土壤、沉積物和固體廢物二惡英類的篩查酶聯免疫法dibenzo-p-dioxins(PCDDs)andpolychlorinateddibenzofurans(PCDFs)2012-02-15發(fā)布2012-09-01實施重慶市質量技術監(jiān)督局發(fā)布Ⅱ 12規(guī)范性引用文件 13術語和定義、符號和縮略詞 14方法原理 25試劑和材料 26儀器設備 37樣品采集 3 510標準曲線繪制 612檢測限、精密度和準確度 713質量保證和質量控制 814報告 8 9附錄A(規(guī)范性附錄)二惡英類分析流程圖 附錄B(資料性附錄)樣品蒸發(fā)模式 附錄C(資料性附錄)標準溶液濃度序列 附錄D(資料性附錄)標準曲線控制參數 I本標準根據GB/T1.1-2009規(guī)定進行編制。本標準為推薦性標準。本標準為首次發(fā)布。本標準由重慶市環(huán)境保護局提出并歸口。本標準起草單位：重慶市固體廢物管理中心。本標準起草人：廖世國陽劍蔡洪英季祥海鄭鴻柯本標準自2012年9月1日實施。1本標準規(guī)定了采用酶聯免疫法篩查土壤、沉積物和固體廢物(包含飛灰、鹽泥、工業(yè)廢渣、污泥)中的多氯代二苯并二惡英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)方法。本標準適用于土壤、沉積物和固體廢物中二惡英類的篩查，利用酶聯免疫法篩查土壤、沉積物和凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。HJ494-2009《水質采樣技術指導》二惡英類所有化合物互為同類物。二惡英類共有210種同類物。指在2,3,7,8位均有氯原子取代的二惡英類同類物，共有17種，其中多氯代二苯并二惡英有7種，多氯代二苯并呋喃有10種。各二惡英類同類物濃度折算為相當于2,3,7,8-四氯代二苯并二惡英毒性的等價濃度，本標準檢測結果為Bio-TEQ,經換算后可轉換為I-TEQ。在20-26℃下，使二惡英類與酶聯免疫測定管中的抗體充分結合的過程。2多氯代二苯并二惡英，有75種同類物。多氯代二苯并呋喃，有135種同類物。3.2.32,3,7,8-TCDD本標準采用的一種試劑盒，包含酶聯免疫測定管，樣品稀釋液，HRP,HRP底物，終止液(1mol/L鹽酸溶液),TritonX-100,保留劑。酶聯免疫法的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或檢樣品(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形參見圖1和附錄A“二惡英分析流程圖”。除非另有說明，分析試劑均使用農殘級試劑，并進行空白實驗。有機溶劑濃縮萬分之一倍，不得35.4正己烷5.5丙酮5.8正十四烷：分析純5.11SP3-60試劑盒(含40mL萃取瓶、碳柱、鋼珠和酸性硅膠),SP2-ST試劑盒(含硅膠柱和空柱),SP2-RT試劑盒(含活塞),DF1-60試劑盒5.1225mL容量瓶5.13連續(xù)移液器(100μL-2mL),微量移液器(0-10μL,0-100μL)。5.15玻璃試管(15-20mL)5.17過濾篩(200目)6.1電子天平(百分之一)6.2平板軌道振蕩器(可做橢圓旋轉)6.3離心機6.4氮氣吹干儀6.7分光光度計(波長450nm)土壤采集按HJ/T166-2004《土壤環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》中采樣的規(guī)定方法實施。沉積物采集按HJ494-2009《水質采樣技術指導》中采樣的規(guī)定方法實施。固體廢物采集按HJ/T20-1998《8.1土壤和沉積物樣品8.1.1所有與實驗相關的玻璃器皿，都要預先用甲苯清洗，干燥。空白值偏高時，可考慮使用馬弗爐48.1.2樣品實驗前應進行風干、磨碎和過篩(200目過濾篩)處理。8.1.3樣品混勻后稱取5.00g加入到40mL萃取瓶(SP3-60試劑盒)中(每個瓶子寫好標簽)。