摘要 本試驗(yàn)用酶聯(lián)免疫吸附法( e l i s a ) 研究了鹽酸克倫特羅( c l b ) 在動(dòng)物各組織的 殘留狀況及對(duì)動(dòng)物的毒性。試驗(yàn)采用小白鼠和豬兩種動(dòng)物。采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，小白 鼠試驗(yàn)分為4 個(gè)試驗(yàn)組，豬分為3 個(gè)試驗(yàn)組，分別灌注不同劑量的c l b 后，觀察動(dòng)物 服用c l b 后的異常表現(xiàn)，并在小自鼠試驗(yàn)3 0 d ，豬試驗(yàn)3 5 d 后，進(jìn)行解剖病理分析和殘 留檢測(cè)。 試驗(yàn)結(jié)果顯示：用酶聯(lián)免疫吸附法( e l i s a ) 對(duì)c l b 進(jìn)行檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單，容易掌 握，耗時(shí)少( 5 6 h ) ，可滿足縣級(jí)以下單位對(duì)c l b 的檢測(cè)。c l b 在動(dòng)物各組織的殘留 規(guī)律為：小白鼠的肌肉組織和肝臟、肺臟、腎臟等內(nèi)臟器官的c l b 殘留量與用藥劑量呈 極顯著正相關(guān)( p 腎臟 肌肉 脂肪 血漿：在停藥期為0 d 時(shí)肺臟 肝臟，但隨停藥 期的增加肺臟的殘留消除較肝臟快，在第2 4 d ，肺臟己測(cè)不出殘留時(shí)，肝臟仍有5 3 n g 的殘留。 但是，目前我國(guó)各地方的衛(wèi)生檢驗(yàn)部門( 陳瓊等，2 0 0 0 ；揚(yáng)興武等，2 0 0 2 ：賴碧清 等，2 0 0 2 ：唐國(guó)盛等，2 0 0 2 金米聰?shù)? 0 0 3 ) 在檢測(cè)c l b 時(shí)主要將尿液作為的檢測(cè)樣 品。雖然c i b 在體內(nèi)代謝后大量以原形隨尿液排出，但一旦停止飼喂該藥，尿液中的藥 6 含量將急劇減少，因此采用尿液作為檢樣具有一定的局限性。 表2 各組織器官的殘留情況 一一 劑量與給停藥期 組織濃度( n g 幢) 藥時(shí)間( d a y ) 肺臟肝臟腎臟 肌肉脂肪血漿 一一 5 m 非g a 0 4 7 6 。04 2 2 12 1 9 1 8 8 33 5 26 0 ，4 3 0 d a y l m g k 9 6 7 d a y 2 3 4 01 8 0 9 5 0 47 8 8 2 6 33 9 o 1 5 42 2 6 9 11 1 4 4 37 ，6 2 27 2 0 66 7 o 55 9 n d5 3 n d4 3 n d3 1 8 7 3 3 2 2 8 6 4 3 2 o 1 2 0 8 0 5 n d n d n d n d 2 6 3 5 6 1 o 0 5 n d n d n d n d n d n d n d n d 1 2 ，6 5 5 2 9 1 , 0 0 7 0 5 n d n d n d n d n d n d 1 5 0 5 3 0 。7 n d n d n d n d n d n d n d n d n d 0 3 7 1 8 6 81 2 2 47 7 4 8 91 2 93 3 1 42 5o 4 2 0 5 0 4 n d 1 8 1 1 2 n d 1 3 0 1 3 0 9 注：n d 表示不可測(cè)得( n o td e t e c t a b l e ) a ：楊志凌( 2 0 0 1 ) ；b ：s m i t h ( 2 0 0 0 ) 。 1 4 2 鹽酸克倫特羅檢測(cè)樣品的前處理 鹽酸克倫特羅檢測(cè)樣品的前處理是指樣品的提取和凈化。主要有溶劑萃取法、固相 萃取法、基質(zhì)固相分散、透析法、超臨界萃取法等。 溶劑萃取法液一液萃取法( s e l l p ) 是最早使用的一種方法，利用提取物的極性和 酸堿性，通過調(diào)節(jié)樣品p h 值和溶液極性的方法來改變提取物在不同體系的溶解度和分 7 ， 2 ， 4 6 8 如 h 四 m 凹 剪 配系數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的提取和純化。在某些情況下，為獲得良好的提取效果，需要用多 種有機(jī)溶劑。 固相萃取( s p e l ( g a i l l a r d y ，1 9 9 7 ；a e l e h n e r ，1 9 9 8 ；b r u i n sc h p ，1 9 9 9 ；g i a n c a r l o b i a n c o t t o ，1 9 9 9 ：b r u i n s ，1 9 9 9 ) 根據(jù)液相分離、解析原理達(dá)到分離、凈化的目的，是 目前常用的樣品凈化手段。