尼帕病毒病實(shí)驗室檢測技術(shù)方案尼帕病毒病實(shí)驗室檢查1.一般檢查外周血白細(xì)胞計數(shù)正?；蚪档停“蹇蓽p少。大部分患者腦脊液白細(xì)胞計數(shù)升高，單核細(xì)胞為主，蛋白水平升高，葡萄糖水平正常。2.血清和病原學(xué)檢查早期發(fā)現(xiàn)和診斷尼帕病毒病對于提高感染者生存機(jī)會、防止傳播給他人以及防止疫情暴發(fā)至關(guān)重要。在病程早期，可采集病人血液、腦脊液、尿液、鼻咽拭子等標(biāo)本進(jìn)行尼帕病毒逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測病毒RNA，并開展病毒分離培養(yǎng)。相關(guān)標(biāo)本的采集、包裝、運(yùn)送和實(shí)驗室檢測等具體內(nèi)容參見《尼帕病毒實(shí)驗室檢測技術(shù)方案》尼帕病毒實(shí)驗室檢測技術(shù)方案尼帕病毒(Nipahvirus，NiV)屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)亨尼帕病毒屬(Henipavirus)的成員，病毒顆粒呈多形性，直徑150300nm，最外層為脂蛋白包膜，核衣殼呈螺旋對稱?；蚪M為單股負(fù)鏈RNA，全長約18.2kb。尼帕病毒只有一個血清型，根據(jù)病毒基因組序列特征可分為M亞型(馬來西亞亞型)和B亞型(孟加拉亞型)。尼帕病毒的檢測方法包括病毒核酸檢測、抗體檢測(IgM、IgG和中和抗體等)和病毒分離等。由于尼帕病毒的高致病性，病毒的分離培養(yǎng)需要在生物安全四級(BSL4)實(shí)驗室進(jìn)行，采集的病毒相關(guān)樣本的實(shí)驗室檢測需要在生物安全三級(BSL3)實(shí)驗室滅活后方可進(jìn)行。一檢測對象疑似病例、確診病例及其密切接觸者。2.涉疫地區(qū)的媒介生物(果蝠、豬等)和食品(豬肉制品、水果蔬菜等);原產(chǎn)地近期涉疫的進(jìn)口食品(豬肉制品、水果蔬菜等)。二技術(shù)人員基本要求(一)采樣人員從事尼帕病毒實(shí)驗室檢測的標(biāo)本采集技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)(培訓(xùn)合格)，熟悉標(biāo)本種類和采集方法，熟練掌握標(biāo)本采集操作流程及注意事項，做好標(biāo)本信息的記錄，確保標(biāo)本質(zhì)量符合要求、標(biāo)本及相關(guān)信息可追溯。(二)檢測人員實(shí)驗室檢測技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)經(jīng)過生物安全培訓(xùn)(培訓(xùn)合格)，熟悉標(biāo)本種類、標(biāo)本處理和相應(yīng)的檢測技術(shù)，以保證及時、熟練地進(jìn)行實(shí)驗和報告結(jié)果，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。三標(biāo)本采集、保存和運(yùn)輸(一)病例標(biāo)本采集對懷疑感染尼帕病毒的患者，要盡早采集腦脊液、血液、尿液、鼻拭子和咽拭子。腦脊液標(biāo)本腦脊液標(biāo)本由臨床醫(yī)師以無菌手續(xù)對腰椎穿刺抽取，然后留取腦脊液標(biāo)本于3個無菌試管中，每個試管1~2ml。保存于帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的凍存管內(nèi)，標(biāo)記清楚后低溫保存，其中1管用于本地/本省生物安全三級(BSL3)實(shí)驗室檢測，2管用于上級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核。2.血液標(biāo)本血液標(biāo)本由臨床醫(yī)師用無菌真空干燥管，采集患者非抗凝血3管，每管5ml。采集完成，標(biāo)記清楚后及時置于4~8°C冰箱低溫暫存，待血清析出后及時置于20~80°C冰箱凍存。其中1管用于本地/本省生物安全三級(BSL3)實(shí)驗室檢測，2管用于上級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核。