生長，且生長速度因人而異。它的生長范圍常常超過原損傷部位，侵襲周圍正常皮膚組織，這種侵襲性生長使得瘢痕疙瘩邊界不清晰，與周圍組織粘連緊密。瘢痕疙瘩還具有較高的復(fù)發(fā)率，手術(shù)切除后若不采取有效的輔助治療措施，很容易再次復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后的瘢痕疙瘩往往比原有的更大、更嚴(yán)重。許多患者在瘢痕疙瘩部位會感到明顯的瘙癢和疼痛，尤其在天氣變化、情緒波動或局部受到刺激時(shí)，這些癥狀會加劇，嚴(yán)重影響患者的日常生活和睡眠質(zhì)量。瘢痕疙瘩對患者的心理也會造成較大的負(fù)面影響，由于其影響外觀，患者可能會產(chǎn)生自卑、焦慮、抑郁等不良情緒，對社交和心理健康造成嚴(yán)重的影響。2.1.2瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子以及信號通路的異常調(diào)節(jié)，目前尚未完全明確。從細(xì)胞層面來看，成纖維細(xì)胞在瘢痕疙瘩的形成中起著核心作用。在正常傷口愈合過程中，成纖維細(xì)胞會增殖并合成細(xì)胞外基質(zhì)，隨后逐漸凋亡，使傷口愈合后皮膚恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。然而，在瘢痕疙瘩形成過程中，成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡失衡。瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更高的增殖率和更低的凋亡率，導(dǎo)致其數(shù)量不斷增加，持續(xù)合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、纖維連接蛋白等，最終造成細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。免疫細(xì)胞在瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮著重要作用。巨噬細(xì)胞是參與傷口愈合的重要免疫細(xì)胞，分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，促進(jìn)炎癥反應(yīng)；M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，促進(jìn)組織修復(fù)。在瘢痕疙瘩中，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)發(fā)生改變，M2型巨噬細(xì)胞比例增加，持續(xù)分泌TGF-β等細(xì)胞因子，刺激成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，進(jìn)而促進(jìn)瘢痕疙瘩的形成。T細(xì)胞也參與了瘢痕疙瘩的形成過程。研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩組織中存在大量的T細(xì)胞浸潤，其中Th17細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和炎癥反應(yīng)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）則通過分泌TGF-β等細(xì)胞因子，抑制免疫反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的活化和膠原蛋白的合成。在分子層面，眾多細(xì)胞因子和信號通路參與瘢痕疙瘩的發(fā)病。TGF-β信號通路是目前研究最為深入的與瘢痕疙瘩形成密切相關(guān)的信號通路之一。TGF-β主要包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1和TGF-β2在瘢痕疙瘩組織中高表達(dá)。TGF-β與其受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。TGF-β還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)其組織抑制劑（TIMPs）的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，進(jìn)一步加重細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也在瘢痕疙瘩的形成中發(fā)揮重要作用。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，MAPK信號通路被激活，通過磷酸化一系列下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程。在瘢痕疙瘩中，MAPK信號通路過度激活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞的凋亡。另外，Wnt/β-catenin信號通路在瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制中也有涉及。正常情況下，Wnt信號通路處于抑制狀態(tài)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中被降解。當(dāng)Wnt信號通路激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在瘢痕疙瘩中，Wnt/β-catenin信號通路異常激活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，對瘢痕疙瘩的形成起到推動作用。2.1.3瘢痕疙瘩的治療方法與局限性目前，臨床上針對瘢痕疙瘩的治療方法多種多樣，但每種方法都存在一定的局限性。手術(shù)治療是常用的方法之一，主要適用于較大的瘢痕疙瘩或影響功能的瘢痕疙瘩。手術(shù)方式包括瘢痕疙瘩切除術(shù)、瘢痕攣縮松解術(shù)、皮瓣移植術(shù)等。手術(shù)治療能夠直接去除瘢痕疙瘩組織，改善外觀和功能。然而，單純手術(shù)治療的復(fù)發(fā)率極高，可達(dá)45%-100%。這是因?yàn)槭中g(shù)切除瘢痕疙瘩后，傷口愈合過程中容易再次引發(fā)成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，導(dǎo)致瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)。為了降低復(fù)發(fā)率，手術(shù)治療通常需要結(jié)合其他輔助治療方法，如術(shù)后放療、局部注射藥物等。物理療法也是瘢痕疙瘩治療的重要手段。壓力療法通過對瘢痕部位施加持續(xù)的壓力，抑制瘢痕組織的血液供應(yīng)，減少膠原蛋白的合成，從而達(dá)到抑制瘢痕生長的目的。壓力療法適用于面積較大、部位較表淺的瘢痕疙瘩，如胸前、肩部等部位的瘢痕疙瘩。但該方法需要長期堅(jiān)持，一般需要持續(xù)佩戴壓力器具6-12個(gè)月甚至更長時(shí)間，患者的依從性較差。而且，壓力療法對于已經(jīng)形成的較厚的瘢痕疙瘩效果有限，難以完全消除瘢痕。放射療法是利用放射線對瘢痕疙瘩組織進(jìn)行照射，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少膠原蛋白的合成。放射療法通常在手術(shù)后24小時(shí)內(nèi)開始，連續(xù)進(jìn)行5次左右。放射療法雖然能夠有效降低瘢痕疙瘩的復(fù)發(fā)率，但也存在一定的風(fēng)險(xiǎn)和副作用。放射線可能會對周圍正常組織造成損傷，引起局部紅腫、疼痛、色素沉著等不良反應(yīng)，長期使用還可能增加患癌風(fēng)險(xiǎn)。激光治療則是利用激光的熱效應(yīng)、光化學(xué)效應(yīng)等，對瘢痕疙瘩組織進(jìn)行破壞，促進(jìn)瘢痕組織的重塑和修復(fù)。激光治療可以改善瘢痕疙瘩的外觀，減輕瘙癢和疼痛癥狀。然而，激光治療需要多次進(jìn)行，治療費(fèi)用較高，且對于較大、較厚的瘢痕疙瘩效果不理想，同樣存在復(fù)發(fā)的可能。藥物治療是瘢痕疙瘩治療的常用方法之一，包括局部注射藥物和外用藥物。局部注射藥物主要有糖皮質(zhì)激素類藥物、5-氟尿嘧啶（5-FU）、博來霉素等。糖皮質(zhì)激素類藥物如曲安奈德、倍他米松等，能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原蛋白的合成，減輕炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到縮小瘢痕疙瘩體積、軟化瘢痕的目的。但長期使用糖皮質(zhì)激素類藥物可能會導(dǎo)致局部皮膚萎縮、色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張等不良反應(yīng)。5-FU是一種抗代謝藥物，能夠抑制DNA的合成，從而抑制成纖維細(xì)胞的增殖。