實(shí)驗(yàn)動物骨髓細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)骨髓細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)研究的核心材料，廣泛服務(wù)于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究。規(guī)范的骨髓細(xì)胞制備流程是保障后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如細(xì)胞培養(yǎng)、染色體分析、流式檢測等）可靠性的前提。本指導(dǎo)結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，從實(shí)驗(yàn)材料、操作步驟到質(zhì)量控制，系統(tǒng)闡述骨髓細(xì)胞的制備方法，為相關(guān)研究提供實(shí)用參考。一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備（一）實(shí)驗(yàn)動物選擇SPF級實(shí)驗(yàn)動物（如C57BL/6小鼠、SD大鼠等），年齡6-8周，雌雄不限，健康狀態(tài)良好（無感染、無腫瘤、活動正常）。實(shí)驗(yàn)前需通過動物倫理審查，處死方法需符合“3R”原則（替代、減少、優(yōu)化）。（二）器械與耗材解剖器械：無菌手術(shù)剪（直剪、彎剪各1把）、眼科鑷（尖頭、鈍頭各1把）、解剖盤（鋪無菌濾紙）；細(xì)胞操作器械：1ml無菌注射器（帶4號針頭）、15ml/50ml無菌離心管、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、無菌移液管（1ml、5ml）；檢測設(shè)備：倒置顯微鏡（帶相差功能）、低速離心機(jī)（控溫4℃）。（三）試劑與溶液緩沖液：預(yù)冷的PBS緩沖液（含1%青霉素-鏈霉素，pH7.2-7.4），使用前4℃平衡；抗凝劑：肝素鈉溶液（濃度100U/ml，小鼠每只使用0.1-0.2ml，大鼠酌情增加）；染色液：0.4%臺盼藍(lán)染色液（用于細(xì)胞活率檢測）。二、實(shí)驗(yàn)操作步驟（一）動物處死與消毒采用頸椎脫臼法（或過量麻醉法，如戊巴比妥鈉腹腔注射）處死動物，操作時(shí)確保動物無痛苦。處死成功后，用75%酒精棉球擦拭四肢及軀干，置于無菌解剖盤內(nèi)，避免皮膚微生物污染骨髓。（二）骨髓取材（以小鼠股骨、脛骨為例）1.暴露骨骼：沿后肢皮膚縱行剪開，分離肌肉組織，暴露雙側(cè)股骨（大腿骨）和脛骨（小腿骨）。用手術(shù)剪斜剪股骨兩端骨骺（靠近髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)處，角度約45°），保留中間骨髓腔；同理處理脛骨（剪斷兩端骨骺）。2.固定骨骼：用眼科鑷固定骨骼一端（如股骨近端），使骨髓腔開口朝上，便于后續(xù)沖洗。（三）骨髓細(xì)胞沖洗1.吸取預(yù)冷的PBS（含肝素）0.5-1ml，將4號針頭插入骨髓腔（針頭斜面朝上，避免刺破對側(cè)骨壁），緩慢推注液體，可見骨髓細(xì)胞隨液體從另一端流出，收集至15ml離心管中。2.每根骨骼沖洗2-3次（股骨、脛骨各2根，共4根骨骼），確保細(xì)胞充分收集。沖洗時(shí)可輕輕旋轉(zhuǎn)針頭，避免局部壓力過大損傷細(xì)胞。（四）細(xì)胞收集與處理1.離心富集：將收集的骨髓細(xì)胞懸液于4℃、1000rpm離心5min，棄上清（注意保留少量液體，避免細(xì)胞干燥）。2.重懸細(xì)胞：加入1-2ml新鮮預(yù)冷PBS，用移液管輕柔吹打（避免劇烈振蕩），制成單細(xì)胞懸液。此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)或活率檢測。（五）質(zhì)量檢測（細(xì)胞活率與形態(tài)）1.活率檢測：取10μl細(xì)胞懸液與10μl臺盼藍(lán)染色液混合，靜置2-3min后，滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，顯微鏡下計(jì)數(shù)。活細(xì)胞（未被染色）比例應(yīng)≥90%（若用于細(xì)胞培養(yǎng)，活率需>90%；用于涂片染色，可適當(dāng)降低但需>80%）。2.形態(tài)觀察：顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，正常骨髓細(xì)胞應(yīng)呈單個(gè)分散、圓形，無明顯聚集或破碎。三、注意事項(xiàng)（一）動物倫理與操作規(guī)范處死方法需經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，操作時(shí)避免動物痛苦；所有器械、試劑需無菌處理，操作在超凈臺或無菌環(huán)境下進(jìn)行，防止微生物污染。（二）細(xì)胞活力保護(hù)全程低溫操作（4℃），縮短處死到細(xì)胞重懸的時(shí)間（建議≤15min），減少細(xì)胞凋亡或壞死；沖洗液預(yù)冷，避免溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞代謝異常。（三）個(gè)人防護(hù)與廢棄物處理操作時(shí)戴手套、口罩，避免動物組織或血液接觸皮膚；實(shí)驗(yàn)后，器械高壓滅菌，動物尸體按生物安全規(guī)范處理（如焚燒或?qū)Ｓ萌萜鞣獯妫?。四、結(jié)果與分析成功制備的骨髓細(xì)胞懸液應(yīng)呈現(xiàn)均勻渾濁狀，無明顯凝血塊或組織碎片。顯微鏡下觀察：細(xì)胞分散良好，形態(tài)完整，無明顯聚集；臺盼藍(lán)染色后，活細(xì)胞比例≥90%（若用于細(xì)胞培養(yǎng)，需進(jìn)一步調(diào)整濃度至1×10?cells/ml左右）。若后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如原代培養(yǎng)、染色體核型分析）對細(xì)胞質(zhì)量要求更高，可通過“梯度離心”（如Ficoll密度梯度離心）進(jìn)一步純化單核細(xì)胞，或用含血清的培養(yǎng)基重懸以提高細(xì)胞貼壁率。五、常見問題及解決辦法（一）細(xì)胞懸液出現(xiàn)凝血塊原因：抗凝劑不足、沖洗不及時(shí)或血液凝固。解決：增加肝素濃度（如從50U/ml調(diào)整至100U/ml），處死動物后立即沖洗，避免血液在骨髓腔中凝固。（二）細(xì)胞活率低（<80%）原因：操作時(shí)間過長、溫度過高、器械擠壓損傷。解決：優(yōu)化操作流程，全程冰浴；使用鋒利器械減少骨骼擠壓；縮短處死到重懸的時(shí)間（≤10min）。（三）骨髓沖洗不充分，細(xì)胞量少原因：骨骺剪斷不當(dāng)（骨髓腔未完全暴露）、針頭堵塞。解決：調(diào)整剪刀角度（45°斜剪），確保骨髓腔開口通暢；使用新針頭，沖洗時(shí)適當(dāng)加大推注力度（但避免損傷細(xì)胞）。通過嚴(yán)格遵循上述操作流程，可獲得