對病例應(yīng)盡可能采集雙份血液標(biāo)本，兩份標(biāo)本之間相隔14天為宜，住院病例可于入院當(dāng)天和出院前1天各采集一份。3.鼻拭子、咽拭子采樣人員按照標(biāo)準(zhǔn)操作，對每一位被采集人員采集3份樣本，分別保存于帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的含2~3ml病毒保存液的采集管中。其1管用于本地/本省生物安全三級(BSL3)實(shí)驗室檢測，其余2管用于上級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核。4.尿液標(biāo)本采集尿液標(biāo)本15ml，分裝3管(各5ml)，保存至帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈的無菌15ml離心管。其中1管用于本地/本省生物安全三級(BSL3)實(shí)驗室檢測，2管用于上級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)復(fù)核。(二)果蝠、豬、進(jìn)口食品(豬肉制品、水果蔬菜)標(biāo)本采集。采集疫區(qū)所在地的果蝠唾液、尿液;疫區(qū)所在地養(yǎng)殖場生豬的鼻咽拭子和血清。如果市場存在來自于國外疫區(qū)的進(jìn)口冷凍豬肉制品、水果蔬菜，需要采集這些進(jìn)口食品的表面。填寫媒介標(biāo)本采集信息表，按照采集地點(diǎn)、種類進(jìn)行分裝。(三)標(biāo)本保存、運(yùn)送如標(biāo)本能夠在24小時內(nèi)開展實(shí)驗室檢測，應(yīng)將標(biāo)本置于2~8°C冰箱保存;不能及時檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快置于20~80°C冰箱保存。標(biāo)本運(yùn)送時采用低溫冷藏運(yùn)輸，避免凍融，樣本運(yùn)輸應(yīng)遵守國家關(guān)于一類病原體的相關(guān)生物安全規(guī)定。四實(shí)驗室管理基本要求(一)實(shí)驗室資質(zhì)要求開展核酸檢測的實(shí)驗室，應(yīng)當(dāng)符合《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》(國務(wù)院令第424號)和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室管理辦法》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)(202*)194號)有關(guān)規(guī)定，具備經(jīng)過衛(wèi)生健康行政部門審核備案的生物安全三級(BSL3)及以上實(shí)驗室條件，以及臨床基因擴(kuò)增檢驗實(shí)驗室條件。獨(dú)立設(shè)置的醫(yī)學(xué)檢驗實(shí)驗室還應(yīng)當(dāng)符合《醫(yī)學(xué)檢驗實(shí)驗室基本標(biāo)準(zhǔn)(試行)》《醫(yī)學(xué)檢驗實(shí)驗室管理規(guī)范(試行)》等要求。(二)實(shí)驗室分區(qū)要求原則上開展尼帕病毒核酸檢測的實(shí)驗室應(yīng)當(dāng)設(shè)置以下區(qū)域:試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)。這3個區(qū)域在物理空間上應(yīng)當(dāng)是完全相互獨(dú)立的，不能有空氣的直接相通。各區(qū)的功能分別是:試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū):貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的制備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。標(biāo)本制備區(qū):轉(zhuǎn)運(yùn)桶的開啟、標(biāo)本的滅活，核酸提取及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管等。3.擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū):核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析。根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。如采用標(biāo)本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的自動化分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。(三)主要儀器設(shè)備實(shí)驗室應(yīng)當(dāng)配備與開展檢驗項目相適宜的儀器設(shè)備，包括核酸提取儀、醫(yī)用PCR擴(kuò)增儀、生物安全柜、病毒滅活設(shè)備(如水浴鍋等)、保存試劑和標(biāo)本的冰箱和冰柜、離心機(jī)等。五實(shí)驗室檢測方法尼帕病毒的檢測方法包括病毒核酸檢測、血清學(xué)檢測和病毒分離等。尼帕病毒與亨尼帕病毒屬(Henipavirus)其他病毒具有較強(qiáng)的血清學(xué)交叉反應(yīng)，易產(chǎn)生假陽性。(一)核酸檢測。實(shí)驗室接到標(biāo)本后，應(yīng)當(dāng)在生物安全三級(BSL3)實(shí)驗室中的生物安全柜內(nèi)對標(biāo)本進(jìn)行清點(diǎn)核對，并對標(biāo)本進(jìn)行滅活處理。按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本前處理、核酸提取、核酸擴(kuò)增、結(jié)果分析及報告。實(shí)驗室應(yīng)當(dāng)建立可疑標(biāo)本和陽性標(biāo)本復(fù)檢的流程。1.試劑準(zhǔn)備應(yīng)當(dāng)選擇國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的試劑盒(國內(nèi)暫無)或參考國際通用的尼帕病毒實(shí)驗室檢測方法。在選擇標(biāo)本保存液和核酸提取試劑時，使用試劑盒說明書上建議的配套試劑。核酸提取方法與標(biāo)本保存液和滅活方式相關(guān)，有些核酸提取試劑(如磁珠法或者一步法)，容易受到胍鹽或保存液中特殊成分的影響，特別是一步法提取多需要使用試劑廠家配套的標(biāo)本保存液。2.標(biāo)本前處理已經(jīng)使用含胍鹽的滅活型標(biāo)本保存液的實(shí)驗室，這一環(huán)節(jié)無需進(jìn)行滅活處理，直接進(jìn)行核酸提取，而使用非滅活型標(biāo)本保存液的實(shí)驗室，則有56°C孵育30分鐘熱滅活、化學(xué)滅活的處理方式。3.核酸提取將滅活后的標(biāo)本取出，在生物安全柜內(nèi)打開標(biāo)本采集管加樣。核酸提取完成后，立即將提取物進(jìn)行封蓋處理。在生物安全柜內(nèi)將提取核酸加至核酸檢測反應(yīng)體系中。4.核酸檢測方法一(實(shí)時熒光定量RTPCR方法)本方法是由世界動物衛(wèi)生組織(WorldOrganisationforAnimalHealth，OIE)推薦，適用于各類臨床和環(huán)境標(biāo)本，通過TaqMan實(shí)時熒光定量RTPCR方法對提取的標(biāo)本核酸進(jìn)行尼帕病毒實(shí)驗室檢測4.1引物、探針序列尼帕病毒特異性引物和探針序列見表1，檢測的靶基因是尼帕病毒的N基因。4.2反應(yīng)條件反應(yīng)條件根據(jù)實(shí)驗室具體使用的商業(yè)化RealtimeRTPCR試劑盒為準(zhǔn)，以QIAGEN公司OneStepRTPCR試劑盒為例。核酸擴(kuò)增檢測的反應(yīng)體系配制見表2，反應(yīng)程序見表3。每次檢測均需配制陽性對照和陰性對照作為實(shí)驗室檢測質(zhì)控。4.3檢測結(jié)果判讀尼帕病毒核酸實(shí)時熒光定量RTPCR方法實(shí)驗室檢測有效性判讀條件:(1)陽性對照Ct值<35;(2)陰性對照無Ct值(無擴(kuò)增曲線)。同時滿足上述兩個條件，實(shí)驗室檢測結(jié)果有效;上述任一條件不滿足，實(shí)驗室檢測結(jié)果無效。