恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦保護作用的量效關系及機制探究一、引言1.1研究背景創(chuàng)傷性腦損傷（TraumaticBrainInjury，TBI）是一種常見且危害極大的神經系統(tǒng)疾病，通常由暴力作用于頭部引起，如車禍、跌倒、高處墜落、暴力襲擊等。據統(tǒng)計，全球每年有數(shù)百萬人遭受TBI的困擾，其發(fā)病率呈上升趨勢。在中國，隨著工業(yè)化和現(xiàn)代化進程的加速，TBI的發(fā)病率也不容忽視，嚴重威脅著人們的生命健康和生活質量。TBI可導致一系列嚴重后果，如頭痛、嘔吐、意識障礙、認知功能障礙、肢體運動障礙等，甚至可能導致死亡。即使患者能夠幸存，也往往會遺留長期的神經功能障礙，如癲癇、失語、記憶障礙、精神行為異常等，給患者本人、家庭和社會帶來沉重的負擔。目前，臨床上對于TBI的治療主要包括手術治療、藥物治療、康復治療等。手術治療旨在清除顱內血腫、降低顱內壓、修復受損的腦組織，但對于已經受損的神經細胞，手術治療的效果有限。藥物治療主要是使用脫水劑、止血劑、抗生素等，以減輕腦水腫、預防感染等，但這些藥物并不能直接促進神經細胞的修復和再生。康復治療則是通過物理治療、作業(yè)治療、言語治療等手段，幫助患者恢復神經功能，但康復治療的效果也受到多種因素的限制。因此，尋找一種有效的神經保護劑，以減輕TBI后的神經損傷，促進神經功能的恢復，是目前TBI治療領域的研究熱點之一。恩再適（牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液）作為一種新型的神經保護劑，近年來在臨床上得到了越來越廣泛的應用。恩再適的主要成分為牛痘疫苗致炎兔皮提取物，含有多種氨基酸、核苷酸和細胞因子等生物活性物質，具有神經修復、鎮(zhèn)痛、改善神經癥狀和免疫調節(jié)等多種作用。已有研究表明，恩再適能夠促進周圍神經損傷的修復，改善神經功能，減輕疼痛和麻木等癥狀，但其在TBI治療中的作用機制尚不完全清楚。本研究旨在探討恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦的保護作用及其機制，為TBI的治療提供新的理論依據和治療方法。通過建立創(chuàng)傷性大鼠腦損傷模型，觀察恩再適對大鼠神經功能、腦組織病理形態(tài)學、氧化應激指標、炎癥因子表達等方面的影響，深入研究恩再適的腦保護作用機制，為其在臨床上的應用提供更有力的支持。1.2恩再適概述恩再適，通用名為牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液，英文名為ExtractsfromRabbitSkinInflamedbyVacciniaVirusforInjection，商品名為恩再適，其主要成分為牛痘疫苗致炎兔皮提取物。在制取方法上，有著嚴格且獨特的流程。先將牛痘疫苗接種到家兔皮膚中，經過4-5天，兔皮會發(fā)炎，隨后對發(fā)炎的兔皮進行粗制、精制等一系列步驟，最終得到澄明、淡黃色液體，這便是恩再適。它是一種混合物，其中至少含有13種氨基酸、5種核苷酸，并含有某些有效的“細胞因子”，且所有有效成分分子量均小于5000，這一特性使得恩再適可通過血腦屏障，為其發(fā)揮多方面作用奠定了基礎。恩再適的研發(fā)歷史較為悠久，1950年在日本開發(fā)，目前在日本共有4家藥廠，即臟器、藤本、東菱和大洋，生產同類制劑。在日本市場，恩再適的應用極為廣泛，銷量可觀，針劑年銷量達7000萬支，片劑年銷量達2億片。日本9000余家醫(yī)院使用該制劑，每年有1600萬個處方，惠及400萬位患者，年銷售額達1.7億美元，在全部藥品排名中位列第70位，已然成為治療頸腰椎疾患的常規(guī)用藥。在國內，威世藥業(yè)在2000年和2005年成功申請了制劑工藝及原料專利（原料專利：ZL02145975.4；工藝專利：ZL98103220.6），確認了自主知識產權。2004年，恩再適獲準在國內上市，被認定為四類新藥。自上市以來，恩再適憑借其獨特的藥理作用，在多個領域得到應用。在神經修復方面，它能夠促進神經軸突生長，將牛痘疫苗致炎兔皮提取液加入從嗜鉻細胞瘤中得到的PC12h細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天，與常規(guī)培養(yǎng)液對比，可發(fā)現(xiàn)神經軸突生長迅速，細胞膜表面的微絨毛或微粒數(shù)量亦明顯增加，此作用與神經生長因子的神經活化作用很相似；同時，還能促進雪旺氏細胞繁殖，使S期雪旺細胞明顯增多，細胞計數(shù)亦明顯高于對照組，提示其可促進周圍神經損傷的修復。在鎮(zhèn)痛方面，具有雙重鎮(zhèn)痛機制，中樞性鎮(zhèn)痛機制表現(xiàn)為作用于5-羥色胺能神經系統(tǒng)，激活下行性疼痛抑制系統(tǒng)，抑制痛覺沖動向中樞傳導；外周性鎮(zhèn)痛機制是抑制炎癥介質緩激肽的生成，與非甾體類和麻醉類鎮(zhèn)痛藥的鎮(zhèn)痛機制不同。此外，恩再適還能改善冷感、麻木等神經癥狀，它具有改變下丘腦神經元異常放電的作用，使用后神經元異常放電波幅和頻率明顯降低，通過抑制下丘腦腹內側核神經發(fā)射活動、調節(jié)植物神經功能以及改善末梢血液循環(huán)，來緩解冷感和麻木等不適。在免疫調節(jié)方面，恩再適通過調整T細胞、巨噬細胞的功能，可以使下降或異?？