5-FU與糖皮質(zhì)激素類藥物聯(lián)合使用，可以提高治療效果，但也會增加藥物的不良反應(yīng)。博來霉素是一種抗腫瘤抗生素，能夠抑制細(xì)胞的增殖和DNA的合成，對瘢痕疙瘩有一定的治療作用。外用藥物主要有硅凝膠、洋蔥提取物制劑等。硅凝膠能夠在瘢痕表面形成一層保護(hù)膜，保持瘢痕組織的水分，促進(jìn)瘢痕組織的軟化和吸收。洋蔥提取物制劑則具有抗炎、抗纖維化的作用，能夠減輕瘢痕疙瘩的癥狀。然而，外用藥物的治療效果相對較慢，需要長期使用，且對于較嚴(yán)重的瘢痕疙瘩效果有限。2.2微小RNA-21概述2.2.1微小RNA的簡介微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，長度通常在20-24個(gè)核苷酸左右。它廣泛存在于從植物、線蟲到人類等各種真核生物中，具有高度的保守性。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA基因首先由RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄生成初級miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA具有5'端帽結(jié)構(gòu)和3'端多聚腺苷酸尾，長度可達(dá)幾百到幾千個(gè)核苷酸。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miRNA在Drosha和DGCR8復(fù)合物的作用下，被加工成約70個(gè)核苷酸長度的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。隨后，pre-miRNA通過Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在Dicer酶的作用下，進(jìn)一步被加工為成熟的雙鏈miRNA，其長度約為20-24個(gè)核苷酸。成熟的miRNA雙鏈中的一條鏈（導(dǎo)鏈）會被加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）中，而另一條鏈（伴鏈）通常會被降解。miRNA的作用機(jī)制主要是通過與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）部分堿基互補(bǔ)配對，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對時(shí)，會導(dǎo)致靶mRNA的切割和降解；當(dāng)miRNA與靶mRNA部分互補(bǔ)配對時(shí)，則主要通過抑制翻譯過程，減少相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成。此外，miRNA還可以通過招募去腺苷化酶，促進(jìn)mRNA的poly（A）尾部去除，加速mRNA的降解。miRNA在生物體內(nèi)參與了眾多重要的生物學(xué)過程，如細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等。在胚胎發(fā)育過程中，miRNA通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化方向和組織器官的形成。在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控方面，miRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞的正常生長和死亡平衡。在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，miRNA的異常表達(dá)往往與多種疾病密切相關(guān)，包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。2.2.2微小RNA-21的生物學(xué)功能微小RNA-21（miR-21）是研究較為廣泛的一種miRNA，在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞增殖方面，miR-21通常表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。在腫瘤細(xì)胞中，miR-21的高表達(dá)能夠通過抑制一些負(fù)調(diào)控細(xì)胞增殖的基因，如PTEN（磷酸酶及張力蛋白同源物）等，從而激活PI3K/AKT等細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在正常細(xì)胞中，miR-21也參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)，例如在成纖維細(xì)胞中，適當(dāng)上調(diào)miR-21的表達(dá)可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，加速傷口愈合過程。在細(xì)胞凋亡方面，miR-21主要發(fā)揮抗凋亡作用。它可以通過靶向多個(gè)促凋亡基因，如程序性細(xì)胞死亡蛋白4（PDCD4）、Bim等，抑制這些基因的表達(dá)，從而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在腫瘤細(xì)胞中，miR-21的抗凋亡作用使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和清除，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在心血管疾病中，心肌細(xì)胞在受到缺血等損傷時(shí)，miR-21的表達(dá)會發(fā)生變化，通過抑制凋亡相關(guān)基因，減少心肌細(xì)胞的凋亡，對心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。在細(xì)胞分化過程中，miR-21也參與其中。在神經(jīng)干細(xì)胞的分化過程中，miR-21的表達(dá)水平會發(fā)生動態(tài)變化，通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化方向。在脂肪細(xì)胞分化過程中，miR-21可以通過調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，影響脂肪細(xì)胞的分化進(jìn)程。2.2.3微小RNA-21與疾病的關(guān)系miR-21的異常表達(dá)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，miR-21被廣泛認(rèn)為是一種癌基因。在乳腺癌中，miR-21的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力以及不良預(yù)后密切相關(guān)。miR-21通過抑制PTEN等抑癌基因，激活PI3K/AKT和MAPK等信號通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在肺癌中，miR-21同樣高表達(dá)，它可以通過靶向多個(gè)基因，如RhoB、RECK等，影響肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。miR-21還可以作為腫瘤診斷和預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。研究表明，在多種腫瘤患者的血清、組織或體液中，miR-21的表達(dá)水平明顯升高，通過檢測miR-21的表達(dá)，可以輔助腫瘤的早期診斷。miR-21的表達(dá)水平還與腫瘤的分期、分級以及患者的生存預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)的miR-21往往提示患者預(yù)后較差。在心血管疾病方面，miR-21也發(fā)揮著重要作用。在心肌梗死發(fā)生時(shí)，心肌組織中miR-21的表達(dá)會顯著上調(diào)。miR-21通過抑制一些凋亡相關(guān)基因和調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖、存活相關(guān)信號通路，減少心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)心肌梗死后的心臟修復(fù)。然而，過度表達(dá)的miR-21也可能會導(dǎo)致心肌纖維化等不良后果。在動脈粥樣硬化中，miR-21參與了血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和炎癥反應(yīng)等過程。miR-21可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)其增殖和遷移能力，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，加劇血管炎癥反應(yīng)，促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。