固相萃取操作簡(jiǎn)易，有機(jī)溶劑用量少，應(yīng)用廣泛。但固相萃 取柱價(jià)格較高。 膜分離雙相滲析技術(shù)( g o z a l e a ，1 9 9 7 ；f e n t ec a ，1 9 9 9 ) 是一種半透膜分離技術(shù)， 適用于直接提取分子量相對(duì)較小的化合物。與溶劑萃取和固相萃取相比，具有操作簡(jiǎn)便、 省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。 基質(zhì)固相分散萃取( m s p d e ) b i 先將一定量的基質(zhì)( 如動(dòng)物肝臟) 均質(zhì)，并與吸附劑( 如 c 8 鍵合硅膠顆粒) 混勻制成半固態(tài)后裝柱、淋洗，m s p d e 的特點(diǎn)在于它將樣品的均質(zhì) 過程與待測(cè)物質(zhì)的萃取和凈化過程同步完成，減少了溶劑用量，節(jié)約了時(shí)間，提高了工 作效率，使現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)成為可能。此外，m s p d e 減少了樣品凈化程序，更適于自動(dòng)化分 析。 超i 臨界流體萃取( s f e ) 是以超臨界流體( s f ) 代替各種溶劑來萃取樣品中的待測(cè)組 分的萃取方法( 0 k e e f f e ，1 9 9 8 ) 。超臨界流體既具有液體的強(qiáng)溶解性能，又具有氣體的 低粘度、高擴(kuò)散性能、高傳質(zhì)速度，使得分析速度提高。 比較c l b 檢測(cè)樣品的各種前處理的這幾種方法，溶劑萃取雖然溶劑使用量大，不 如其它方法凈化效果好但其費(fèi)用低，更易被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用。固相萃取處理的樣品可 以使得檢測(cè)限大為降低，今后隨著囤相萃取柱價(jià)格的降低，其應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。 1 4 3 鹽酸克倫特羅的檢測(cè)方法 為了保證畜牧產(chǎn)品的安全食用性，f d a 和w h o 規(guī)定了c l b 在動(dòng)物體內(nèi)的最高殘 留限量為：肉0 2 u g k g ，肝臟0 6 u g k g ，腎臟0 6 u g k g ，脂肪0 2 u g k g ，奶0 0 5 u g k g 。我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定了c l b 的殘留標(biāo)準(zhǔn)，馬、牛肌肉0 1 u g k g ，肝臟、腎臟0 5 u g k ，牛奶o 0 5 u g k g ( 農(nóng)牧發(fā) 1 9 9 7 1 7 號(hào)) 。 目前能夠滿足以上檢測(cè)限的常用方法主要有：免疫分析法，高效液相色譜法及各種 聯(lián)用技術(shù)分析法等。其中免疫分析法主要為酶聯(lián)免疫分析法和放射免疫分析法。各種聯(lián) 用技術(shù)分析法主要是氣相色譜質(zhì)譜法。 1 4 3 1 氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法( g c m s ) 氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法( g i a u l ta n d f o u r t i l l a n ，1 9 9 0 ；p o l e t t i n ie t a l ，1 9 9 1 ；l e v s s e i l se t 。8 a 1 1 9 9 1 ：m o n t r a d ee ta 1 , 1 以準(zhǔn)確地對(duì)克倫持羅進(jìn)行定性和定量分析，對(duì)免疫法初步檢測(cè)得 到的陽(yáng)性樣品9 9 3 ；g o n z a l e ze ta l ，1 9 9 5 ；b a q o e n s ，1 9 9 6 ；w h a l e s ，m u r b y ，1 9 9 9 ；s p i s s o e t a l 。2 0 0 0 ) 靈敏度高，可可以進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)，是檢測(cè)鹽酸克倫特羅殘留的最常用的方法 之一，也是目前國(guó)際上公認(rèn)的c l b a 0 定的確認(rèn)方法。而我國(guó)已于2 0 0 1 年頒布了動(dòng)物組織 中c l b 鋇t j 定的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)n y 4 3 8 2 0 0 1 ，也推薦使用g c m s 。