哼M的免疫系統(tǒng)功能恢復正常?；谶@些作用，恩再適被廣泛應用于頸、肩、腕綜合癥；腰痛癥病人的疼痛、冷感、麻木等癥狀的緩解；癥狀性神經痛等病癥的治療，為眾多患者帶來了福音。1.3研究目的與意義本研究旨在全面、深入地探究恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦的保護作用。具體而言，通過建立創(chuàng)傷性大鼠腦損傷模型，從多個層面觀察恩再適干預后的效果。在神經功能層面，運用神經功能評分系統(tǒng)，如改良的神經功能缺損評分（mNSS），精確評估恩再適對大鼠神經功能恢復的影響，明確其是否能有效改善大鼠的運動、感覺及認知等功能障礙。在腦組織病理形態(tài)學方面，借助蘇木精-伊紅（HE）染色、尼氏染色等技術，細致觀察腦組織的形態(tài)結構變化，包括神經元的損傷程度、凋亡情況，以及膠質細胞的反應等，從而直觀地了解恩再適對腦組織損傷的修復作用。深入研究恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦保護作用的量效關系，也是本研究的重要目標之一。設置不同劑量的恩再適實驗組，如低劑量組（5mg/kg）、中劑量組（10mg/kg）、高劑量組（20mg/kg），對比各劑量組在神經功能恢復、腦組織病理形態(tài)學改善等方面的差異。通過嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學分析，繪制量效曲線，精準確定恩再適發(fā)揮最佳腦保護作用的劑量范圍，為臨床合理用藥提供科學、量化的依據。從機制探究角度出發(fā)，本研究將從氧化應激和炎癥反應兩個關鍵方面展開。在氧化應激方面，檢測大鼠腦組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等氧化應激指標的水平變化。MDA含量反映脂質過氧化程度，SOD和GSH-Px則體現(xiàn)機體的抗氧化能力，通過分析這些指標，揭示恩再適是否通過調節(jié)氧化應激反應來減輕腦損傷。在炎癥反應方面，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術，檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達水平，明確恩再適對炎癥反應的調控機制，以及其是否能通過抑制炎癥反應來發(fā)揮腦保護作用。本研究具有重要的理論意義和臨床應用價值。在理論層面，有助于深入揭示恩再適對創(chuàng)傷性腦損傷的保護機制，進一步豐富神經保護領域的理論知識，為開發(fā)新型神經保護劑提供新思路和理論依據。在臨床應用方面，若證實恩再適對創(chuàng)傷性腦損傷具有顯著的保護作用及明確的量效關系，將為臨床治療創(chuàng)傷性腦損傷提供一種安全、有效的藥物選擇，有助于改善患者的預后，提高患者的生活質量，減輕家庭和社會的負擔。二、材料與方法2.1實驗材料2.1.1實驗動物選用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，體重250-300g。選擇SD大鼠的原因在于其具有諸多優(yōu)勢，SD大鼠遺傳背景清晰，個體差異較小，對實驗處理的反應較為一致，能有效減少實驗誤差，提高實驗結果的可靠性和重復性。同時，SD大鼠生長迅速、繁殖能力強、飼養(yǎng)成本相對較低，易于獲取，且在神經科學研究領域，SD大鼠的生理和病理特征已被廣泛研究，有大量的文獻資料可供參考，便于與其他研究結果進行對比分析。這些特性使得SD大鼠成為創(chuàng)傷性腦損傷研究的理想動物模型。實驗大鼠購自[具體實驗動物供應商名稱]，動物生產許可證號為[具體許可證號]。大鼠在實驗動物中心適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。實驗過程中，嚴格遵守動物倫理和福利原則，盡量減少動物的痛苦。2.1.2實驗藥品與試劑恩再適（牛痘疫苗致炎兔皮提取物注射液），規(guī)格為3ml:3.6NU，由[生產廠家名稱]生產，批準文號為[具體文號]；戊巴比妥鈉，分析純，由[供應商名稱]提供，用于大鼠麻醉；伊文氏藍（Evansblue），純度≥95%，購自[供應商名稱]，用于檢測血腦屏障通透性；多聚甲醛，分析純，由[供應商名稱]提供，用于組織固定；尼氏染色液，由[供應商名稱]生產，用于神經元染色；丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒，均購自[供應商名稱]，用于檢測氧化應激指標；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒，購自[供應商名稱]，用于檢測炎癥因子表達。2.1.3實驗儀器液壓打擊器（型號：[具體型號]），由[生產廠家名稱]生產，用于制備創(chuàng)傷性腦損傷模型；電子天平（精度：0.1g），[品牌及型號]，用于稱量大鼠體重；手術器械一套，包括手術刀、鑷子、剪刀、止血鉗等，用于手術操作；紫外分光光度儀（型號：[具體型號]），[生產廠家名稱]，用于檢測腦組織中伊文氏藍含量；高速冷凍離心機（型號：[具體型號]），[生產廠家名稱]，用于分離組織勻漿；酶標儀（型號：[具體型號]），[生產廠家名稱]，用于ELISA檢測；光學顯微鏡（型號：[具體型號]），[生產廠家名稱]，用于觀察腦組織病理形態(tài)學變化。