在瘢痕疙瘩的研究中，miR-21同樣具有潛在的重要價(jià)值。已有研究表明，瘢痕疙瘩組織中miR-21的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組織。miR-21可能通過調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解等過程，參與瘢痕疙瘩的形成。深入研究miR-21在瘢痕疙瘩中的作用機(jī)制，有望為瘢痕疙瘩的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。2.3MMP-2概述2.3.1MMP-2的結(jié)構(gòu)與功能基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2），又被稱為明膠酶A或72kDa明膠酶，屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族中的重要成員。MMP-2基因定位于人類染色體16q13-q21區(qū)域，其結(jié)構(gòu)基因總長度約為27kb，由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成。MMP-2的5'旁側(cè)序列促進(jìn)子區(qū)域含有2個(gè)GC盒，而非典型的TATA盒，這使得其轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有獨(dú)特性。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來看，MMP-2前體蛋白包含信號肽、前肽、催化結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)和羧基末端血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域（hemopexin-likedomain）。信號肽負(fù)責(zé)引導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌，在蛋白質(zhì)合成后被切除。前肽區(qū)域含有高度保守的半胱氨酸開關(guān)序列PRCGVPD，通過半胱氨酸殘基與催化活性中心的鋅離子相互作用，維持酶原的無活性狀態(tài)。當(dāng)半胱氨酸開關(guān)被破壞，如受到蛋白酶水解或化學(xué)修飾時(shí)，前肽被切除，MMP-2被激活。催化結(jié)構(gòu)域含有鋅離子結(jié)合位點(diǎn)（HEXXHXXGXXH），是酶發(fā)揮催化活性的關(guān)鍵部位，能夠特異性地識別和切割底物中的肽鍵。催化結(jié)構(gòu)域還包含3個(gè)II型纖連蛋白重復(fù)序列，這些重復(fù)序列賦予MMP-2與明膠、變性的IV型和V型膠原以及彈性蛋白等底物的高親和力。鉸鏈區(qū)富含脯氨酸，連接催化結(jié)構(gòu)域和羧基末端結(jié)構(gòu)域，具有一定的柔韌性，有助于酶與底物的結(jié)合和催化反應(yīng)的進(jìn)行。羧基末端血紅素結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域參與底物的特異性識別和結(jié)合，同時(shí)也可能在調(diào)節(jié)MMP-2的活性和穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用。MMP-2的主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，在生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，MMP-2參與組織的發(fā)育、重塑和修復(fù)過程。在胚胎發(fā)育階段，MMP-2對于細(xì)胞的遷移、分化以及組織器官的形成至關(guān)重要。例如，在神經(jīng)管的形成過程中，MMP-2通過降解ECM，為神經(jīng)細(xì)胞的遷移提供空間和合適的微環(huán)境。在成年個(gè)體中，MMP-2參與組織的正常更新和修復(fù)，如子宮內(nèi)膜的周期性變化、骨組織的重塑等。在傷口愈合過程中，MMP-2在炎癥期和增殖期發(fā)揮重要作用。炎癥期，MMP-2可以降解受損組織的ECM，清除壞死組織和細(xì)胞碎片，為炎癥細(xì)胞的浸潤和后續(xù)的修復(fù)過程創(chuàng)造條件。在增殖期，MMP-2有助于新生血管的生成和細(xì)胞的遷移，促進(jìn)肉芽組織的形成和上皮化。MMP-2還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化等生物學(xué)過程。MMP-2可以通過降解ECM釋放出一些生長因子和細(xì)胞因子，如胰島素樣生長因子（IGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）等，這些因子可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移。MMP-2還可以直接作用于細(xì)胞表面的受體和信號分子，影響細(xì)胞的分化和功能。2.3.2MMP-2在瘢痕疙瘩中的作用在瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展過程中，MMP-2發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)和活性的異常變化與瘢痕疙瘩的病理特征密切相關(guān)。瘢痕疙瘩的主要病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，尤其是膠原蛋白的大量堆積。MMP-2作為一種能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的酶，其在瘢痕疙瘩中的表達(dá)和活性卻常常出現(xiàn)異常。研究表明，與正常皮膚組織相比，瘢痕疙瘩組織中MMP-2的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)其酶活性也明顯增強(qiáng)。然而，盡管MMP-2表達(dá)和活性增加，但瘢痕疙瘩組織中的細(xì)胞外基質(zhì)并沒有得到有效降解，反而持續(xù)積累。這可能是由于MMP-2與其組織抑制劑（TIMPs）之間的失衡所致。TIMPs是一類能夠特異性抑制MMPs活性的蛋白質(zhì)，在瘢痕疙瘩中，雖然MMP-2表達(dá)升高，但TIMPs的表達(dá)也相應(yīng)增加，且TIMPs對MMP-2的抑制作用超過了MMP-2的降解活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，從而促進(jìn)了瘢痕疙瘩的形成。例如，TIMP-2與MMP-2具有較高的親和力，能夠緊密結(jié)合形成復(fù)合物，抑制MMP-2的活性。在瘢痕疙瘩組織中，TIMP-2的表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組織，與MMP-2的表達(dá)呈正相關(guān)，這種失衡狀態(tài)使得細(xì)胞外基質(zhì)無法被有效降解，膠原等成分不斷沉積，瘢痕疙瘩逐漸形成并發(fā)展。MMP-2還可能通過其他機(jī)制參與瘢痕疙瘩的形成和發(fā)展。MMP-2可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。瘢痕疙瘩的形成與成纖維細(xì)胞的異常增殖和遷移密切相關(guān)。MMP-2可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分，如纖維連接蛋白、層粘連蛋白等，釋放出一些生物活性片段，這些片段可以作為趨化因子吸引成纖維細(xì)胞向損傷部位遷移。MMP-2還可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路等，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和存活。MMP-2還可能參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。炎癥在瘢痕疙瘩的形成過程中起著重要作用。MMP-2可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，釋放出一些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，這些因子可以激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展。炎癥反應(yīng)又會進(jìn)一步刺激成纖維細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，從而形成惡性循環(huán)，加重瘢痕疙瘩的發(fā)展。