但是由于g c m s 要求樣品有 較低的沸點(diǎn)且對(duì)熱穩(wěn)定，而c l b 極性大沸點(diǎn)高，不適宜直接用g c m s 法，因此需要將其 進(jìn)行衍生化，使其適應(yīng)g c m s 分析。因此，用此法分析檢測(cè)前要對(duì)分子上的羥基、氨基 等極性基團(tuán)衍生化，操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，難于滿足生產(chǎn)檢測(cè)的需要。 1 4 。3 2 高效液相色譜法( h p l c ) 在檢測(cè)c l b 時(shí)，h p l c 分析不需要將c l b 衍生化，且準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好、假陽(yáng)性率 低，適用于定量檢測(cè)。h p l c 法可采用不同的檢測(cè)器，有電化學(xué)檢測(cè)器 ( h a u c k ，1 9 8 9 ；c h r i s t i n eb c r g g r e n e t a l ，2 0 0 0 ；c r e s c e n z lc e ta l ，2 0 0 1 ) 、紫外檢測(cè)器 ( h o o i j e r i n k ，1 9 9 1 ；c a r d u c d i ，1 9 9 6 ；l a w r e n c e ，1 9 9 7 ；j a m e sf ，1 9 9 7 ) 、光電二極管陣列檢測(cè) ：器( t s a i ，1 9 9 4 ) 和質(zhì)譜檢測(cè)器( d a n i e l l ，1 9 9 6 ；e l b e r t a h e ta l ，1 9 9 8 ；l e h n e r a f2 0 0 1 ) 。 我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)n y 4 3 8 2 0 0 1 h p l c 推薦為飼料q 6 c l b 檢測(cè)方法，最低檢測(cè) 限為0 o l m g k g 。目前h p l c 的檢測(cè)限一般只能達(dá)到1 1 0 0 u g 瓜g ，儀器價(jià)格昂貴、操作比 較繁瑣，樣品在測(cè)定前需進(jìn)行前處理工作，而且處理成本高，耗時(shí)長(zhǎng)。 1 。4 3 3 免疫分析法 1 4 3 3 1 放射免疫分析法( r 放射免疫分析法檢測(cè)鹽酸克倫特羅殘留具有很好的特異性和高靈敏度。早在1 9 7 6 年，k o p i t a r 和z i m m e r 就首次報(bào)道了用r r a 法分析c l b 。但是由于所用儀器f 液體閃爍儀或 y 一放射儀) 價(jià)格較昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求比較苛刻，放射性同位素對(duì)工作人員有一定傷 害，并且放射性廢棄物不易處理容易給環(huán)境造成污染。因此限制了它的廣泛應(yīng)用。 1 1 4 3 3 ，2 熒光免疫分析法 熒光免疫分析法同放射免疫分析法相比，克r t 放射免廢分析法中的核輻射缺點(diǎn)； 與色譜法相比，具有對(duì)樣品處理比較簡(jiǎn)單且一次能檢測(cè)多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。b a c i g a l u d om a 等( 1 9 9 5 ) 利用單抗技術(shù)與熒光免疫分析技術(shù)檢測(cè)了鹽酸克倫特羅在牛尿中的殘留，檢測(cè) 限l o p g g ，檢測(cè)線性范圍1 0 1 0 5 p g g o 但它對(duì)溫度的強(qiáng)烈依賴性和熒光強(qiáng)度取決于激 發(fā)波長(zhǎng)，因此應(yīng)用較少。 1 4 3 3 3 酶免疫分析法( e 弧) 9 酶免疫分析法( y a m a m o l ol , 1 w a t a ，1 9 8 2 ：p l o u m e i a l ，1 9 9 1 ；p o u e l a l ，1 9 9 4 ；p o l e t t i e t a l ，1 9 9 5 ：h a s s n o o te ta l ，1 9 9 6 ；h a h n a e ta l ，1 9 9 6 ；h a a s n o o t e ta l ，1 9 9 8 ) 在上世紀(jì)7 0 年代由 e n g v a l l 等創(chuàng)建的。