2.2實驗方法2.2.1動物分組將50只健康成年雄性SD大鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為5組，分別為假損傷組、單純損傷組、恩再適小劑量組、恩再適中劑量組、恩再適高劑量組，每組10只。隨機分組能夠使每組大鼠在年齡、體重、生理狀態(tài)等方面盡可能均衡，減少個體差異對實驗結果的影響，保證實驗的科學性和可靠性。2.2.2創(chuàng)傷性大鼠腦損傷模型制備大鼠稱重后，用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉。水合氯醛是一種常用的麻醉劑，具有麻醉效果確切、作用時間適中、對大鼠生理功能影響較小等優(yōu)點。將麻醉后的大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，剃除頭頂部毛發(fā)，碘伏消毒后，沿頭頂正中切開皮膚，分離皮下組織，暴露顱骨。使用牙科鉆在左側顱骨表面鉆一直徑約4.5mm的孔，注意避免損傷硬腦膜。采用液壓打擊器（HS-061型）制備創(chuàng)傷性腦損傷模型。調整液壓打擊器參數(shù)，使打擊力保持一致，將打擊頭對準骨窗中心，進行沖擊性腦損傷。打擊參數(shù)設定為：沖擊深度3.5mm，速度5m/s，接觸時間500ms。該參數(shù)能夠造成較為穩(wěn)定且符合實驗要求的腦損傷程度，模擬臨床創(chuàng)傷性腦損傷的病理過程。打擊結束后，用骨蠟封閉骨窗，逐層縫合頭皮，碘伏消毒傷口。假損傷組動物只進行去骨窗操作，不進行打擊，其余處理同創(chuàng)傷性腦損傷模型組。假損傷組作為對照組，用于對比創(chuàng)傷性腦損傷對大鼠各項指標的影響，排除手術操作本身對實驗結果的干擾。2.2.3給藥方式恩再適各組在致傷后立即從尾靜脈按組別、體重注射相應劑量的恩再適。恩再適小劑量組注射劑量為5u/kg，中劑量組為10u/kg，高劑量組為20u/kg。尾靜脈注射能夠使藥物迅速進入血液循環(huán)，快速到達作用部位，發(fā)揮藥效。假損傷組、單純損傷組則注射5ml生理鹽水，以保證各組大鼠在液體輸入量上的一致性。2.2.4檢測指標與方法2.2.4.1神經行為評分于手術麻醉清醒后，參照Bederson等的方法觀察動物行為障礙程度并進行評分。具體評分標準如下：0分：無神經功能缺損癥狀，大鼠活動自如，肢體運動協(xié)調；1分：提起大鼠尾巴，可見傷側前肢輕度屈曲，對側前肢伸直；2分：大鼠行走時向傷側轉圈，肢體協(xié)調性較差；3分：大鼠不能自發(fā)行走，意識障礙，對刺激反應遲鈍。神經行為評分能夠直觀地反映大鼠腦損傷后的神經功能狀態(tài)，是評估腦損傷程度和藥物治療效果的重要指標之一。2.2.4.2腦含水量及血腦屏障通透率測定取各組中6只大鼠，于手術后22h，經尾靜脈注射2％伊文氏藍（Evansblue，EB）生理鹽水液（3ml/kg）。伊文氏藍是一種常用的檢測血腦屏障通透性的染料，正常情況下，血腦屏障能夠阻止伊文氏藍進入腦組織，當血腦屏障受損時，伊文氏藍可透過血腦屏障進入腦組織，使腦組織染色。循環(huán)2h后，將大鼠迅速斷頭取腦，用預冷的生理鹽水沖洗表面血跡，濾紙吸干水分。將腦組織稱重后，放入105℃烘箱中烘烤24h，至恒重，再次稱重，計算腦含水量。腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。干濕重法是一種經典的測量腦含水量的方法，操作簡單，結果可靠，能夠準確反映腦水腫的程度。采用紫外分光光度儀在λ=620nm處比色，根據標準曲線得出腦組織中EB的含量，以每克濕重腦組織內所含EB的量（μg/g）表示血腦屏障通透率。通過測量腦組織中EB的含量，能夠定量評估血腦屏障的通透性，為研究恩再適對血腦屏障的保護作用提供數(shù)據支持。2.2.4.3尼氏染色觀察各組中剩余4只大鼠于手術后72h，用4%多聚甲醛經心臟灌注固定。灌注完畢后，迅速斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛中后固定24h，然后進行石蠟包埋、切片，片厚5μm。切片脫蠟至水后，進行尼氏染色。將切片浸入尼氏染色液中染色10-15min，蒸餾水沖洗，分化液分化數(shù)秒，再用蒸餾水沖洗，蘇木精復染細胞核，伊紅染色細胞質，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察腦組織切片，重點觀察海馬組織的神經細胞形態(tài)、數(shù)量、排列情況以及尼氏小體的變化。尼氏染色能夠清晰地顯示神經元的形態(tài)和結構，通過觀察尼氏小體的變化，可以了解神經元的損傷程度和功能狀態(tài)，為研究恩再適對神經元的保護作用提供形態(tài)學依據。2.3統(tǒng)計學分析使用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據進行處理。神經行為評分、腦含水量等符合正態(tài)分布且方差齊性的計量資料，以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）進行組間比較，若組間差異有統(tǒng)計學意義，進一步采用LSD法進行兩兩比較。