1、1，3-丙二醇新型基因工程菌的構(gòu)建,生物技術(shù)1101班 李娟,1，3丙二醇是目前國(guó)際上公認(rèn)的六大石化新產(chǎn)品之一，其主要功能是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。1，3一丙二醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物轉(zhuǎn)化法，但從自然界中篩選的微生物厭氧發(fā)酵甘油生產(chǎn)l，3一丙二醇還存在產(chǎn)物生產(chǎn)周期長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，目前僅有化學(xué)合成法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)菌株備被認(rèn)為是今后的發(fā)展方向。,1，3丙二醇簡(jiǎn)介,1，3-丙二醇性質(zhì),物理性質(zhì)：1，3丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一種無(wú)色無(wú)味透明的液體，易溶于水、乙醇、醚類和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相對(duì)密度為10

2、53 gcm3，熔點(diǎn)27，沸點(diǎn)211，自燃溫度為400。 化學(xué)性質(zhì)：高溫下與羧酸縮合成酯，與異氰酸鹽及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重要的性質(zhì)就是與二酸反應(yīng)生成聚酯和聚氨酯。,1，3-丙二醇用途,可直接用于防凍劑，是多種增塑劑、洗滌劑、防腐劑和乳化劑的合成原料；也廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和制藥等行業(yè)14j。 1，3丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料。PTT纖維克服了PET纖從而引起纖維材料界的矚目，可用于生產(chǎn)地毯、短絲及長(zhǎng)絲產(chǎn)品，產(chǎn)薄膜、非織造布和單絲，用作熱塑性工程塑料,1，3-丙二醇基因工程菌構(gòu)建的預(yù)期目標(biāo),本研究首先利用PCR方法從大腸桿菌中克隆116 kb的1，3丙二醇

3、氧化還原酶同工酶的編碼基因yqhD280kb來(lái)源于克雷伯氏桿菌甘油脫水酶的編碼基因dhaB構(gòu)建了重組菌 i JM109(pEtacdhaBtac-yqhD) 構(gòu)建重組載體pUCtacdhaT，并在大腸桿菌JMl09共表達(dá)重組質(zhì)粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT，研究為提高1，3丙二醇產(chǎn)量提供了新途徑。,1，3-丙二醇基因工程菌構(gòu)建的路線,(1)串聯(lián)表達(dá)來(lái)源于克雷伯氏菌(Klebsiella)編碼油脫水酶的基因dhaB以及來(lái)源于大腸桿菌(編碼1，3一丙二醇氧化還原酶同工酶的基因yqhD，構(gòu)建 重組菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD);考察其轉(zhuǎn)化

4、甘油的能力。 (2)利用PCR擴(kuò)增來(lái)源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化還原酶dhaT，構(gòu)建重組載體pUCtac一砌口T，并在大腸桿菌JMl09共表達(dá)重組質(zhì)粒pEtacdhaBtac-yqhD和pUCtac-dhaT。 (3)在搖瓶水平，對(duì)已構(gòu)建的產(chǎn)1，3丙二醇重組菌EcoliJMl09 發(fā)酵條件的初步研,1，3丙二醇生物合成途徑 l，3一丙二醇是一種典型的甘油發(fā)酵產(chǎn)物,并未發(fā)現(xiàn)其可由其他有機(jī)底物厭氧轉(zhuǎn)化而來(lái)。甘油作為唯一碳源和能源，它可以沿著氧化和還原途徑發(fā)生歧化反應(yīng)，氧化途徑中產(chǎn)物與糖類發(fā)酵產(chǎn)物一致，并產(chǎn)牛供細(xì)胞牛長(zhǎng)所必需的ATP，在某些產(chǎn)物形成的同時(shí)釋放還原力NADH；還原途徑則消耗氧化途

5、徑中多余的還原力，生成1，3一丙二醇 。,一、大腸桿菌JMl09的構(gòu)建及其表達(dá),1，菌株、質(zhì)粒及基因片斷： 大腸桿菌JMl09，質(zhì)粒pUCl9，pEtac由本實(shí)保藏；yqhD和dhaB基因分別從大腸 桿菌和克雷伯氏菌中克隆得到。 2，主要試劑： 質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒化試劑盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、,材料,（一）、質(zhì)粒DNA的提取 (1)接重組大腸桿菌一環(huán)于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 (2)取15mL菌液于Eppendorf管中，6000rmin離心5 min。 (3)棄去上清，加入溶液I 100“L重懸菌體。 (4)加入溶液II 150“L，輕柔混勻。 (

