1、印跡法（Blotting）技術簡介,李娟 馬曉偉,oct18,2010,定義：,印跡法（Blotting） 是指將樣品轉移到固相載體上，然后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。,Southern blotting 1975年，Edward M. Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜 （NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法 Northern blotting 1979年，McMaster和Carmichael對RNA進行印跡分析，發(fā)明 Northern印跡技術 Western blotting 1979年，George Stark對電泳后的蛋白質分子進行印

2、跡分析從而 發(fā)明western印跡技術,概述,生物大分子印跡法實際上是凝膠電泳技術、固定化技術及分子親和技術三者融為一體的綜合性技術，其核心在于把凝膠電泳已分離的區(qū)帶轉移并印跡于固定化膜上。 蛋白質分析中應用的Western雜交方法與DNA分析應用中的Southern雜交法RNA分析中的Northern雜交法相似，均是把電泳分離的組分從凝膠轉移到一種固相支持體上，并均以針對特定氨基酸或核苷酸序列所制備的特異性樣品作為探針檢測其相同或相似序列。,Southern Blotting,DNA提取 瓊脂糖電泳 印跡轉移 預雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色,Northern Blottin

3、g,RNA提取 瓊脂糖電泳 印跡轉移 預雜交 雜交（變性探針） 洗膜 放射自顯影或顯色,Western Blotting基本原理,在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至膜上，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。,Western Blotting 操作流程,使用的儀器,聚丙烯酰胺凝膠電泳,1.聚丙烯酰胺凝膠電泳 遷移率主要依據其分子量和電荷的差異及形狀等因素 2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 遷移率主要依賴于蛋白質大小,SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,原理： SDS是一種陰離子表面活性劑即去污劑,它可以斷開分子內和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級及三級結構,并與蛋白質的疏水部分相結合,破壞其折疊結構

4、SDS與蛋白質結合后使SDS-蛋白質復合物上帶有大量的負電荷,平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子,這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋,遠遠超過其原來所帶的電荷,從而使蛋白質原來所帶的電荷可以忽略不計,消除了不同分子之間原有的電荷差別,其電泳遷移率主要取決于亞基分子質量的大小,這樣分離出的條帶帶也為蛋白質的亞基,SDS-PAGE 分離膠配方,SDS-PAGE 濃縮膠配方,電泳,上層濃縮膠的電泳電壓要低于分離膠的電泳電壓，使樣品更好的進入凝膠。 電泳時，應采用恒壓的模 式，這樣蛋白質才可以保證恒定的電泳遷移率。 一般采用恒壓濃縮膠80V，30min分離膠110V 時間視所要檢測的蛋白

5、分子量及膠濃度而定。,轉膜后檢測,麗春紅染色 麗春紅帶負電荷，可以與帶正電荷的氨基酸殘基結合，同時麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結合，從而形成紅色的條帶，麗春紅對蛋白的染色是可逆的，染色后可以用PBS或TBS-T溶液洗去,封閉,脫脂奶粉（5） BSA（牛血清白蛋白） Western Blotting 膜封閉液,洗轉印膜：室溫用TBS-T漂洗3次x10min,以盡量洗去轉印膜上的SDS，防止影響后面的抗體結合。 2) 取漂洗的轉印膜，放入5% No-fat milk的封閉液內，搖床震動，室溫封閉2h，也可在4度過夜。 3) 用1xTBS-T ，PH7.6洗液，室溫漂洗3次x10min.,一抗、二

6、抗孵育,1. 把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料袋或者培養(yǎng)皿中，根據抗體效價選擇合適的抗體濃度，將一抗溶液與濾膜溫育。室溫6小時左右，4過夜 2. 倒掉一抗溶液，用TBS-T漂洗液濾膜3次，每次7min 3. 加入用封閉液配制的二抗，搖床上緩慢搖動， 室溫2小時 4. 倒掉二抗溶液，用TBS-T漂洗液濾膜3次，每次7min,即可準備顯影,二抗與底物反應顯色,辣根過氧化物酶法（HRP）,將在暗室中將顯色劑A,B 溶液按1：1混合，后均勻涂抹在膜上結合有二抗的地方即可催化底物發(fā)出熒光 將膠片貼在膜的發(fā)光區(qū)上，根據熒光強弱選擇合適的曝光時間 曝光結束后將膠片放入顯影液中至出現條帶后再放入定影液中,轉膜：膜