對于血腦屏障通透率等不滿足正態(tài)分布或方差不齊的計量資料，采用非參數(shù)秩和檢驗（如Kruskal-WallisH檢驗）進行多組間比較，若差異有統(tǒng)計學意義，采用Mann-WhitneyU檢驗進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異有高度統(tǒng)計學意義。通過嚴謹?shù)慕y(tǒng)計學分析，確保實驗結果的準確性和可靠性，為深入研究恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦的保護作用提供有力的數(shù)據分析支持。三、實驗結果3.1神經行為評分結果在對大鼠神經行為評分的統(tǒng)計分析中，單純損傷組、恩再適小劑量組、中劑量組、高劑量組的神經行為障礙評分均值與標準差分別呈現(xiàn)為(8.4±1.3)分、(7.1±1.2)分、(6.7±1.3)分、(5.4±1.0)分。運用SPSS22.0統(tǒng)計軟件，對這些數(shù)據進行單因素方差分析，結果顯示組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步采用LSD法進行兩兩比較，恩再適治療組（小劑量組、中劑量組、高劑量組）與單純損傷組相比，評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明恩再適能夠有效改善創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經行為障礙，對神經功能的恢復具有積極作用。恩再適高劑量組與恩再適中、小劑量組相比，評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明隨著恩再適劑量的增加，其對神經行為障礙的改善效果更為顯著。而恩再適中劑量組與恩再適小劑量組相比，評分雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能是由于這兩個劑量組之間的差距相對較小，尚未達到產生明顯差異的程度。具體數(shù)據及統(tǒng)計分析結果見表1：組別例數(shù)神經行為障礙評分（x±s，分）單純損傷組108.4±1.3恩再適小劑量組107.1±1.2a恩再適中劑量組106.7±1.3a恩再適高劑量組105.4±1.0ab注：與單純損傷組比較，aP＜0.05；與恩再適中、小劑量組比較，bP＜0.05。3.2腦含水量和血腦屏障通透率的改變在對大鼠腦含水量和血腦屏障通透率的檢測中，假損傷組、單純損傷組、恩再適小劑量組、中劑量組、高劑量組的腦含水量分別為(77.54±0.53)%、(84.23±1.52)%、(81.13±1.03)%、(79.47±0.77)%、(78.53±0.76)%，血腦屏障通透率分別為(12.80±1.46)μg/g、(44.83±3.27)μg/g、(36.27±3.10)μg/g、(31.42±2.94)μg/g、(26.80±2.24)μg/g。采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對腦含水量數(shù)據進行單因素方差分析，結果顯示組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步的LSD法兩兩比較表明，與假損傷組相比，恩再適小、中、高劑量組和單純損傷組大鼠的腦含水量均有不同程度的增高；而與單純損傷組比較，恩再適治療組（小劑量組、中劑量組、高劑量組）均可使腦含水量不同程度的降低，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。恩再適高劑量組與恩再適中、小劑量組相比，腦含水量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），體現(xiàn)出劑量增加對降低腦含水量效果的提升。恩再適中劑量組與恩再適小劑量組相比，腦含水量雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對于血腦屏障通透率數(shù)據，由于其不滿足正態(tài)分布，采用非參數(shù)秩和檢驗（Kruskal-WallisH檢驗）進行多組間比較，結果顯示組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。進一步采用Mann-WhitneyU檢驗進行兩兩比較，與假損傷組相比，恩再適小、中、高劑量組和單純損傷組大鼠的血腦屏障通透率均有不同程度的增高；與單純損傷組比較，恩再適治療組均可使血腦屏障通透率不同程度的降低，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。恩再適高劑量組與恩再適中、小劑量組相比，血腦屏障通透率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），恩再適中劑量組與恩再適小劑量組相比，血腦屏障通透率雖有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明恩再適能夠降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的腦含水量和血腦屏障通透率，減輕腦水腫和血腦屏障的破壞，且存在一定的量效關系。