6、5)加入溶液III 150此，倒轉(zhuǎn)混勻，8000 rmin，離心10min。 (6)將420L結(jié)合緩沖液加入離心吸附柱中，然后將步驟5中的上清加入離心吸附柱中混勻，,6000 rmin離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液。 （7)加入750此漂洗液于離心吸附柱中，靜置1 min后，6000rmin離心30s。倒掉廢液收集管中的廢液。重復(fù)一次。倒掉廢液后。再次于6000 rmin離心2min，盡量除去漂洗緩沖液。 (8)小心取出離心吸附柱，將其套入一個(gè)干凈的15 mLEppendorf離心管中，加入適量洗脫緩沖液，常規(guī)50此，室溫放置25min后，6000 rmin離心2min。 (9)取5“L酶

7、切后電泳鑒定。,(二)、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 (1)接種EcoliJM109于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。 (2)取05mL培養(yǎng)液于50mLLB培養(yǎng)基中37振蕩培養(yǎng)至OD值O304。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，輕輕搖晃，使菌液迅速冷卻約10分鐘。 (4)分裝菌液到Eppendorf管(15mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中靜置15min。 (5)8000rmin離心5min，然后靜置2min，冰水中迅速棄上清，加入預(yù)冷的CaCl2400uL，,輕輕吹吸懸浮菌體，冰水中放置30min。 （6)重復(fù)步驟(5)兩次。 (7)8000rmin離心5min，然后靜置2min，冰水中迅速棄上

8、清，加入預(yù)冷的CaCl280uL。 也可加40 uL50的甘油保存代用。,（三）、轉(zhuǎn)化大腸桿菌,(1)取出感受態(tài)細(xì)胞，在冰水中融化。 (2)加入待轉(zhuǎn)化的DNA，用吸頭輕柔混合，不可用漩渦混合儀。 (3)冰水浴40min。 (4)42熱激90s。 (5)加入1mL LB培養(yǎng)基，37震蕩培養(yǎng)12 h。 (6)涂布含有相應(yīng)抗生素的LB平板。,（四）、大腸桿菌JMl09基因工程菌的構(gòu)建,首先將來(lái)源于大腸桿菌的基因片段yqhD連入載體pEtac上，得到重組質(zhì)粒pEtac-yqhD，經(jīng)酶切，得到片段tac-yqhD連入載體pUCl9，得到重組質(zhì)粒pUCtac-yqhD，將來(lái)源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB

9、連入載體pUCtac-yqhD，以得到的重組質(zhì)粒 pUCdhaBtac-yqhD。將重組表達(dá)載體酶切連接到pEtac上，得到雙啟動(dòng)子重組表達(dá)大腸桿菌JM 109(pEtacdhaB-tac-yqhD)。,（五）、酶活力測(cè)定,1、甘油脫水酶活力的測(cè)定 2、1，3一丙二醇氧化還原酶同工酶的酶 活力測(cè)定,（六）、1，3丙二醇含量的測(cè)定,發(fā)酵液中l(wèi)，3：丙二醇及甘油的含量采用氣相色譜測(cè)定 ，國(guó)產(chǎn)高分子微GDX401(110目)為固定相。柱溫：250，進(jìn)樣溫度：240，檢測(cè)溫度t 240，氮?dú)庾鳛檩d氣，使用氫火焰檢測(cè)器，進(jìn)樣5“L，1，3丙二醇的保留時(shí)間為27 min左右，用外標(biāo)法計(jì)算發(fā)酵液中1，3一丙

10、二醇的含量。,二、重組質(zhì)粒pUCtac-dhaT的構(gòu)建及其與pEtacdhaBtac-yqhD在大腸桿菌JMl09中共表達(dá),實(shí)驗(yàn)材料 菌種：E coliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD)為本研究“第二章構(gòu)建保存的；質(zhì)粒pUCl9， pEtac由本實(shí)驗(yàn)室保藏：dhaT基因從克雷伯氏菌中 試劑和工具酶：質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒 工具酶、抗生素 公司、華美生物 ；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、 3PCR引物 根據(jù)克雷伯氏菌公布的序列， 。,引物： 3PCR引物 根據(jù)克雷伯氏菌公布的序列，設(shè)計(jì)片段pEtacdhaTPCR所需引物：Ps：5-ACCGCAATTGATG

