1、第二章 沉 淀 法,基本原理 制備蛋白質 制備核酸,沉淀法,根據(jù)不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，通過沉淀，將目的生物大分子轉入固相沉淀或留在液相，而與雜質得到初步的分離。,第一節(jié) 基本原理,中性鹽沉淀（鹽析法）:多用于蛋白質和酶 有機溶劑沉淀：多用于核酸，也用于蛋白質 選擇性沉淀：熱變性及酸堿變性沉淀法 非離子多聚物沉淀法：聚乙二醇，用于生物大分子,常用的幾種沉淀方法：,第二節(jié) 制備蛋白質,鹽析法 有機溶劑法 選擇性沉淀法 聚乙二醇沉淀法,沉淀法,一、鹽析法,概念：在溶液中加入大量的中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。 基本原理：中性鹽奪走水分子，破壞了水膜，暴露出疏水

2、區(qū)域；同時又中和了電荷，破壞了親水膠體； 分級沉淀：調節(jié)蛋白質的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質分別沉淀。如：,制備蛋白質,1、基本原理,2、鹽析突出的優(yōu)點,成本低，不需要特別昂貴的設備。 操作簡單、安全。 對許多生物活性物質具有穩(wěn)定作用。,鹽析法,3.影響鹽析的因素,蛋白濃度：高濃度的蛋白質，可以節(jié)約鹽的用量，但蛋白質濃度過高，會發(fā)生嚴重的共沉淀作用。在低濃度的蛋白質溶液中鹽析，用鹽量較多，共沉淀少。一般2.5%-3.0%的蛋白質濃度較適中。 離子強度：一般，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低。在分離時，一般從低離子強度到高離子強度順次進行。,影響鹽析的因素,pH 值：為提高鹽析效率，多將溶液pH

3、調制目的蛋白的等電點處。注意：蛋白質的等電點在水中或稀鹽溶液中與高濃度下測的結果不同。根據(jù)實際情況調整 溫度：在低離子強度或純水中，蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加。但在高濃度下，蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降。 在一般情況下，蛋白質對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4進行。,4、鹽的選擇,負離子帶電荷較多者，鹽析能力較強，如硫酸鈉的鹽析能力大于氯化鈉。正離子帶電荷較多者，鹽折能力較低，如硫酸鎂的鹽析能力小于硫酸銨。 鹽的選用還要考慮鹽的溶解度，如果溶解度低，在溶液中不能達到高濃度，其應用就會受到限制。,常用的中性鹽是硫酸銨,優(yōu)點

4、： 溶解度大：（NH4）2SO4在0時仍有70.6的溶解度，遠遠高于其它鹽類。 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。 有穩(wěn)定酶與蛋白質結構的作用。 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。 缺點：需脫鹽,鹽析法,硫酸銨溶液飽和度計算,固體法 g= g表示在一升溶液中需加入固體硫酸銨的克數(shù)；S2：表示要達到的百分飽和度，S1表示原溶液中的百分飽和度。 硫酸銨溶液飽和度計算表（表2-2）p25 飽和溶液法,533(S1-S2),100-0.3S2,（20）,鹽析曲線制作p26,若生物材料來源容易，主要考慮提高純化倍數(shù)時，選擇48%-65%鹽飽和分級范圍，則純化倍

5、數(shù)可達3.0，而收得率僅為75%。 若生物材料來源困難，主要考慮提高收得率時，則選擇45%-75%鹽飽和分級范圍,則收得率可達80%，而純化倍數(shù)將小于2.4。,透析法：將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內，而鹽和小分子物質不斷擴散透析到袋外，直到袋內外兩邊的濃度達到平衡為止。,4、脫鹽,鹽析法,透析法,透析,透析袋的選擇與處理： 透析液的選擇：低離子強度的中性緩沖液。對含輔基的酶透析時，在透析液中宜加入適量的輔基或保護輔基的試劑。 透析時間：攪拌情況下，樣品液與透析體積之比宜1：10，3小時可達平衡。 靜止狀態(tài)

6、進行時，樣品液與透析體積之比宜1：20，過夜。 脫鹽是否徹底，要經常檢查。,二、有機溶劑沉淀法,基本原理：一方面，與鹽溶液一樣有脫水作用。 另一方面，能降低溶液的介電常數(shù)。 溶劑的極性與其介電常數(shù)密切相關，極性越大，介電常數(shù)越大，如20時水的介電常數(shù)為80，而乙醇和丙酮的介電常數(shù)分別是24和21.4，因而向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，增加了蛋白質分子間的相互作用，導致蛋白質溶解度降低而沉淀。,制備蛋白質,有機溶劑沉淀法,優(yōu)點：分辨能力比鹽析法高 沉淀不用脫鹽，過濾比較容易。 缺點：對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失

7、活。,有機溶劑沉淀法,有機溶劑的選擇： 首先是要能與水互溶。 沉淀蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀劑是乙醇。,1）利用表面活性劑(三氯乙酸)或有機溶劑引起變性； 2）利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分； 3）酸堿變性。 例如：從酵母菌細胞中純化醇脫氫酶 采用了改變溫度的選擇性沉淀法,三、選擇性沉淀法,制備蛋白質,4、聚乙二醇沉淀法,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG) 實驗表明沉淀作用較滿意的聚合物是分子質量在4006000Da之間的聚乙二醇。 優(yōu)點： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高。

8、沉淀后有機聚合物容易去除。,制備蛋白質,第三節(jié) 制備核酸,制備核酸時，需要先將DNA蛋白質（DNP）或RNA蛋白質（RNP）復合物進行解聚，設法除去蛋白質和糖等雜質，然后再通過沉淀法得到核酸。,沉淀法,制備核酸,去污劑 加入適量的陰離子去污劑（十二烷基硫酸鈉SDS），復合物解聚，釋放核酸。 加入適量醋酸鉀溶液，使SDS-蛋白質復合物沉淀。 有機溶劑 利用酚、氯仿的混合液作蛋白質的變性劑。 蛋白水解酶,1、DNP/RNP復合物的解聚、除去蛋白質,多糖 采用選擇性沉淀劑如異丙醇、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB） DNA與RNA的分離 鹽析法：DNA在12mol/L NaCl溶液中，溶解度較大； 0

9、.14 mol/L NaCl溶液中，溶解度極?。?RNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解。 酶水解法：在提取DNA時，可采用RNase水解RNA雜質。反之，在提取RNA時，可采用DNase水解雜質DNA。,制備核酸,2、多糖等雜質的消除,有機溶劑 乙醇鹽溶液 DNA：0.1 mol/L NaCl溶液和2倍體積冷無水乙醇 RNA：0.1 mol/L NaCl溶液和2.5倍體積冷無水乙醇 異丙醇 DNA或大分子rRNA：0.3mol/L NaAC和0.541倍體積的異丙醇,制備核酸,3、核酸的沉淀,核酸的沉淀,聚乙二醇 加聚乙二醇0.5mol/L NaCl溶液到核酸溶液中，可使2kb的DNA片段沉淀出來。 聚乙二醇的濃度與DNA片段的分子質量成反比。,1.65kb的DNA，用5PEG； 1.2kb的DNA，用6PEG； 0.6kb的DNA，用7PEG。