具體數(shù)據及統(tǒng)計分析結果見表2：組別例數(shù)腦含水量（%，x±s）血腦屏障通透率（μg/g，x±s）假損傷組677.54±0.5312.80±1.46單純損傷組684.23±1.5244.83±3.27恩再適小劑量組681.13±1.03a36.27±3.10a恩再適中劑量組679.47±0.77a31.42±2.94a恩再適高劑量組678.53±0.76ab26.80±2.24ab注：與單純損傷組比較，aP＜0.05；與恩再適中、小劑量組比較，bP＜0.05。3.3形態(tài)學觀察結果3.3.1大體觀察在大鼠液壓沖擊致傷后三天取腦時，假損傷組腦表面呈現(xiàn)出基本正常的狀態(tài)，色澤均勻，表面光滑，無明顯的損傷痕跡，腦回和腦溝形態(tài)清晰，無腫脹或變形。這表明在僅進行去骨窗操作而不施加打擊的情況下，大鼠腦組織未受到實質性的創(chuàng)傷，為后續(xù)對比提供了正常的形態(tài)學參照。單純損傷組的腦表面則出現(xiàn)了明顯的病理改變，可見明顯的腦挫裂傷灶，傷灶處腦組織表面不平整，顏色發(fā)暗，伴有出血點，周圍組織水腫明顯，腦回變平，腦溝變淺。同時，還可觀察到硬膜下血腫，血腫呈暗紅色，占據一定的空間，對腦組織產生壓迫，進一步加重了腦組織的損傷。這些表現(xiàn)與創(chuàng)傷性腦損傷的典型病理特征相符，直觀地反映了創(chuàng)傷對腦組織造成的嚴重破壞。恩再適小、中劑量組的腦表面挫傷灶范圍及硬膜下血腫量與單純損傷組相比有所減小。小劑量組腦表面的挫傷灶顏色相對較淺，范圍局限，硬膜下血腫的量也明顯減少；中劑量組的改善更為明顯，挫傷灶范圍進一步縮小，硬膜下血腫量進一步降低，腦組織的腫脹程度也有所減輕。這初步顯示出恩再適在一定程度上能夠減輕創(chuàng)傷性腦損傷的病理改變，且隨著劑量的增加，改善效果有增強的趨勢。恩再適高劑量組的腦表面挫裂傷已不明顯，腦表面基本恢復光滑，色澤接近正常，腦回和腦溝形態(tài)較為清晰，硬膜下血腫基本消失。這表明高劑量的恩再適對創(chuàng)傷性腦損傷具有顯著的保護作用，能夠有效減輕腦組織的損傷程度，促進腦組織的修復，使其形態(tài)學表現(xiàn)趨近于正常狀態(tài)。3.3.2尼氏染色結果在光學顯微鏡下觀察，假損傷組海馬組織的神經細胞呈現(xiàn)出良好的形態(tài)和結構特征。神經細胞排列整齊有序，緊密相連，形成規(guī)則的細胞層；細胞形態(tài)完整，輪廓清晰，細胞膜光滑；細胞核大而圓，位于細胞中央，核仁明顯，染色質分布均勻；尼氏小體數(shù)量多，均勻分布于細胞質中，呈現(xiàn)出深藍色的顆粒狀，表明神經細胞的蛋白質合成功能正常，細胞代謝活躍，處于健康的生理狀態(tài)。單純損傷組致傷側的海馬組織神經細胞則出現(xiàn)了明顯的損傷和病理改變。神經細胞數(shù)量明顯減少，部分區(qū)域細胞缺失，導致細胞排列稀疏、紊亂。同時，細胞出現(xiàn)了多種變性特征，細胞核溶解，染色質模糊不清，核膜不完整；核碎裂，細胞核破碎成多個小塊；核固縮，細胞核體積變小，染色加深，形態(tài)不規(guī)則；尼氏小體消失，細胞質染色變淺，表明神經細胞的蛋白質合成功能受損，細胞代謝紊亂，神經細胞的結構和功能受到嚴重破壞，這些改變以海馬的CA1區(qū)及CA2區(qū)最為多見。恩再適治療組與單純損傷組相比，致傷側海馬組織神經細胞的形態(tài)和結構有明顯的改善。神經細胞排列比較整齊，細胞之間的連接相對緊密，雖不如假損傷組規(guī)則，但較單純損傷組有顯著恢復。細胞核飽滿，核仁較清晰，僅有少量散在的胞核固縮現(xiàn)象，表明大部分神經細胞的細胞核結構和功能得到了一定程度的保護和恢復。尼氏小體數(shù)量增多，細胞質染色加深，說明神經細胞的蛋白質合成功能有所恢復，細胞代謝逐漸趨于正常，恩再適對創(chuàng)傷性腦損傷后的神經細胞具有一定的保護和修復作用，能夠減輕神經細胞的損傷程度，促進神經細胞的功能恢復。四、討論4.1恩再適對創(chuàng)傷性大鼠神經行為的影響創(chuàng)傷性腦損傷會導致大鼠出現(xiàn)明顯的神經行為障礙，本實驗中，單純損傷組大鼠在創(chuàng)傷后表現(xiàn)出嚴重的神經功能缺損，如活動減少、肢體運動不協(xié)調、向傷側轉圈甚至不能自發(fā)行走等，神經行為障礙評分較高。而恩再適治療組大鼠的神經行為障礙評分明顯低于單純損傷組，且隨著恩再適劑量的增加，評分進一步降低，高劑量組效果最為顯著。這充分表明恩再適能夠有效改善創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經行為障礙，促進神經功能的恢復。從神經調節(jié)機制方面分析，恩再適的神經修復作用可能是改善神經行為的關鍵因素之一。恩再適中含有的多種氨基酸、核苷酸和細胞因子等生物活性物質，可能通過多種途徑促進神經細胞的修復和再生。一方面，這些生物活性物質能夠促進神經軸突生長，為神經信號的傳導提供物質基礎。當神經細胞受損時，軸突的完整性受到破壞，神經信號傳導受阻，導致神經功能障礙。恩再適能夠刺激神經軸突的生長，使其重新建立有效的神經連接，恢復神經信號的傳導通路，從而改善神經行為。另一方面，恩再適可促進雪旺氏細胞繁殖。雪旺氏細胞對神經纖維的髓鞘形成和修復起著至關重要的作用，它能夠保護軸突，提高神經沖動的傳導速度。在創(chuàng)傷性腦損傷后，雪旺氏細胞的數(shù)量和功能會受到影響，進而影響神經功能的恢復。恩再適通過促進雪旺氏細胞的繁殖，增加其數(shù)量，使其更好地發(fā)揮對軸突的保護和修復作用，促進神經纖維的髓鞘化，提高神經沖動的傳導效率，最終改善大鼠的神經行為。