它較g c - 一m s 和h p l c 有其獨(dú)特的優(yōu)越性：樣品前處理不復(fù)雜，檢 測(cè)數(shù)據(jù)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快：設(shè)備費(fèi)用不高，易于推廣，靈敏度高，檢測(cè)限低 于o 5 u e c k g ：英國(guó)r a n d o x l a b o r a t o r i e sl t d 公司、德國(guó)f b i o p h a r m 公司等已開發(fā)出商品 化的酶標(biāo)儀和試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。目前，我國(guó)對(duì)e t a 用于瘦肉精檢測(cè)的研究報(bào)道較少其 中南京農(nóng)大的陳繼明等做了較多的研究。他們用自制的獻(xiàn)酸克倫特羅抗血清建立了間接 抑制酶聯(lián)免疫吸附法( e l i s a ) 方法。對(duì)飼料、尿樣和肝臟等樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍 為1 5 6u 咖i 1 9 0 n g m l ，特異性較強(qiáng)，塞曼特羅和沙丁胺醇分別有1 0 和1 2 5 的交 叉反應(yīng)，而腎上腺素和去甲腎上腺素?zé)o交叉反應(yīng)。目前我國(guó)赫酸克倫特羅的檢測(cè)也有了 快速、簡(jiǎn)便的商用e l i s a 試劑盒，如上海賽群生物科技有限公司研制的鹽酸克倫特羅 酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，經(jīng)上海市高新技術(shù)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目認(rèn)定辦公室認(rèn)定，上海市獸藥飼 料檢察所應(yīng)用，其各項(xiàng)性能均達(dá)到了進(jìn)口試劑盒的指標(biāo)，認(rèn)定可許代進(jìn)口試劑盒。試劑 盒的使用更有利于該項(xiàng)檢測(cè)的研究和推廣。 2 有待研究的問題及試驗(yàn)?zāi)康囊饬x 2 1 有待研究的問題 綜上所述，在鹽酸克倫特羅的殘留分析方面，國(guó)外的研究動(dòng)物多采用牛、羊和雞麗 對(duì)豬的研究少見報(bào)道，我國(guó)的畜產(chǎn)品主要以豬為主因此有必要對(duì)豬進(jìn)行研究；在檢測(cè) 樣品的采集方面，國(guó)內(nèi)的檢測(cè)基本上都是用宰前屠畜的尿液作為檢樣，采用尿液作為檢 樣有定的局限性，而在宰后采集合適的組織進(jìn)行檢測(cè)更可靠。召：鹽酸克倫特羅的殘留 檢測(cè)方法方面：h p l c 、g c - m s 等操作煩瑣、檢測(cè)成本高，使得難于普及，采用較簡(jiǎn)便 利于操作的檢測(cè)方法，同時(shí)降低檢測(cè)成本有待研究： 2 2 本試驗(yàn)的目的意義 通過本研究，希望達(dá)到以下兒方面的目的： 2 2 1 了解豬各組織器官的殘留狀況： 2 2 2 探討機(jī)體各組織器官的病理變化； 2 2 3 以心臟、肝臟、j 擗! 臟、肺臟、腎臟、肌肉作為撿樣，尋找宰后檢測(cè)的最佳組織： 2 2 4 用所建立的方法在實(shí)際生產(chǎn)的運(yùn)用。 意義：對(duì)c l b 在動(dòng)物組織中的殘留分析為組織檢樣的選擇提供依據(jù)：機(jī)體各組織的 病理變化的研究，為感官檢驗(yàn)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)輔以e u s a 法，可及時(shí)在宰后檢驗(yàn)過 l o 程中檢出鹽酸克倫特羅豬肉，防止漏檢錯(cuò)判和中毒事件的發(fā)生，具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意 義。 3 材料與方法 3 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用兩種不同種屬的動(dòng)物小白鼠和豬分別進(jìn)行試驗(yàn)。同批同齡的4 0 9 左右的小 白鼠隨機(jī)分為4 個(gè)處理組，對(duì)照組，試驗(yàn)l 組、試驗(yàn)2 組和試驗(yàn)3 組采用每天兩次的 口服給藥方式，給藥劑量見表3 。1 4 k g 左右的斷奶仔豬隨機(jī)分為3 個(gè)處理組。對(duì)照組、 試驗(yàn)1 組和試驗(yàn)2 組。試驗(yàn)組同樣采用每天兩次的口服給藥的方式，給藥劑量分為七個(gè) 遞增的階段進(jìn)行見表4 。 表3 小自鼠試驗(yàn)給藥劑最 腿 表4 豬試驗(yàn)給藥劑量 m g 對(duì)照l ! f l試驗(yàn)1 紐 試驗(yàn)2 紐 第一階段 第二二階段 第三階段 第四階段 第五階段 第六階段 第七階段 l6 21 3 2 4 0 4 8 5 6 6 4 給藥總時(shí)問( d )3 5 3 53 5 注：每一階段為5 d 。 