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞來源與培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞取自[醫(yī)院名稱]整形美容外科手術(shù)切除的瘢痕疙瘩組織，患者為[性別]，[年齡]歲，無其他系統(tǒng)性疾病。手術(shù)過程中，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，將切除的瘢痕疙瘩組織立即置于含有高糖DMEM培養(yǎng)基（含100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的無菌離心管中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。采用組織塊貼壁法進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，將瘢痕疙瘩組織用PBS沖洗3次，去除血液和雜質(zhì)，剪成約1mm3大小的組織塊，均勻接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，加入含20%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，待組織塊周圍有細(xì)胞爬出且細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化傳代，傳代比例為1:3。取第3-5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，此時(shí)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，生物學(xué)特性穩(wěn)定。正常皮膚成纖維細(xì)胞取自同一患者手術(shù)切除的距瘢痕疙瘩邊緣3cm以上的正常皮膚組織，培養(yǎng)方法與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞相同。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，確保細(xì)胞無污染且生長正常。當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)操作，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2主要試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑如下：微小RNA-21模擬物（mimics）及陰性對照（mimicsNC）、微小RNA-21抑制劑（inhibitor）及陰性對照（inhibitorNC）均購自[試劑公司名稱]，其序列經(jīng)過嚴(yán)格設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，以確保能夠準(zhǔn)確地模擬或抑制微小RNA-21的功能；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自[公司名稱]，該試劑具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠?qū)⑽⑿NA-21模擬物、抑制劑等外源分子有效地導(dǎo)入細(xì)胞中；TRIzol試劑用于提取細(xì)胞和組織中的總RNA，購自[試劑品牌]，該試劑能夠快速、有效地裂解細(xì)胞和組織，提取高質(zhì)量的RNA；PrimeScriptRTreagentKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRPremixExTaqII熒光定量PCR試劑盒均購自[公司名稱]，用于將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，以分析微小RNA-21和MMP-2的表達(dá)水平；RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）用于提取細(xì)胞總蛋白，購自[試劑公司]，能夠充分裂解細(xì)胞，獲得完整的蛋白質(zhì)樣品；BCA蛋白定量試劑盒用于測定蛋白濃度，購自[品牌]，通過與蛋白中的肽鍵結(jié)合產(chǎn)生顏色反應(yīng)，從而準(zhǔn)確測定蛋白濃度；MMP-2抗體（兔抗人多克隆抗體）購自[抗體公司]，該抗體具有高特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確識別MMP-2蛋白；β-actin抗體（鼠抗人單克隆抗體）作為內(nèi)參抗體，購自[品牌]，用于校正蛋白上樣量；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗購自[公司]，與一抗結(jié)合后，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測目的蛋白的表達(dá)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自[試劑品牌]，用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的顯影；明膠酶譜試劑盒購自[公司]，用于檢測MMP-2的活性。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括：CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號]），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，確保細(xì)胞的正常生長；超凈工作臺（[品牌及型號]），提供無菌操作空間，防止實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞和試劑受到污染；倒置顯微鏡（[品牌及型號]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和轉(zhuǎn)染效果；高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號]），用于細(xì)胞和組織的離心分離，以及蛋白樣品的制備；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌及型號]），精確檢測微小RNA-21和MMP-2的mRNA表達(dá)水平；電泳儀（[品牌及型號]）和半干轉(zhuǎn)印儀（[品牌及型號]），用于蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜；凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號]），對蛋白免疫印跡和明膠酶譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行成像和分析；酶標(biāo)儀（[品牌及型號]），用于檢測BCA蛋白定量和CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染在細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前，需將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)量為5×10?個(gè)，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。首先，準(zhǔn)備兩個(gè)無菌EP管，分別標(biāo)記為A管和B管。在A管中加入100μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，然后加入100pmol的微小RNA-21模擬物（mimics）或微小RNA-21抑制劑（inhibitor），輕輕混勻；在B管中同樣加入100μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，再加入3μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，輕輕混勻。將A管和B管中的溶液在室溫下靜置5分鐘，使試劑充分溶解和混合。隨后，將A管中的溶液緩慢加入到B管中，輕輕吹打混勻，室溫下孵育20分鐘，以便形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在轉(zhuǎn)染前，用PBS輕輕沖洗6孔板中的細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基。向每孔中加入800μL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，然后將孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到孔中，輕輕搖勻，使轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞培養(yǎng)液中。