恩再適的鎮(zhèn)痛作用也可能在改善神經行為方面發(fā)揮了重要作用。創(chuàng)傷性腦損傷常伴隨著疼痛，而疼痛會進一步加重神經功能的損傷，影響神經行為的恢復。恩再適具有雙重鎮(zhèn)痛機制，其中樞性鎮(zhèn)痛機制作用于5-羥色胺能神經系統(tǒng)，激活下行性疼痛抑制系統(tǒng)，抑制痛覺沖動向中樞傳導。在創(chuàng)傷性腦損傷后，痛覺沖動的傳入會激活中樞神經系統(tǒng)的疼痛相關通路，導致神經細胞的興奮性異常升高，影響神經功能。恩再適通過作用于5-羥色胺能神經系統(tǒng)，調節(jié)神經遞質的釋放，抑制痛覺沖動的傳導，減輕疼痛對神經細胞的刺激，從而保護神經功能。其外周性鎮(zhèn)痛機制抑制炎癥介質緩激肽的生成，減少炎癥反應對神經組織的損傷。炎癥介質緩激肽在創(chuàng)傷后的炎癥反應中起著重要作用，它能夠刺激神經末梢，引起疼痛，并參與炎癥細胞的趨化和活化，加重神經組織的損傷。恩再適通過抑制緩激肽的生成，減輕炎癥反應，降低神經組織的損傷程度，為神經功能的恢復創(chuàng)造有利條件，間接改善神經行為。此外，恩再適對神經癥狀的改善作用也不容忽視。恩再適能夠改變下丘腦神經元異常放電，而下丘腦在調節(jié)神經系統(tǒng)功能和維持內環(huán)境穩(wěn)定方面起著關鍵作用。創(chuàng)傷性腦損傷可能導致下丘腦神經元的功能紊亂，出現(xiàn)異常放電，進而影響神經行為。恩再適通過抑制下丘腦腹內側核神經發(fā)射活動、調節(jié)植物神經功能以及改善末梢血液循環(huán)，來緩解冷感、麻木等不適癥狀。這些神經癥狀的緩解有助于提高神經細胞的興奮性和傳導性，促進神經功能的恢復，從而改善大鼠的神經行為。4.2恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦水腫和血腦屏障的影響創(chuàng)傷性腦損傷后，血腦屏障的破壞和腦水腫的形成是導致腦組織損傷和神經功能障礙的重要病理生理過程。血腦屏障由腦微血管內皮細胞、基膜、星形膠質細胞終足等組成，正常情況下，它能夠維持腦組織內環(huán)境的穩(wěn)定，阻止有害物質進入腦組織。然而，創(chuàng)傷性腦損傷會導致血腦屏障的結構和功能受損，使其通透性增加。在本實驗中，單純損傷組大鼠的血腦屏障通透率顯著升高，這是由于創(chuàng)傷導致腦微血管內皮細胞受損，細胞間緊密連接破壞，使得伊文氏藍等大分子物質能夠透過血腦屏障進入腦組織。血腦屏障通透性的增加，進一步引發(fā)了腦水腫。水分和電解質大量進入腦組織間隙，導致腦組織腫脹，腦含水量增加。腦水腫不僅會壓迫周圍的腦組織，影響神經細胞的正常代謝和功能，還可能導致顱內壓升高，進一步加重腦組織的損傷。而恩再適治療組的血腦屏障通透率和腦含水量均明顯低于單純損傷組，且存在量效關系，高劑量組效果最為顯著。這表明恩再適能夠有效地降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的血腦屏障通透率，減輕腦水腫的程度。從生理機制角度分析，恩再適可能通過多種途徑發(fā)揮作用。恩再適的抗炎作用可能是減輕腦水腫和保護血腦屏障的重要機制之一。創(chuàng)傷性腦損傷會引發(fā)炎癥反應，炎癥介質如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）等大量釋放。這些炎癥介質能夠損傷腦微血管內皮細胞，破壞細胞間緊密連接，從而增加血腦屏障的通透性。恩再適可以抑制炎癥介質的釋放，減輕炎癥反應對血腦屏障的損傷。有研究表明，恩再適能夠下調TNF-α、IL-1β等炎癥因子的表達，減少炎癥細胞的浸潤，從而保護血腦屏障的完整性。炎癥反應還會導致氧化應激增強，產生大量的自由基，如超氧陰離子、羥自由基等。這些自由基能夠攻擊細胞膜上的脂質、蛋白質和核酸，導致細胞膜損傷，進一步加重血腦屏障的破壞和腦水腫的形成。恩再適可能通過調節(jié)氧化應激反應，減少自由基的產生，增強抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等，來減輕氧化應激對血腦屏障和腦組織的損傷。恩再適還可能通過調節(jié)腦微血管內皮細胞的功能來保護血腦屏障。腦微血管內皮細胞是血腦屏障的重要組成部分，其功能狀態(tài)直接影響血腦屏障的通透性。恩再適中的生物活性物質可能作用于腦微血管內皮細胞，促進其增殖和修復，增強細胞間緊密連接的穩(wěn)定性，從而降低血腦屏障的通透性。有研究發(fā)現(xiàn)，恩再適能夠上調腦微血管內皮細胞中緊密連接蛋白如ZO-1、Occludin等的表達，增加緊密連接的數(shù)量和強度，進而保護血腦屏障。恩再適對神經細胞的保護作用也可能間接有助于減輕腦水腫和保護血腦屏障。神經細胞損傷會釋放一些神經遞質和細胞因子，這些物質可能會影響腦微血管內皮細胞的功能和血腦屏障的通透性。恩再適通過促進神經細胞的修復和再生，減少神經遞質和細胞因子的異常釋放，從而維持血腦屏障的正常功能。在本實驗中，尼氏染色結果顯示，恩再適治療組的神經細胞損傷明顯減輕，這為血腦屏障的保護提供了有利的微環(huán)境。4.3恩再適對創(chuàng)傷性大鼠神經元的保護作用在創(chuàng)傷性腦損傷中，神經元損傷是導致神經功能障礙的關鍵因素之一。本實驗通過尼氏染色觀察發(fā)現(xiàn)，假損傷組海馬組織的神經細胞排列整齊、形態(tài)完整，細胞核大而圓，核仁明顯，尼氏小體數(shù)量多，表明神經細胞處于正常的生理狀態(tài)。