待測標(biāo)本核酸實(shí)驗室檢測結(jié)果判讀:(1)待測標(biāo)本Ct值<35，標(biāo)本為尼帕病毒陽性;(2)待測標(biāo)本Ct值>38，標(biāo)本為尼帕病毒陰性;(3)待測標(biāo)本Ct值≥35且Ct值≤38，標(biāo)本需要再次提取核酸進(jìn)行復(fù)核檢測。5.核酸檢測方法二(實(shí)時熒光定量RTPCR方法)本方法是由中國疾病預(yù)防控制中心推薦，適用于各類臨床和環(huán)境標(biāo)本，通過TaqMan實(shí)時熒光定量RTPCR方法對提取的標(biāo)本核酸進(jìn)行尼帕病毒實(shí)驗室檢測。5.1引物、探針序列尼帕病毒特異性引物和探針序列見表4，檢測的靶基因是尼帕病毒的N基因。5.2反應(yīng)條件反應(yīng)條件根據(jù)實(shí)驗室具體使用的商業(yè)化RealtimeRTPCR試劑盒為準(zhǔn),以Thermo公司TagPath1StepMultiplexMasterMix試劑盒為例。核酸擴(kuò)增檢測的反應(yīng)體系配制見表5，反應(yīng)程序見表6。每次檢測均需配制陽性對照和陰性對照作為實(shí)驗室檢測質(zhì)控。5.3檢測結(jié)果判讀尼帕病毒核酸實(shí)時熒光定量RTPCR方法實(shí)驗室檢測有效性判讀條件:(1)陽性對照Ct值<35;(2)陰性對照無Ct值(無擴(kuò)增曲線)。同時滿足上述兩個條件，實(shí)驗室檢測結(jié)果有效;上述任一條件不滿足，實(shí)驗室檢測結(jié)果無效。待測標(biāo)本核酸實(shí)驗室檢測結(jié)果判讀:(1)待測標(biāo)本Ct值〈35，標(biāo)本為尼帕病毒陽性;(2)待測標(biāo)本Ct值>38，標(biāo)本為尼帕病毒陰性;(3)待測標(biāo)本Ct值≥35且Ct值≤38，標(biāo)本需要再次提取核酸進(jìn)行復(fù)核檢測。(二)血清學(xué)檢測方法尼帕病毒可與亨尼帕毒屬其它病毒如亨德拉病毒產(chǎn)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，血清學(xué)檢測易產(chǎn)生假陽性。目前尚無商業(yè)化血清學(xué)檢測試劑盒。(三)病毒分離病毒核酸陽性的標(biāo)本進(jìn)行病毒分離。分離出尼帕病毒是本病感染的確證性指標(biāo)?？捎糜谀崤敛《痉蛛x的標(biāo)本包括且不限于病人血清、腦脊液、鼻拭子、咽拭子、尿液、腦組織和病豬的肺、腎等組織。不同類型的標(biāo)本需要采用適合的前處理的方法。對于組織標(biāo)本，對其稱重后，按照重量/體積比(W/V)=10，加入10倍體積磷酸鹽緩沖液(PBS)至標(biāo)本中混勻后在組織研磨器勻漿破碎;對于血清標(biāo)本，需加入10倍體積磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行稀釋;對于其它體液標(biāo)本，不需要特別處理。上述經(jīng)過處理的各種標(biāo)本，在進(jìn)行尼帕病毒分離培養(yǎng)之前，需通過孔徑為0.22m的無菌濾器過濾，常規(guī)接種于Vero細(xì)胞中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生病變形成合胞體時即可獲得病毒。目前已經(jīng)從腦脊液、尿液、鼻咽腔分泌物中分離到該病毒，并且從不同部位分離到的病毒都表現(xiàn)為相同的基因組特征。尼帕病毒毒力高、傳染性強(qiáng)，與其培養(yǎng)及擴(kuò)增有關(guān)的實(shí)驗均應(yīng)在生物安全4級實(shí)驗室(BSL4)內(nèi)進(jìn)行。六生物安全根據(jù)我國《人間傳染的病原微生物名錄》，尼帕病毒其危害程度分類屬于第一類。病毒分離、培養(yǎng)等涉及活病毒的操作必須在生物安全四級實(shí)驗室(BSL4)進(jìn)行;未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料的操作在生物安全三級實(shí)驗室(BSL3)進(jìn)行;滅活材料可以在生物安全二級實(shí)驗室(BSL2)操作;無感染性材料可以在生物安全一級實(shí)驗室(BSL1)操作?；畈《镜膭游飳?shí)驗必須在動物生物安全四級實(shí)驗室進(jìn)行(ABSL4)。所有操作應(yīng)嚴(yán)格按照《病原微生物實(shí)驗室生物安全