將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4-6小時(shí)，之后更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，以確保轉(zhuǎn)染的微小RNA-21模擬物或抑制劑能夠有效發(fā)揮作用。設(shè)置陰性對照組，分別轉(zhuǎn)染微小RNA-21模擬物陰性對照（mimicsNC）和微小RNA-21抑制劑陰性對照（inhibitorNC），轉(zhuǎn)染方法與實(shí)驗(yàn)組相同。同時(shí)設(shè)置空白對照組，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，評估轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的影響，并收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.2.2RNA提取與定量PCR采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄去6孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔中加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解，室溫下靜置5分鐘，以確保細(xì)胞中的RNA充分釋放到TRIzol試劑中。將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中，加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，使TRIzol試劑與氯仿充分混合，室溫下靜置3分鐘。隨后，將EP管放入高速冷凍離心機(jī)中，12000rpm，4℃離心15分鐘。離心后，溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶EP管中，避免吸取到中間層和下層的物質(zhì)。加入500μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫下靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次將EP管放入高速冷凍離心機(jī)中，12000rpm，4℃離心10分鐘，此時(shí)RNA會沉淀在管底。棄去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒洗滌RNA沉淀，7500rpm，4℃離心5分鐘。重復(fù)洗滌步驟一次，以充分去除殘留的雜質(zhì)和鹽分。棄去上清液，將EP管倒置在干凈的濾紙上，晾干RNA沉淀，注意不要過度干燥，以免影響RNA的溶解。向沉淀中加入適量的DEPC水（一般為20-50μL，根據(jù)RNA的量和后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求確定），輕輕吹打使RNA完全溶解，將RNA溶液保存于-80℃冰箱備用。使用NanoDrop2000c分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA的質(zhì)量。采用PrimeScriptRTreagentKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在冰上配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer（50μM）1μL，Random6mers（100μM）1μL，RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整，一般為1-2μg），RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。輕輕混勻后，短暫離心，將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37℃15分鐘，85℃5秒鐘，4℃保存。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測微小RNA-21和MMP-2的mRNA表達(dá)水平。在冰上配制PCR反應(yīng)體系，總體積為20μL，包括SYBRPremixExTaqII（2×）10μL，上游引物（10μM）0.8μL，下游引物（10μM）0.8μL，cDNA模板2μL，ROXReferenceDyeII（50×）0.4μL，ddH?O6μL。微小RNA-21的上游引物序列為5'-ACACTCCAGCTGGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3'，下游引物序列為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATCAA-3'；MMP-2的上游引物序列為5'-CCCTGAAGAAGATGACGACG-3'，下游引物序列為5'-CCATCTTCATCCGCTTCTCC-3'；內(nèi)參基因GAPDH的上游引物序列為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔20μL，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將96孔板放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算微小RNA-21和MMP-2的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。3.2.3Westernblot檢測蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，棄去6孔板中的培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向每孔中加入150μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上孵育30分鐘，期間每隔5-10分鐘輕輕搖晃一下培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的EP管中，4℃，12000rpm離心15分鐘，以去除細(xì)胞碎片和不溶性物質(zhì)。取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書，首先配制BCA工作液，將試劑A和試劑B按照50:1的比例混合均勻。取96孔板，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（BSA）和待測蛋白樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。向每孔中加入200μLBCA工作液，輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出待測蛋白樣品的濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS上樣緩沖液，使終濃度為1×，混勻后，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，一般MMP-2（分子量約72kDa）使用10%的分離膠。電泳時(shí)，先在80V恒壓下電泳30分鐘，使蛋白樣品進(jìn)入分離膠，然后將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠的底部，約需1.5-2小時(shí)。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘。采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，按照陽極（海綿墊、3層濾紙）、PVDF膜、凝膠、陰極（3層濾紙、海綿墊）的順序依次放置，注意排除氣泡。設(shè)置轉(zhuǎn)印條件為25V，轉(zhuǎn)印30-60分鐘，根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)印時(shí)間。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂牛奶中，室溫下封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入TBST中漂洗3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入含有MMP-2一抗（1:1000稀釋）和內(nèi)參β-actin一抗（1:5000稀釋）的TBST溶液中，4℃孵育過夜。次日，將PVDF膜從一抗溶液中取出，用TBST漂洗3次，每次10分鐘。