而單純損傷組致傷側的海馬組織神經細胞減少，出現(xiàn)了細胞核溶解、核碎裂、核固縮、尼氏小體消失等變性特征，以海馬的CA1區(qū)及CA2區(qū)最為多見，這表明創(chuàng)傷性腦損傷對神經元造成了嚴重的損害。恩再適治療組與單純損傷組相比，致傷側海馬組織神經細胞排列比較整齊，細胞核飽滿，核仁較清晰，僅有少量散在的胞核固縮，且尼氏小體數(shù)量增多。這充分說明恩再適對創(chuàng)傷性腦損傷后的神經元具有顯著的保護作用。從細胞層面分析，恩再適的神經修復作用是保護神經元的重要機制之一。恩再適中的生物活性物質能夠促進神經軸突生長。在創(chuàng)傷性腦損傷后，神經軸突受損，導致神經信號傳導受阻，神經元之間的聯(lián)系被破壞。恩再適能夠刺激神經軸突的生長，使受損的神經軸突得以修復和再生，重新建立神經元之間的連接，恢復神經信號的傳導通路，從而保護神經元的功能。有研究表明，將牛痘疫苗致炎兔皮提取液加入從嗜鉻細胞瘤中得到的PC12h細胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天，與常規(guī)培養(yǎng)液對比，神經軸突生長迅速，細胞膜表面的微絨毛或微粒數(shù)量亦明顯增加，此作用與神經生長因子的神經活化作用很相似。恩再適還可促進雪旺氏細胞繁殖。雪旺氏細胞對神經元的存活和功能維持起著至關重要的作用，它能夠包裹神經軸突，形成髓鞘，保護軸突并提高神經沖動的傳導速度。在創(chuàng)傷性腦損傷后，雪旺氏細胞的數(shù)量和功能會受到影響，進而影響神經元的正常功能。恩再適通過促進雪旺氏細胞的繁殖，增加其數(shù)量，使其更好地發(fā)揮對軸突的保護和支持作用，為神經元的修復和再生提供有利的環(huán)境。實驗表明，牛痘疫苗致炎兔皮提取液使S期雪旺細胞明顯增多，細胞計數(shù)亦明顯高于對照組，提示其可促進周圍神經損傷的修復，這對于保護神經元同樣具有重要意義。從分子層面來看，恩再適可能通過調節(jié)相關基因和蛋白的表達來保護神經元。創(chuàng)傷性腦損傷會導致一系列基因和蛋白的表達異常，這些異常表達會影響神經元的存活、增殖和分化。恩再適可能通過調節(jié)神經生長因子（NGF）、腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）等神經營養(yǎng)因子的表達，促進神經元的存活和修復。神經營養(yǎng)因子能夠與神經元表面的受體結合，激活細胞內的信號傳導通路，促進神經元的生長、分化和存活。恩再適可能通過上調NGF、BDNF等神經營養(yǎng)因子的表達，為神經元提供營養(yǎng)支持，增強神經元的抗損傷能力。恩再適還可能通過調節(jié)凋亡相關基因和蛋白的表達，抑制神經元的凋亡。在創(chuàng)傷性腦損傷后，神經元會發(fā)生凋亡，導致神經細胞數(shù)量減少。恩再適可能通過下調促凋亡蛋白如Bax的表達，上調抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達，抑制神經元的凋亡，從而保護神經元。4.4恩再適腦保護作用的量效關系分析在本實驗中，通過設置不同劑量的恩再適實驗組，對恩再適腦保護作用的量效關系進行了深入研究。從神經行為評分結果來看，恩再適治療組與單純損傷組相比，評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且恩再適高劑量組與恩再適中、小劑量組相比，評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明隨著恩再適劑量的增加，其對神經行為障礙的改善效果更為顯著，存在明顯的量效關系。在腦含水量和血腦屏障通透率方面，與單純損傷組比較，恩再適治療組均可使腦含水量、血腦屏障通透率不同程度的降低，差別具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。恩再適高劑量組與恩再適中、小劑量組相比，腦含水量和血腦屏障通透率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），進一步證實了恩再適在降低腦含水量和血腦屏障通透率方面存在量效關系。從形態(tài)學觀察結果也能發(fā)現(xiàn)量效關系的體現(xiàn)。大體觀察中，恩再適小、中劑量組腦表面的挫傷灶范圍及硬膜下血腫量有所減小，恩再適高劑量組腦表面挫裂傷已不明顯；尼氏染色顯示，恩再適治療組與單純損傷組相比，致傷側海馬組織神經細胞排列比較整齊，細胞核飽滿，核仁較清晰，僅有少量散在的胞核固縮，且尼氏小體數(shù)量增多，高劑量組的改善效果更為突出。這種量效關系的存在，可能與恩再適的藥理作用機制相關。恩再適中的生物活性物質可能通過多種途徑發(fā)揮腦保護作用，隨著劑量的增加，其對神經修復、抗炎、抗氧化等作用的發(fā)揮更為充分。在神經修復方面，更高劑量的恩再適可能促進更多的神經軸突生長，加快雪旺氏細胞繁殖，從而更好地恢復神經功能。在抗炎方面，可能更有效地抑制炎癥介質的釋放，減輕炎癥反應對腦組織的損傷。在抗氧化方面，可能增強抗氧化酶的活性，更有力地清除自由基，減少氧化應激對腦組織的損害。恩再適的量效關系研究結果對于臨床應用具有重要的指導意義。在臨床治療創(chuàng)傷性腦損傷時，醫(yī)生可以根據患者的具體情況，合理調整恩再適的用藥劑量，以達到最佳的治療效果。