幽門螺桿菌(H.pylori)被世界衛(wèi)生組織列為一類致癌物，研究顯示90%的胃癌與H.pylori感染有關(guān)。根除H.pylori可有效減少消準(zhǔn)確和可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，成為識(shí)別H.pylori抗菌藥大量研究證實(shí)幽門螺桿菌(Helicoba與胃炎、消化性潰瘍、胃癌、MALT淋巴瘤等多種胃腸道內(nèi)外良惡性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)1,2,根除H.pylori可降低胃癌的遠(yuǎn)期發(fā)病率3。抗菌藥物除菌治療是根除H.pylori的主要治療方法4],然而，治療H.pylori的主要抗菌藥物如克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑等耐藥形變、誘導(dǎo)自噬等6。最新的指南均建議患者在初次或再次治療前應(yīng)用藥敏檢測(cè)指導(dǎo)抗菌藥物選擇，尤其是在克拉霉素耐藥高發(fā)地區(qū)7。梯度法(E-test)等83,需要經(jīng)胃鏡取得新鮮胃黏膜組織。然而，H.pylori作為一種革蘭陰性的微需氧菌，培養(yǎng)條件相對(duì)苛刻，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)達(dá)3~7d。另外，對(duì)H.pylori的藥敏檢測(cè)最低抑菌濃度值 (minimalinhibitoryconcentration,M基于此，H.pylori培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)無(wú)法常規(guī)開(kāi)展，臨床上需要更準(zhǔn)確、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的H.pylori耐藥性檢測(cè)手段。因此，各類分子生物學(xué)方法應(yīng)運(yùn)而生。本文介紹檢測(cè)H.pylori耐藥性的成熟的H.pylori根除治療方案通常包括1種抑酸劑、2種抗菌藥物，同時(shí)伴或不伴鉍劑。根據(jù)2018年WHO發(fā)布的數(shù)據(jù)5,雖然全球范圍內(nèi)四環(huán)素和阿莫西林的耐藥率仍<10%,但對(duì)克拉霉素、甲硝唑H.pylori成功率<80%,這使得指南均不推薦在高耐藥地區(qū)應(yīng)用克拉H.pylori的23SrRNA基因位點(diǎn)(如A2142G和A2143G等)突變現(xiàn)已被證明與克拉霉素耐藥有關(guān)，gyrA基因位點(diǎn)(如C261A/G、G271A/T、A272G等)突變與左氧氟沙星表型耐藥有關(guān)11?？死顾睾妥笱醴承堑谋硇湍退幒突蛲蛔円恢滦暂^高，幾乎完全是由于對(duì)突變基因的檢測(cè)可有效預(yù)測(cè)抗菌藥物耐藥性，從而指導(dǎo)H.pylori1.限制性核酸片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restrictionfragment從而判斷是否存在耐藥性突變。1996年，美國(guó)Versalovic等[13應(yīng)H.pylori克拉霉素耐藥相關(guān)的新突變。在2004年，巴西Ribeiro等[15];利用區(qū)別在于，它通過(guò)2次PCR反應(yīng)來(lái)放大目標(biāo)DNA序列。2003年，意糞便樣本進(jìn)行H.pylori鑒定及克拉霉素耐藥治療，發(fā)現(xiàn)個(gè)體化治療組的克拉霉素耐藥菌株的根除率為100%。3.等位基因特異性引物-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(allelespecificprimer-PCR,ASP-PCR):這種方法的核心在于引物設(shè)計(jì)，根據(jù)H.pylori耐藥基因的已知突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)等位基因特異性引物 (allelespecificprimer,ASP),其中一個(gè)引物的3′末端與突變型等位基因互補(bǔ)，另一個(gè)引物的3′末端與野生型等位基因互補(bǔ)。2007年Nakamura等19]建立了該方法，并用該方法檢測(cè)出H.pylori法快速檢測(cè)H.pylorigyrA基因突變，實(shí)現(xiàn)了短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行樣本中的H.pylori耐藥性。2023年Karmakar等[223開(kāi)發(fā)和評(píng)估一種4.PCR-線探針?lè)治?PCR-lineprobeassay,PCR-LiPA):這線探針，通過(guò)檢測(cè)這些探針的信號(hào)，可以識(shí)別出不同的耐藥基因型。1999年vanDoorn等[23開(kāi)發(fā)用于H.pylori耐藥檢測(cè)的研究型試劑盒，可檢測(cè)H.pylori對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥相關(guān)的2點(diǎn)突變情況。2001年，該課題組證實(shí)了23SrRNA基因突變和耐藥的表明PCR-LiPA可以準(zhǔn)確可靠地診斷H.pylori對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性因片段擴(kuò)增然后進(jìn)行溶解曲線分析的實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行H.pylori克拉霉素耐藥檢測(cè)。2002年0leastro等[26]建立了將實(shí)時(shí)定量PC共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)技術(shù)相結(jié)合的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了H.pylori分子檢測(cè)從定性到定量檢測(cè)的飛躍。