11、AGCTATCGTATGTTTG一3： P6：5-ACC CAGAATGCCTGGCG3。引物兩端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位點(diǎn)。,實(shí)驗(yàn)條件和方法 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)體系：在0 5 mL Eppendorf管中按順序加入以下試劑：10buffer 5 m，2 5mmolLdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1 IIl，模板DNA2 pl，腳酶1 itl，ddH20 32m，總體積50 pl。 13一丙二醇氧化還原酶dhaT的反應(yīng)條件： 94預(yù)變性5min：變性90 s，54退火l 5min，72延伸l 5rain，循環(huán)35次；72保溫10min。,（

12、1）大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建 將來(lái)源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT連入載體pEtae，以得到的重組質(zhì)粒pEtac-dhaT。經(jīng)酶切得到片段tac-dhaT連接到pUCl9上，以得到的重組質(zhì)粒pUC-tac-dhaT。將基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共轉(zhuǎn)化大腸桿菌KcoliJMl09。 （2） 1，3丙二醇氧化還原酶的酶活力測(cè)定 測(cè)定1，3-丙二醇氧化還原酶的酶活。酶活測(cè)定根據(jù)250C條件下NAD+還原成NADH的速率來(lái)定量。酶活單位定義為1國(guó)際單位(1u)等于每分種還原1lJmol底物NAD+或生成1“raol產(chǎn)物NADH的酶量。,四、重組菌

13、coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD， pUCtacdhaT)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化,菌株：重組菌Ecoli JMl09(pEtacdhaB-tac-yqhD，pUCtacdhaT)為本論文三中構(gòu)建。 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 LB培養(yǎng)基(L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉lO，瓊脂15(固體培養(yǎng)基)，固 體和液體培養(yǎng)基在需要時(shí)加入氨芐青霉素至100tgmL、卡那霉素50pgmL。 種子培養(yǎng)基：采用LB培養(yǎng)基。 發(fā)酵培養(yǎng)基(gL)：甘油、酵母膏、KH2P04、MgS047H20和維生素B12 青霉素至100IxgmL、卡那霉素50rtgmL。,材料,搖瓶發(fā)酵：從新鮮的LB培養(yǎng)基斜面上挑取一環(huán)

14、菌株接入50 mL搖瓶(裝液量為10mL)中，于旋轉(zhuǎn)式搖床中37、150 rmin培養(yǎng)18 h得到種子液。接種于250 mL搖瓶中，在150 rmin旋轉(zhuǎn)式搖床中，先于37。C培養(yǎng)至OD600為O7，再于37誘導(dǎo)發(fā)酵一定時(shí)間。,方法,1、采用單因素實(shí)驗(yàn)分別考察了不同濃度的甘油、酵母膏、KH2P04、VBl2及M孑+ 等因素對(duì)重組菌E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)發(fā)酵結(jié)果的影響，確 定了其發(fā)酵培養(yǎng)基的基本組成為：甘油20gL、VBl2001gL、KH2P0475edL、M92+067 gL和酵母膏5L，在此培養(yǎng)基中l(wèi)，3一丙二醇的產(chǎn)量達(dá)到225L

15、。,小結(jié),2、通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)分析法進(jìn)一步優(yōu)化了重組菌E coliJMl09(pEtac-dhaBtac-yqhD， pUCtac-dhaT)的發(fā)酵培養(yǎng)基，其適宜組成為：甘油20 gL、VBl2 O01 gL、KH2P045 gL、 M92+067 edL和酵母膏5L。最適發(fā)酵條件為：裝液量10、接種量10、轉(zhuǎn)速150 rmin、接種后4d,時(shí)左右加入IPTG、IPTG終濃度為lmmolL。應(yīng)用此培養(yǎng)基l，3丙二醇 的產(chǎn)量為24329L，,3、在通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，重組菌EcoliJMl09(pEtaedhaBtac-yqhD)與E coliJMl09(pEtacdhaBtac-yqhD，pUCtacdhaT)經(jīng)誘導(dǎo)前后