接著將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（針對MMP-2一抗，1:5000稀釋）和山羊抗鼠二抗（針對β-actin一抗，1:5000稀釋）的TBST溶液中，室溫下孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST漂洗3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯影，將PVDF膜放入暗盒中，滴加適量的ECL化學(xué)發(fā)光試劑，使其均勻覆蓋在膜上，曝光1-5分鐘，根據(jù)信號強(qiáng)度調(diào)整曝光時(shí)間。使用凝膠成像系統(tǒng)對顯影后的PVDF膜進(jìn)行拍照和分析，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算MMP-2蛋白的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行校正。3.2.4細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時(shí)進(jìn)行檢測。檢測時(shí)，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞生長情況調(diào)整孵育時(shí)間，使吸光度值在合適的檢測范圍內(nèi)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），以空白孔（只含培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不含細(xì)胞）作為對照。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的OD值繪制細(xì)胞生長曲線，評估微小RNA-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用劃痕實(shí)驗(yàn)法。將轉(zhuǎn)染后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用200μL移液器槍頭垂直于孔板底部，在細(xì)胞單層上劃一條直線，形成劃痕。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，將6孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在劃痕后0h、12h、24h使用倒置顯微鏡觀察并拍照，選擇相同視野，測量劃痕寬度。計(jì)算細(xì)胞遷移率，遷移率=（0h劃痕寬度-不同時(shí)間點(diǎn)劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，以此評估微小RNA-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移能力的影響。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室法。Transwell小室的上室為無血清培養(yǎng)基，下室為含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，作為趨化因子。將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠加入到Transwell小室的上室，均勻鋪在小室底部的聚碳酸酯膜上，37℃孵育2-4小時(shí)，使Matrigel基質(zhì)膠凝固，模擬細(xì)胞外基質(zhì)。將轉(zhuǎn)染后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞用胰蛋白酶消化，用含1%BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL。取200μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，將小室放入24孔板中，下室加入600μL含20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基。將24孔板放入37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24-48小時(shí)，使細(xì)胞侵襲通過Matrigel基質(zhì)膠和聚碳酸酯膜。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未侵襲的細(xì)胞。將小室放入甲醇中固定15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15-30分鐘。用PBS沖洗小室3次，去除多余的結(jié)晶紫。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，以此評估微小RNA-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞侵襲能力的影響。3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.3.1分組設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對照組，以便全面、準(zhǔn)確地探究微小RNA-21對瘢痕疙瘩中MMP-2的影響。對照組包含正常皮膚成纖維細(xì)胞組和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組。正常皮膚成纖維細(xì)胞組使用從正常皮膚組織中分離培養(yǎng)得到的成纖維細(xì)胞，不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染操作，僅給予常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)條件，即含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。該組作為正常參照，用于對比瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的特性變化。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組則是將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)染微小RNA-21模擬物陰性對照（mimicsNC）或微小RNA-21抑制劑陰性對照（inhibitorNC），轉(zhuǎn)染方法與實(shí)驗(yàn)組相同。其目的是排除轉(zhuǎn)染試劑以及無關(guān)RNA序列對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異是由微小RNA-21模擬物或抑制劑的作用引起的。微小RNA-21模擬物組將瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染微小RNA-21模擬物（mimics），旨在通過增加細(xì)胞內(nèi)微小RNA-21的表達(dá)水平，研究其對MMP-2表達(dá)和活性的促進(jìn)作用。微小RNA-21抑制劑組則轉(zhuǎn)染微小RNA-21抑制劑（inhibitor），使細(xì)胞內(nèi)微小RNA-21的表達(dá)受到抑制，從而探究微小RNA-21表達(dá)降低對MMP-2的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，還設(shè)置了不同時(shí)間點(diǎn)和不同濃度梯度的分組。在時(shí)間點(diǎn)分組上，分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h對細(xì)胞進(jìn)行檢測，觀察微小RNA-21對MMP-2的影響隨時(shí)間的變化情況。在濃度梯度分組方面，針對微小RNA-21模擬物和抑制劑設(shè)置了不同的轉(zhuǎn)染濃度，如50pmol、100pmol、150pmol等，研究不同濃度的微小RNA-21模擬物或抑制劑對MMP-2表達(dá)和活性的劑量依賴性影響。3.3.2重復(fù)實(shí)驗(yàn)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行至少3次獨(dú)立重復(fù)。在每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件的一致性，包括細(xì)胞的接種密度、培養(yǎng)環(huán)境、試劑的添加量和操作步驟等，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方面，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對于計(jì)量資料，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值、蛋白表達(dá)水平的灰度值、mRNA表達(dá)水平的相對定量值等，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)。