2006年deFrancesco等[27將TaqMan阻突變系統(tǒng)PCR(amplificationrefractorymutationsystemPCR,ARMS-PCR),該方法能夠在單管檢測(cè)中直接同時(shí)實(shí)現(xiàn)H.以及克拉霉素和左氧氟沙星耐藥突變。2023年Zhao等[29建立起一種操作簡(jiǎn)便的TaqMan-MGB探針多重實(shí)時(shí)低了非特異性擴(kuò)增的可能性，可以檢測(cè)到非常低豐度的目標(biāo)序列。法可作為檢測(cè)H.pylori感染及克拉霉素敏感性的實(shí)項(xiàng)研究利用該方法檢測(cè)胃黏膜組織中H.pylori克拉霉素耐藥性，助H.pyloriDNA稀釋成不同濃度的稀釋液，分別加載到數(shù)字微滴PCR體系的微孔中。每個(gè)孔內(nèi)含有極少的核酸，使用特定引物擴(kuò)增H.pylori的耐藥相關(guān)基因。2018年Sun等34應(yīng)用此方法，定量檢測(cè)H.pylori23SrRNA基因突變情況。該技術(shù)(二)熒光原位雜交技術(shù)(fluorescentinsituhybridization,該方法針對(duì)H.pylori耐藥基因片段制備對(duì)應(yīng)的核酸探針，再用測(cè)具有相似的高敏感性。FISH可以在新鮮、石蠟包埋固定的胃黏膜組織上進(jìn)行，可靈活檢測(cè)H.pylori的耐藥性。但隨著諸多分子擴(kuò)增以上分子檢測(cè)方法僅能檢測(cè)少數(shù)常見(jiàn)且已知的耐藥突變位點(diǎn)，利用Sanger測(cè)序確定了日本地區(qū)的左氧氟沙星原發(fā)性耐藥主要與Sanger測(cè)序可以逐一確定DNA序列的核苷酸 (nextgenerationsequencing,NGS)允許對(duì)H.pylori基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，揭示H.pylori的基因型、突變位點(diǎn)及其與耐藥性之間克拉霉素耐藥菌株進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了與H.pylori抗菌藥物耐藥相關(guān)的新突變。2021年Hulten等[40證實(shí)NGS還可以應(yīng)用石蠟包埋后的胃黏膜組織等進(jìn)行檢測(cè)；2023年Bonilla等[4]證實(shí)NGS能夠可靠地測(cè)定糞便等不同樣本對(duì)克拉霉素、左氧氟沙星、利福布汀和四環(huán)素的耐藥性。研究者認(rèn)為NGS可能有助于更快地鑒定H.pylori毒力因子和預(yù)測(cè)抗菌藥物耐藥譜[42]。NGS方法能夠同時(shí)檢測(cè)多種抗菌藥物耐藥相關(guān)突變，提供有關(guān)H.pylori菌株耐藥譜的全面信息，為臨床(四)基因芯片技術(shù)近幾年我國(guó)在基因芯片技術(shù)在H.pylori耐藥檢測(cè)應(yīng)用上的研究較多，基因芯片可同時(shí)檢測(cè)多種抗菌藥物耐藥突變。2018年Zhang等[44開(kāi)發(fā)了一種可視基因芯片技術(shù)試劑盒，該H.pylori試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)CYP2C19基因多態(tài)性和克拉霉素/左氧氟沙星耐藥性。2020年，另一研究團(tuán)隊(duì)評(píng)價(jià)了胃黏膜基因芯片技術(shù)在兒童H.pylori感染快速診斷及耐藥檢測(cè)中的臨床意義，證實(shí)基因芯片技術(shù)與DNA測(cè)序檢測(cè)耐藥突變的符合率較高，可以有效用于H.pylori的快速診斷和耐藥檢測(cè)[45]。2024年，我國(guó)開(kāi)發(fā)出一種新的高效的DNA微陣列技術(shù)，并與E-test培養(yǎng)法進(jìn)行了對(duì)比，一致率為100%,提供了更廣泛的檢三、分子檢測(cè)的樣本類型及其質(zhì)量控制臨床上，H.pylori感染的根除治療前未能常規(guī)進(jìn)行藥敏檢測(cè)，主要原因一是傳統(tǒng)H.pylori培養(yǎng)難度較大、耗時(shí)長(zhǎng)；二是既往均需要經(jīng)胃鏡取活檢胃黏膜組織，由于H.pylori在胃內(nèi)不均勻分布，因用于H.pylori耐藥無(wú)創(chuàng)檢測(cè)的主要可靠樣本是糞便。早在1999年，研究者就證實(shí)用糞便作為樣本進(jìn)行H.pylori檢測(cè) (94.1%)和高特異度(91.8%)[47],這為利用糞便進(jìn)行分子檢測(cè)方法研究H.pylori的耐藥性奠定了思路和基礎(chǔ)。但由于樣本中較多的抑制物質(zhì)存在以及樣本中可能存在其他具有序列同源性的螺桿菌物度達(dá)到93.8%。同年，Giorgio等[50用THD°FecalTest商業(yè)試劑盒對(duì)52例患者的配對(duì)樣本分別提取胃活檢組織和糞便中的DNA,并用實(shí)時(shí)PCR的方法進(jìn)行H.pylori鑒定及克拉霉素所有感染患者的胃組織和糞便檢測(cè)結(jié)果完全一致(100%)。2023年Mommersteeg等51]對(duì)應(yīng)用不同的糞便樣本進(jìn)行H.pylori鑒定及耐藥到H.pylori耐藥相關(guān)突變，進(jìn)而指導(dǎo)臨床診療；而糞便免疫化學(xué)檢一些用于H.pylori耐藥分子檢測(cè)的試劑盒。如基于PCR反向雜交技[52],但應(yīng)用于糞便樣本的結(jié)果卻不相同。2017年Brennan等53發(fā)現(xiàn)用該試劑盒檢測(cè)胃活檢標(biāo)本H.pylori感染的準(zhǔn)確率高于糞便標(biāo)本 (98.2%比80.3%),但在糞便樣本中檢測(cè)到的克拉霉素和氟喹諾酮類藥物耐藥率更高，說(shuō)明用該試劑盒進(jìn)行糞便分子檢測(cè)缺乏特異的2142和2143位點(diǎn)。如芬蘭MobidiagHologic公司的H.pylori耐藥核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)成功獲批上為我國(guó)H.pylori個(gè)性化精準(zhǔn)