對于病情較輕的患者，可以采用相對較低的劑量；而對于病情較重的患者，則可以適當增加劑量，以充分發(fā)揮恩再適的腦保護作用。但同時，也需要考慮到藥物的安全性和不良反應，避免因劑量過高而導致不良反應的發(fā)生。4.5研究結果的臨床應用前景本研究結果顯示恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦具有顯著的保護作用，這為其在創(chuàng)傷性顱腦損傷臨床治療中的應用展現(xiàn)了廣闊的前景。在神經功能恢復方面，臨床實踐中，創(chuàng)傷性顱腦損傷患者常遺留各種神經功能障礙，如肢體運動障礙、認知功能障礙等，嚴重影響患者的生活質量。恩再適能夠有效改善創(chuàng)傷性大鼠的神經行為障礙，提示在臨床上，它可能有助于促進患者神經功能的恢復。對于那些因創(chuàng)傷導致肢體癱瘓的患者，恩再適或許可以通過促進神經軸突生長和雪旺氏細胞繁殖，增強神經信號的傳導，幫助患者恢復肢體的運動功能。在認知功能恢復方面，恩再適可能通過調節(jié)神經遞質和神經信號通路，改善患者的記憶、注意力和思維能力，使患者能夠更好地回歸社會和家庭。針對腦水腫和血腦屏障損傷，創(chuàng)傷性顱腦損傷后的腦水腫和血腦屏障破壞是導致病情加重和預后不良的重要因素。目前臨床上治療腦水腫主要采用脫水劑，如甘露醇等，但長期或大量使用甘露醇可能會導致電解質紊亂、腎功能損害等不良反應。恩再適能夠降低創(chuàng)傷性大鼠的腦含水量和血腦屏障通透率，這意味著在臨床治療中，恩再適可作為一種輔助治療藥物，與傳統(tǒng)的脫水劑聯(lián)合使用，既能增強治療效果，又能減少脫水劑的用量和不良反應。對于血腦屏障受損的患者，恩再適可能通過抑制炎癥反應和調節(jié)腦微血管內皮細胞功能，保護血腦屏障的完整性，減少有害物質進入腦組織，為腦組織的修復創(chuàng)造良好的內環(huán)境。從神經元保護角度來看，神經元損傷是創(chuàng)傷性顱腦損傷的核心病理改變之一，且神經元一旦受損，其修復和再生能力有限。恩再適對創(chuàng)傷性大鼠神經元具有明顯的保護作用，在臨床上，有望為神經元損傷的患者提供有效的治療手段。通過促進神經元的存活和修復，恩再適可以減少神經元的凋亡，維持神經元的正常功能，從而改善患者的神經功能預后。對于一些損傷程度較輕的患者，恩再適的早期干預可能能夠阻止神經元損傷的進一步發(fā)展，促進神經功能的完全恢復；對于損傷程度較重的患者，恩再適也可以在一定程度上減輕神經元損傷的程度，為后續(xù)的康復治療提供更好的基礎。恩再適的量效關系研究結果對臨床用藥具有重要的指導意義。在臨床應用中，醫(yī)生可以根據患者的具體病情和身體狀況，精確調整恩再適的用藥劑量。對于輕度創(chuàng)傷性顱腦損傷患者，可以采用較低劑量的恩再適進行治療，既能達到治療效果，又能減少藥物的不良反應；對于重度創(chuàng)傷性顱腦損傷患者，則可以適當增加恩再適的劑量，以充分發(fā)揮其腦保護作用。還需要密切關注患者對藥物的反應，及時調整用藥方案，確保治療的安全性和有效性。將恩再適應用于創(chuàng)傷性顱腦損傷的臨床治療，有望為患者帶來更好的治療效果，改善患者的預后。但在實際應用之前，還需要進一步開展大規(guī)模的臨床試驗，深入研究其安全性和有效性，以確定最佳的用藥方案和治療時機，使其能夠更好地造福于患者。五、結論5.1研究主要發(fā)現(xiàn)總結本研究通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O計和多維度的檢測指標，深入探究了恩再適對創(chuàng)傷性大鼠腦的保護作用。結果顯示，恩再適能顯著改善TBI后大鼠神經行為障礙，降低TBI后腦水腫程度，抑制血腦屏障的破壞，且可保護神經元細胞，證明其對于TBI具有一定的治療作用。在神經行為方面，恩再適治療組大鼠的神經行為障礙評分明顯低于單純損傷組，且隨著恩再適劑量的增加，評分進一步降低，高劑量組效果最為顯著。這表明恩再適能夠有效改善創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的神經行為障礙，促進神經功能的恢復。從神經修復機制來看，恩再適中的生物活性物質可能通過促進神經軸突生長和雪旺氏細胞繁殖，為神經信號的傳導提供物質基礎，從而改善神經行為。恩再適的鎮(zhèn)痛作用也可能在其中發(fā)揮了重要作用，通過抑制痛覺沖動向中樞傳導和減少炎癥介質緩激肽的生成，減輕疼痛對神經細胞的刺激，間接改善神經行為。對于腦水腫和血腦屏障，與假損傷組相比，恩再適小、中、高劑量組和單純損傷組大鼠的腦含水量、血腦屏障通透率均有不同程度的增高；而與單純損傷組比較，恩再適治療組均可使腦含水量、血腦屏障通透率不同程度的降低，差別具有統(tǒng)計學意義。這充分說明恩再適能夠有效地降低創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的血腦屏障通透率，減輕腦水腫的程度。從作用機制上分析，恩再適可能通過抑制炎癥介質的釋放，減輕炎癥反應對血腦屏障的損傷；調節(jié)氧化應激反應，減少自由基的產生，增強抗氧化酶的活性，來減輕氧化應激對血腦屏障和腦組織的損傷。恩再適還可能通過調節(jié)腦微血管內皮細胞的功能，促進其增殖和修復，增強細胞間緊密連接的穩(wěn)定性，從而降低血腦屏障的通透性。在神經