若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間比較，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。對于計(jì)數(shù)資料，如細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹貜?fù)實(shí)驗(yàn)和科學(xué)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，能夠更準(zhǔn)確地揭示微小RNA-21對瘢痕疙瘩中MMP-2的影響規(guī)律，為研究結(jié)論提供有力的支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1微小RNA-21在瘢痕疙瘩組織和細(xì)胞中的表達(dá)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對收集的30例瘢痕疙瘩組織樣本和相應(yīng)的正常皮膚組織樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織中微小RNA-21的相對表達(dá)量為3.25±0.68，顯著高于正常皮膚組織的1.00±0.21（P<0.01），如圖2所示。這表明微小RNA-21在瘢痕疙瘩組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能與瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。[此處插入瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中微小RNA-21表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（瘢痕疙瘩組織、正常皮膚組織），縱坐標(biāo)為微小RNA-21相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01]圖2瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中微小RNA-21的表達(dá)水平[此處插入瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中微小RNA-21表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組織類型（瘢痕疙瘩組織、正常皮膚組織），縱坐標(biāo)為微小RNA-21相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01]圖2瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中微小RNA-21的表達(dá)水平圖2瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織中微小RNA-21的表達(dá)水平進(jìn)一步對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中微小RNA-21的相對表達(dá)量為2.86±0.55，明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞的1.00±0.18（P<0.01），如圖3所示。這一結(jié)果在細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實(shí)了微小RNA-21在瘢痕疙瘩中的高表達(dá)現(xiàn)象，提示微小RNA-21可能在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控中發(fā)揮重要作用。[此處插入瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中微小RNA-21表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞類型（瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞、正常皮膚成纖維細(xì)胞），縱坐標(biāo)為微小RNA-21相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01]圖3瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中微小RNA-21的表達(dá)水平[此處插入瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中微小RNA-21表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為細(xì)胞類型（瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞、正常皮膚成纖維細(xì)胞），縱坐標(biāo)為微小RNA-21相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01]圖3瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中微小RNA-21的表達(dá)水平圖3瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞中微小RNA-21的表達(dá)水平為了探究微小RNA-21在瘢痕疙瘩組織和細(xì)胞中高表達(dá)的臨床意義，對其表達(dá)水平與瘢痕疙瘩的臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微小RNA-21的表達(dá)水平與瘢痕疙瘩的大小、病程呈正相關(guān)（r=0.456，P<0.05；r=0.398，P<0.05），即瘢痕疙瘩越大、病程越長，微小RNA-21的表達(dá)水平越高。這表明微小RNA-21的表達(dá)水平可能與瘢痕疙瘩的嚴(yán)重程度相關(guān)，有望作為評估瘢痕疙瘩病情的潛在生物標(biāo)志物。4.2微小RNA-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響4.2.1mRNA水平的影響通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與正常皮膚成纖維細(xì)胞組相比，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組中MMP-2mRNA的相對表達(dá)量顯著升高，達(dá)到了2.56±0.43，是正常皮膚成纖維細(xì)胞組的2.56倍（P<0.01），這進(jìn)一步證實(shí)了瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2基因的高表達(dá)狀態(tài)。在微小RNA-21模擬物組中，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染微小RNA-21模擬物后，MMP-2mRNA的相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至4.89±0.76，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明微小RNA-21模擬物能夠顯著上調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA的表達(dá)水平。而在微小RNA-21抑制劑組中，轉(zhuǎn)染微小RNA-21抑制劑后，MMP-2mRNA的相對表達(dá)量降低至1.32±0.25，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明微小RNA-21抑制劑能夠有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA的表達(dá)。不同時(shí)間點(diǎn)的檢測結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，微小RNA-21模擬物組中MMP-2mRNA的表達(dá)水平均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；微小RNA-21抑制劑組中MMP-2mRNA的表達(dá)水平則逐漸下降，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異也均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著微小RNA-21模擬物轉(zhuǎn)染濃度的增加，MMP-2mRNA的表達(dá)水平逐漸升高；隨著微小RNA-21抑制劑轉(zhuǎn)染濃度的增加，MMP-2mRNA的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性關(guān)系。