8.1.4每個萃取瓶中加入5g酸洗石英砂、10-20g無水硫酸鈉，再加入3顆鋼珠(在此步添加8.1.5每個萃取瓶中加入20mL正己烷和丙酮混合溶液(體積比1:1),擰緊瓶蓋，將萃取瓶放入平板軌道振蕩器中進行橢圓震蕩4小時，振動頻率為180-200次/分。此步同時計算正己烷和丙酮混合溶液 (體積比1:1)的密度。8.1.6震蕩完畢后取出萃取瓶靜置6-8小時，用吸量管將萃取瓶中上清液全部轉移到已標記的玻璃試管中(玻璃試管事先稱重),轉移完成后對玻璃試管進行稱重，記錄所轉移上清液的質量。再根據記錄8.1.7每個玻璃試管中加入0.25mL正十四烷，將每個玻璃試管置于氮氣吹干儀中在40℃水溫下進行8.1.8氮吹完畢后每個玻璃試管中加入5mL正己烷，若玻璃試管中溶液顏色較深則應加入1-2g酸性硅膠(SP3-60試劑盒)處理，待溶液澄清。8.1.9預洗柱：硅膠柱(SP2-ST)中加入10mL正己烷，正己烷從柱子底端滴下，從SP3-6允許氣泡產生。同時硅膠柱中正己烷應覆蓋硅膠(每根硅膠柱做好標記)。8.1.10預洗后的硅膠柱中加入8.1.8步驟中玻璃試管中溶液進行過柱，分2次每次用2mL正己烷潤洗8.1.11_分2次過柱，每次加入15mL正己烷到硅膠柱中過柱。第二次過柱時溶劑距離碳柱頂部1-2cm時停止加壓(保持碳柱的濕潤狀態(tài))。8.1.12從硅膠柱上取下碳柱，將其平口端連接到空柱(SP2-ST試劑盒)底部，加入6mL甲苯和正己烷混合溶液(1:1)到空柱中進行加壓過柱，待溶液流至碳柱頂部時停止加壓(保持碳柱濕潤狀態(tài))(空8.1.13從空柱上取下碳柱，將其斜口端接到同一根空柱上，加入12mL甲苯加壓過柱進行洗脫，洗脫液接收在玻璃試管中，甲苯完全流過碳柱，直至不再有液體滴下為止(玻璃試管作好標記)。8.1.14根據實驗樣品情況選擇蒸發(fā)模式(見附錄B),在玻璃試管中加入保留劑(DF1-60試劑盒)(以附錄B中B模式為例，B模式下加入量為62.5μL),在70℃水溫下進行氮吹，至甲苯全部清除。8.1.15氮吹完畢后取出試管，放置于離心機中在1500-2000轉每分鐘轉速下離心5分鐘，將所有樣品8.2.1所有與實驗相關的玻璃器皿，都要預先用甲苯清洗，干燥?？瞻字灯邥r，可考慮使用馬弗爐8.2.2潤洗索氏提取器，接250mL甲苯到旋轉蒸發(fā)儀的圓底燒瓶中進行索氏提取，潤洗約2小時。8.2.3樣品實驗前應進行風干、磨碎和過篩(200目過濾篩)處理。58.2.4樣品混勻后稱取0.25g用2mol/L鹽酸處理1小時。鹽酸的用量為每1g樣品加不少于20mmol璃纖維包好，加入到潤洗后的圓底燒瓶中。過濾后的鹽酸處理液用100mL二氯甲烷萃取三次。8.2.5在8.2.4步圓底燒瓶中加入250mL甲苯用索氏提取器進行索氏提取，提取16-20小時(在此步8.2.6提取完畢后，將圓底燒瓶中的甲苯提取液和8.2.4步驟中的二氯甲烷萃取液合并加入到旋轉蒸發(fā)儀的梨形瓶中，圓底燒瓶和萃取瓶用少量甲苯各潤洗2次后轉移到梨形8.2.7樣品溶液在旋轉蒸發(fā)儀中進行蒸發(fā)，水浴溫度設置80℃,真空泵壓力調整至0.08MPa,蒸發(fā)至剩余溶液體積為2-3mL后停止，用吸量管將溶液轉入25mL容量瓶中，用少量正己烷潤洗梨形瓶2-3次以8.2.8預洗柱：硅膠柱(SP2-ST)中加入10mL正己烷，正己烷從柱子底端滴下，從SP3-60試劑盒中能產生氣泡。同時硅膠柱中正己烷應覆蓋硅膠(每根硅膠柱做好標記)。8.2.9用移液器從8.2.7步驟定溶后的容量瓶中移取樣品溶液3.0mL加入到預洗后的硅膠柱中，進行8.2.10分2次過柱，每次加入15mL正己烷到硅膠柱中過柱，第二次過柱時當溶劑距離碳柱頂部1-2cm時停止加壓(保持碳柱的濕潤狀態(tài))。8.2.11從硅膠柱上取下碳柱，將其平口端接到空柱(SP2-ST試劑盒)底部，加入6mL甲苯和正己烷混合溶液(體積比1:1)到空柱中進行加壓過柱，待溶液流至碳柱頂部時停止加壓(保持碳柱濕潤狀態(tài))(空柱做好標記)。8.2.12從空柱上取下碳柱，將其斜口端連接到同一根空柱上，加入12mL甲苯加壓過柱進行洗脫，洗脫液接收在玻璃試管中，甲苯完全流過碳柱，直到不再有液體滴下為止(玻璃試管作好標記)。