1、江西省血液中心核酸檢測經(jīng)驗介紹,錢 榕,主要內(nèi)容,中心簡介 核酸檢測實驗室的設置及工作流程 核酸檢測實驗室管理和檢測關(guān)鍵控制點 開站核酸檢測情況,江西省血液中心概況,江西省血液中心于1984年成立，隸屬省衛(wèi)生廳管理的公共衛(wèi)生事業(yè)單位。占地面積63.4畝，總建筑面積21788,現(xiàn)有職工171人，供應省直13家醫(yī)療機構(gòu)臨床用血，2011年總供血量為23.8噸，并承擔全省采供血機構(gòu)質(zhì)量控制與評價、業(yè)務技術(shù)指導、人才培訓及血液相關(guān)的科研等任務。自2006年起，臨床用血已實現(xiàn)100%來自于自愿無償獻血。成分輸血達到99.8%。,中心重視科研工作，致力從臨床輸血治療和開展新技術(shù)治療的需求出發(fā)，開展了血液去

2、除白細胞、血漿病毒滅活等新技術(shù)。2010年4月份，中心與北京、上海、廣州等12個省市15所采供血機構(gòu)一道，被衛(wèi)生部列為我國內(nèi)地首批核酸檢測試點單位。此外，中心先后開展了骨髓移植配血、器官移植配型(基因法)、產(chǎn)前血型血清學檢測、新生兒溶血病檢測、親子鑒定(基因法)等研究工作。,中心核心價值觀,忠誠履行輸血使命精益服務健康人生,中心環(huán)境,標本交接離心區(qū)：用于核酸標本的接收、離心處理； 設備：大容量低溫離心機2臺 混樣區(qū)：用于血液標本開蓋、混樣、以及質(zhì)控品的加樣； 設備：全自動混樣儀HAMILTON STARIVD 2臺、生物安全柜1臺、 移動紫外車3臺； 提取擴增檢測區(qū)：用于核酸的提取、PCR擴增

3、和檢測。 設備：3套 COBAS AmpliPrep+COBAS TaqMan 、服務器1臺、試劑暫存冰箱1臺、移動紫外車3臺,核酸檢測實驗室的設置,核酸檢測實驗室的設置,實驗室平面圖,檢測系統(tǒng)： cobas s 201核酸血液篩查系統(tǒng) 設備配置： 2 STAR+ 3CAP+ 3docking+ 3CTM 試劑組成： cobas TaqScreen MPX Test（96人份，一代） cobas TaqScreen MPX Control Kit（一代：6*6） cobas TaqScreen Wash Reagent,全血標本 標本采集后4小時內(nèi)進行離心處理。樣本離心后先進行常規(guī)酶免檢測，然

4、后將酶免試劑陰性結(jié)果標本進行六混樣核酸檢測。如混樣檢測有反應性，再進行拆分檢測。 機采標本 標本采集后4小時內(nèi)進行離心處理； 加樣模式：六混樣（1機采標本+5全血標本）,核酸檢測實驗室工作流程,核酸檢測（酶免第一批陰性）,23.00,08.00,09.00,10.00,11.00,12.00,13.00,14.00,15.00,16.00,17.00,18.00,19.00,20.00,21.00,22.00,核酸檢測（酶免第二批陰性）,核酸檢測（酶免第三批陰性）,酶免檢測第一批,2 staffs,Start NAT,酶免檢測第二批,酶免檢測第三批,核酸檢測如有陽性結(jié)果，當天進行拆分實驗,核酸

5、檢測實驗室工作流程,核酸檢測陽性樣本拆分實驗,03.00,04.00,06.00,19.00,20.00,21.00,22.00,23.00,24.00,01.00,02.00,1 staff,05.00,07.00,全部樣本在48小時內(nèi)出報告，符合衛(wèi)生部核酸檢測要求,核酸檢測實驗室工作流程,核酸檢測的關(guān)鍵控制點標本,采血管的選擇 留樣方式及注意事項 運輸過程中標本質(zhì)量保證 標本處理方式及細節(jié)解讀 標本檢測,核酸檢測采血管的要求,抗凝劑：首選EDTA和枸櫞酸鹽，避免使用肝素抗凝。 無菌 無DNA酶、無RNA酶： 含分離膠的真空采血管；,標本留取細節(jié)解讀,防污染 留取人員的個人防護，留取前的清潔

6、消毒，留取過程中保持密閉，防止其他可能污染物。 充分混勻 注意樣品采集后的充分混勻，一般上下顛倒次以上，如操作不規(guī)范，則容易出現(xiàn)凝塊，給后續(xù)檢測帶來弊端：核酸檢測出現(xiàn)凝塊報錯，引起人力、試劑等不必要的浪費，增加標本污染風險。 標本量 標本留取應檢查是否足量，如量少，應更換采血管重新留取，杜絕開蓋留取。,NAT標本溶血及影響,溶血：原因多為標本留取中機械作用致紅細胞破裂引起，如標本留取不暢、留取速度過快等；另外，劇烈震蕩也可引起溶血，如運輸顛簸等 溶血對NAT檢測的影響： 血紅蛋白是核酸檢測的主要抑制物之一，可抑制核酸檢測；另外可核酸酶的釋放加速核酸降解。 如何避免溶血現(xiàn)象出現(xiàn)？ 標本留取時將血