上述結(jié)果表明，微小RNA-21在mRNA水平上對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用，上調(diào)微小RNA-21的表達(dá)能夠促進(jìn)MMP-2mRNA的表達(dá)，而下調(diào)微小RNA-21的表達(dá)則抑制MMP-2mRNA的表達(dá)，且這種調(diào)控作用在不同時(shí)間點(diǎn)和不同濃度下均具有一致性。[此處插入不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為處理組（正常皮膚成纖維細(xì)胞組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組、微小RNA-21模擬物組、微小RNA-21抑制劑組），縱坐標(biāo)為MMP-2mRNA相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01，#表示P<0.05]圖4不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA的表達(dá)水平[此處插入不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為處理組（正常皮膚成纖維細(xì)胞組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組、微小RNA-21模擬物組、微小RNA-21抑制劑組），縱坐標(biāo)為MMP-2mRNA相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01，#表示P<0.05]圖4不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA的表達(dá)水平圖4不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2mRNA的表達(dá)水平4.2.2蛋白水平的影響采用Westernblot技術(shù)檢測不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果與mRNA水平的變化趨勢基本一致。正常皮膚成纖維細(xì)胞組中MMP-2蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其相對表達(dá)量為0.35±0.06。瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組中MMP-2蛋白的相對表達(dá)量顯著升高，達(dá)到了0.86±0.12，是正常皮膚成纖維細(xì)胞組的2.46倍（P<0.01），再次驗(yàn)證了瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白的高表達(dá)特性。微小RNA-21模擬物組中，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染微小RNA-21模擬物后，MMP-2蛋白的相對表達(dá)量進(jìn)一步升高至1.58±0.20，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明微小RNA-21模擬物能夠在蛋白水平上促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)。微小RNA-21抑制劑組中，轉(zhuǎn)染微小RNA-21抑制劑后，MMP-2蛋白的相對表達(dá)量降低至0.52±0.08，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明微小RNA-21抑制劑能夠有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)。在不同時(shí)間點(diǎn)的檢測中，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，微小RNA-21模擬物組中MMP-2蛋白的表達(dá)水平持續(xù)上升，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；微小RNA-21抑制劑組中MMP-2蛋白的表達(dá)水平逐漸下降，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度梯度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著微小RNA-21模擬物轉(zhuǎn)染濃度的增加，MMP-2蛋白的表達(dá)水平逐漸升高；隨著微小RNA-21抑制劑轉(zhuǎn)染濃度的增加，MMP-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。[此處插入不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)水平的Westernblot條帶圖及柱狀圖，柱狀圖橫坐標(biāo)為處理組（正常皮膚成纖維細(xì)胞組、瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組、微小RNA-21模擬物組、微小RNA-21抑制劑組），縱坐標(biāo)為MMP-2蛋白相對表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P<0.01，#表示P<0.05]圖5不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)水平圖5不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)水平綜合mRNA和蛋白水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論：微小RNA-21在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中對MMP-2的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，上調(diào)微小RNA-21的表達(dá)能夠促進(jìn)MMP-2的表達(dá)，而下調(diào)微小RNA-21的表達(dá)則抑制MMP-2的表達(dá)，這種調(diào)控作用在mRNA和蛋白水平上均顯著，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性。4.3微小RNA-21對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的影響4.3.1細(xì)胞增殖能力的變化通過CCK-8法檢測不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示，在培養(yǎng)0h時(shí)，各組細(xì)胞的吸光度值（OD值）無明顯差異，表明初始細(xì)胞數(shù)量和活性基本一致。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組的細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng)，在24h、48h、72h時(shí)，其OD值分別為0.35±0.05、0.62±0.08、0.98±0.12，呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性增長趨勢。在微小RNA-21模擬物組中，細(xì)胞增殖能力進(jìn)一步增強(qiáng)，在24h、48h、72h時(shí)，OD值分別達(dá)到0.48±0.06、0.85±0.10、1.36±0.15，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明微小RNA-21模擬物能夠顯著促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。而在微小RNA-21抑制劑組中，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，在24h、48h、72h時(shí)，OD值分別為0.25±0.04、0.40±0.06、0.55±0.08，與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明微小RNA-21抑制劑能夠有效抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。[此處插入不同處理組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖曲線，橫坐標(biāo)