8.2.13根據實驗樣品情況選擇蒸發(fā)模式(以附錄B中B模式為例),在玻璃試管中加入保留劑(B模式下加入量為62.5μL)(DF1-60試劑盒),在70℃水溫下進行氮吹，至甲苯溶液全部清除。8.2.14氮吹完畢后取出試管，放置于離心機中在1500-2000轉每分鐘轉速下離心5分鐘，將所有樣品9酶聯免疫分析9.1將DF1-60試劑盒內所有試劑回溫至20-26℃才可使用。使用前，將所有溶劑輕輕地倒置混勻。器移取10μL的TritonX-100直接加入到100mL去離子水中混勻，制作出濃度為0.01%V/V的清洗劑。9.3從DF1-60試劑盒中取出酶聯免疫測定管，編號排列后用去離子水清洗每個測定管，重復清洗39.5每個酶聯免疫測定管中加入500μL樣品稀釋液(DF1-60試劑盒)。9.6添加標準品(2,3,7,8-TCDD標準品):用微量移液器移取50μL標準品加入到已標記的酶聯免疫6搖勻(注意標準品的添加，應是從低濃度到高濃度)。9.7根據蒸發(fā)模式要求，8.1.15和8.2.14步驟中離心后的每個玻璃試管中加入甲醇(B模式下加入量為50μL)到試管底部，震蕩，混勻15秒后讓試管保持垂直15—30秒，保證液體富集在試管底部，立9.8加入待測樣品：用微量移液器在玻璃試管中移取50μL樣品溶液加入到已標記的酶聯免疫測定管搖勻樣品，在20-26℃溫度下孵育12到24個小時。重復清洗4次。清洗完畢后倒置除去測定管中水分，然后加入HRP(辣根過氧化物酶)(DF1-60試劑盒)進行第二次孵育，時間為15分鐘。孵育完成后用去離子水進行清洗，每次1mL,重復清洗4次。清洗完畢后倒置除去測定管中水分，然后加入HRP底物(DF1-60試劑盒)進行第三次孵育，時間為30分鐘。孵育完成后加入終止液1mol/L鹽酸溶液(DF1-60試劑盒)。9.10使用分光光度計(450nm波長),加入不少于1mL去離子水到空白酶聯免疫測定管并置于光度計上對光度計進行校正。擦干每個酶聯免疫測定管的外表面并放置于光度計上測定每個測定管的吸光度將2,3,7,8-TCDD用甲醇配制成0、3.2、10、32和100pg/管(每個酶聯免疫測定管中標準品的添加量均為50μL)的系列標準工作溶液(見附錄C),分別進行酶聯免疫分析，測得各濃度所對應的吸光度根據式(1)作2,3,7,8-TCDD的劑量-效應關系標準曲線。如圖2所示，標準曲線為倒“S”型。Y=((A-D)/(1+(X/C)2))+DX=pg/tube(2,3,7,8-TCDD標準品的毒性當量值)Y=每個酶聯免疫測定管所測得的吸光度值與0濃度測得的吸光度值的百分比7圖2.2,3,7,8-TCDD劑量-效應關系標準曲線11結果計算利用分光光度計測定二惡英類樣品時得到的吸光度值M,測定0濃度時得到的吸光度值N,計算出吸光度值的相對值Y。再通過上述的標準曲線求得衍生物換算濃度TEQ(pg/管)即X(pg/管)。按操作步驟進行酶聯免疫檢測，加待測樣品a(g)加入到酶聯免疫測試管中，將相應數據代入公式(1)~(3),計算出每單位樣品重量中的毒性當量。TEQ(pgI-TEQ/g)=TEQ(pg/tube)/axCA注：以上涉及到的符號在本標準中含義相同，本標準CAF取值范圍為1.0-4.0,土壤和沉積物樣品建議取值4.0,固體廢物樣品建議取值2.0。12檢測限、精密度和準確度12.1檢測限本標準方法檢出下限值為4.0ngI-TEQ/kg。12.2精密度同一樣品重復測定相對標準偏差(RSD)變化范圍為5-70%。12.3準確度方法空白加標回收率變化范圍為70-130%。方法樣品加標回收率變化范圍為60-135%。8二惡英類篩查所有批次的實驗所得到的2,3,7,8-TCDD校準標準測定值應在標準曲線質量控制范圍內，實驗所得到的標準曲線方為合格。標準13.2.1應用方法空白來證明系統(tǒng)未被13.3樣品中標記化合物的回收率需要按期評價并做好記錄，每30天對各種基質樣品進行平行樣分析(不少于五個),計算出標記化合物的平均回收率(R)和回收率標準偏差(SR)。13.