7、液順管壁緩慢注入真空管中；另外避免震蕩，以防血細胞破裂而溶血。,NAT標本脂血及影響,脂血是指血液標本采集后，經(jīng)過離心處理，分離出來的血清中含有脂類物質(zhì)。從外觀上看，血漿呈渾濁的乳白色。 脂血對NAT檢測的影響：脂血易引起加樣環(huán)節(jié)液面感應異常報錯；高脂血標本可通過對熒光的屏蔽和吸收作用而干擾檢測。 如何避免留取脂血標本？ 應注意飲食情況等的征詢，可一定程度消除留取脂血標本。,NAT標本中的其它影響因素,內(nèi)源性：免疫球蛋白、蛋白酶、離子等； 外源性：肝素抗凝劑、手套滑石粉、標本容器或采樣器材中含有的抑制物等。,標本的運輸,冷鏈控制 專用標本運輸箱的使用； 確保標本在采集后4小時內(nèi)離心。,核酸標本

8、離心細節(jié)解讀,離心機的選擇：低溫離心機； 離心條件：3000g,20min，應根據(jù)實際進行調(diào)整以確保離心充分； 另外，為更好的消除凝塊，可在離心前再次顛倒混勻；也可在檢測前進行二次離心。,檢測前準備,檢測前核對：狀態(tài)、標識、離心時間、保存條件等； 室溫平衡：如標本在4中保存，檢測前應室溫平衡30分鐘以上（非常重要，否則易產(chǎn)生clot）； 開蓋： 加樣前開蓋； 在生物安全柜中進行；,加樣過程中凝塊報錯原因分析,采血后混勻不充分：局部抗凝效果不佳致凝塊析出； 離心條件不充分：離心力或離心時間不足所致，如血漿中存在的微量血細胞、分離膠、纖維蛋白等為引發(fā)凝塊的原始因素。 加樣前室溫平衡時間不足。 加樣

9、設備問題：為假凝塊，多為設備感應異常、設備硬件與軟件的兼容性欠缺等原因引起，可通過調(diào)整參數(shù)、軟件兼容性等方法解決；,核酸標本的采集、運送、處理和保存的關(guān)鍵點,采血管：抗凝劑、一次性密閉、無菌、無核酸酶及其他擴增抑制物 采集：人員、防污染、采集方式 標本的運送：冷鏈控制？盡可能快？ 標本的處理：離心時間、離心強度，4小時內(nèi)離心 合格標本:外觀質(zhì)量符合要求、容器完整、量夠、,核酸檢測的關(guān)鍵控制點防污染措施,核酸檢測的最大特點是具有強大的擴增能力與極高的靈敏度，這也意味著極其微量的污染即可造成假陽性結(jié)果。,易引發(fā)NAT檢測污染的幾個環(huán)節(jié),標本的開蓋 NAT檢測試劑、外部質(zhì)控品的準備 擴增產(chǎn)物的處理

10、用品的專用與清潔（如手套、紗布等），,基因擴增實驗室管理辦法規(guī)定： 在核酸純化過程中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。,Roche cobas s 201系統(tǒng)防污染設計,全球唯一的三重防污染設計 儀器：全自動封閉系統(tǒng) 反應管：全程封閉狀態(tài)，杜絕交叉污染 試劑：專利的UNG酶消除擴增產(chǎn)物帶來的污染,移動紫外燈照射； 70%乙醇； 日常儀器和架子的維護清潔 新鮮配置的0.5%次氯酸鈉溶液； 實驗室工作臺面和樣本外濺時使用 實驗室通風,其他實驗室防污染措施,溫度在15-30度之間，超出這個范圍儀器報警； 注意除濕，濕度不宜超過60%，超過

11、這個濕度儀器故障率高。,核酸檢測的關(guān)鍵控制點溫度與濕度,核酸檢測實驗室檢測管理,嚴格單向工作流向制度 進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，即：試劑貯存和準備區(qū)標本制備PCR擴增產(chǎn)物分析； 各區(qū)在物理空間上完全互相獨立，使用功能上互相分割； 各區(qū)之間不能有空氣直接相通。 嚴格物品專用制度 各區(qū)使用的儀器設備、移液器、Tip、試管架、筆記本、記號筆、手套等包括清潔用物品都必需執(zhí)行專區(qū)專用原則。 各工作區(qū)域用品必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。,分區(qū)內(nèi)操作流程的合理化 了解實驗室污染的來源，可能產(chǎn)生污染的實驗操作（如陽性樣本、實驗過程中每一次的開蓋過程等） 操作順序應盡量從相

12、對清潔到相對污染（如混樣區(qū)相對清潔度：檢測耗材標本陽性質(zhì)控品),操作順序顛倒時應及時更換手套或進行相應的處理； 養(yǎng)成良好的實驗室操作習慣，規(guī)范行為。 避免攜帶污染 操作人員應注意防止通過頭發(fā)、眼鏡等非專用物品將污染物攜帶到清潔區(qū)； 警惕手套可能接觸污染物或污染其它物品等。,2010年8月9日-2013年7月31日共完成177916份血液標本的核酸檢測。其中拆分檢測586次；拆分出390例酶免陰性而NAT陽性的標本，陽性率為0.22%。 鑒別陽性標本190例，其中188例為HBV陽性，另有1例HBV、HCV合并感染,1例HCV陽性。,血站開展核酸檢測情況,檢測常見現(xiàn)象分析,問題1：初混陽性，拆分陰性標本如何解釋？ 因根據(jù)檢測CT值、擴增曲線等綜合判斷，一般CT值在37以上可考慮為初混時產(chǎn)生了假陽性反