7、的選擇，轉膜方法取舍 樣品處理 Western blotting 常見問題分析及其應用 馬曉偉,膜的選擇,轉膜-膜的選擇, 硝酸纖維素膜（NC膜） 價格便宜，簡單快速封閉與非特異性抗體結，通常有0.45m和0.2m兩種規(guī)格的NC膜，大于20kD的蛋白可用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如用0.45m的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現象。 聚偏氟乙烯膜（PVDF膜） PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，對蛋白的吸附能力要遠遠大于NC膜,非常適合于低分子量蛋白的檢測，小分子更不容易滲透下去，截留率高，用之前需在甲醇溶液中浸泡10min。,轉膜-轉膜方

8、法的選取,常用的有濕轉和半干轉 濕轉：濕轉是一種傳統方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。另外用這種方法轉移雙向電泳中常規(guī)使用的大膠比較困難。,轉膜操作流程,轉膜,轉膜電流不予太大，否則容易使膜和膠燒壞，儀器最大電流為400mA 轉膜時間根據目的蛋白的分子量而定，分子量越大，轉膜時間越長,關于轉膜的注意事項： 1.膠在負極，膜靠近正極； 2.轉膜緩沖液一定要事先預冷，最好提前一天配好放4 冰箱； 4.濾紙不要大過膜，防止短路； 5.夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導致轉膜不完全； 6.注意一定要戴手套

9、或用塑料鑷子接觸膜，因為手上的蛋白和油脂會影響轉膜效率并會使膜臟掉； 7.在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發(fā)熱現象，最好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。,半干轉,半干轉移用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。因為電極板直接與濾紙接觸，使凝膠中電場強度盡可能大以快速高效轉移。與濕轉相比，這種方法又快（15-45 分鐘）又好。多數半干轉移方法使用一種以上的緩沖系統，可以同時高效轉移大小不同的蛋白。然而，半干轉移系統因緩沖液較少不適于長時間轉移。,半干轉的電流大小是按照面積來算的，時間是根據蛋白分子大小定的；而濕轉的話電流是恒定的，時間也是根據分子量而定。,兩種轉移系統中都必須注

10、意防止在濾紙、凝膠和膜之間的任何地方存在氣泡，氣泡阻礙轉移并在印跡膜上產生“禿斑”（即非轉移區(qū)）。小分子量的蛋白半干轉效果比較好，大分子量（100KD 以上）建議濕轉,干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5mA/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1V/cm2膠面積。,樣品處理,1培養(yǎng)的細胞（定性）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細 胞脫落）。 對于6孔板來說每孔加200300l，6080的1loading buffer。 100，1min。 用細胞刮刮下細胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 23次。 用干凈的針尖挑

11、絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將EP管置于0后在1400016000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。 待樣品恢復到室溫后上樣。,2培養(yǎng)的細胞（定量）： 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗23遍（冷的PBS有可能使細胞脫落）。 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上1020min。 用細胞刮刮下細胞，收集在EP管后按比例加入loading-Buffer（含DTT ）,100 ，10min。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加load

12、ing buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲存，-70一個月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。,3組織： 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50100mg加1ml裂解液，肺100200mg加1ml裂解液?？墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g離心，4，2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣最好，剩余溶液（溶于1loading buffer）可以低溫儲存，-70一個月，-20一周，4 12天，每次上樣前98，3min。,western顯色的方

13、法主要有以下幾種,i. 放射自顯影 ii. 底物化學發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色 現常用的有底物化學發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學發(fā)光ECL。只要買現成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。,Western Blotting常見問題分析,SDS-PAGE電泳,膠不平？ 凝膠漏液？,膠板洗刷干凈 加入APS和TEMED的量要合適 加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻 溫度合適，受熱不均勻導

14、致膠聚合不均勻 兩塊玻璃板底部要對齊,條帶比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”條帶？,凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調整鹽濃度 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適,轉膜及抗體檢測,凝膠腫脹或卷曲？ 條帶歪斜或漂移？ 單個或多個白點？ 轉膜緩沖液過熱？,可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩沖液中浸泡5-10min 電轉儀長期使用導致海綿變薄，“三明治”結構不緊湊導致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉膜過程注意降溫,背景太高,數據處理及結果分析,1. Photoshop 軟件 2. Image J 軟件 3. Excel 軟件 4.