4 6 8 o 2 4 6 2 7 4 6 7 8 9 o 0 0 o o 0 o 3 2 試驗(yàn)動(dòng)物及給藥方式 3 2 1 小白鼠 選用華西醫(yī)科大學(xué)的健康試驗(yàn)小白鼠。預(yù)試5 d ，觀察小白鼠生活狀況和精神，確認(rèn) 其健康后，將與小白鼠的食道大小合適的軟管，取代2 - 5 m l 的注射器的針頭，并用此注 射器取適量( 按表1 ) 的已溶解于蒸餾水的鹽酸克倫特羅溶液，再將軟管插入小白鼠的 食道處，將鹽酸克倫特羅溶液灌入其食道中( 見版圖1 ) 。對(duì)照組僅灌入同體積的蒸餾水。 3 2 j 豬 試驗(yàn)動(dòng)物豬來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所的長(zhǎng)白太湖二元雜交健康仔豬。預(yù)示5 d 后給藥，給藥方式與小白鼠相同，只是所用的軟管和注射器與豬的食道合適( 見版圖2 ) 。 3 3 飼養(yǎng)管理 小白鼠試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，小白鼠單籠飼養(yǎng)，飼料為華西醫(yī)科大 學(xué)專用小白鼠全價(jià)料，自由采食和飲水，每天清換一次墊料。室內(nèi)溫度1 8 2 7 。c ，濕度 4 2 7 5 ，自然通風(fēng)。 豬試驗(yàn)在為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所實(shí)驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。豬單籠飼養(yǎng)，飼料為l 四) j l 農(nóng)業(yè)大 學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所配制的仔豬料。自由采食和飲水，每天清掃飼養(yǎng)籠，室內(nèi)溫度1 8 2 7 。c ， 濕度4 2 - 7 5 ，自然通風(fēng)。 3 4 樣品的采集與保存 3 4 1 小白鼠樣品的采集 待試驗(yàn)3 0 d 后，將小白鼠活體解剖，分別取肝臟、肺臟、腎臟、肌肉，用塑料袋密 封后放入一2 0 冰箱中待檢。 3 4 2 豬樣品的采集 試驗(yàn)3 5 d 后，將豬只屠宰放血，開膛，分別取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、 肌肉，用塑料袋密封后放入一2 0 冰箱中待檢。 3 5 樣品的前處理 3 5 1 試劑和儀器 試劑：5 0 m mh c l ：1 m n a o h 5 0 0 m m 磷酸二氫鉀緩沖液( p h 3 0 ) ；5 0 m mt r i s 緩沖液( p h 8 5 ) ；庚烷( h e p t a n e ) 。 儀器：5 0 m l 、1 0 m l 離心管，巴氏德吸管若干； h y - 5 調(diào)速多用振蕩器( 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠) ； l d 5 2 a 型離心機(jī)( ： 4 0 0 0 轉(zhuǎn)分) ( 北京醫(yī)用離心機(jī)廠) ： 1 2 b f c 2 0 0 0 型氮?dú)獯蹈蓛x( 北京八方世紀(jì)科技有限公司) 3 5 1 心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟的前處理( 見版圖3 ) 將5 克研碎的樣品與2 5 m 1 5 0 m m h c l 混合，振蕩1 5 h ，勻漿；稱6 9 勻漿物，加入 離心管，1 0 1 5 以4 0 0 0 轉(zhuǎn)分，離心1 5 m i n ；將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加 3 0 0 u l l m n a o h 混合1 5 m i n ，后加入4 m 1 5 0 0 m m 磷酸二氫鉀緩沖液( p h 3 o ) ，簡(jiǎn)單混合 后放置于4 c 的冰箱過夜；次日取出又于1 睢1 5 以4 0 0 0 轉(zhuǎn)分，離心1 5 r a i n ，轉(zhuǎn)移全部 上清液于l o m l 試管中，在6 0 * ( 2 下氮?dú)獯蹈伞⒏稍锏臉悠饭苊芊夂?，放入? 0 冰箱 中待測(cè)。 3 5 2 肌肉的前處理 因?yàn)榧∪庵兴据^心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等組織多，故樣品前處理中 增加提脂步驟。 將5 克研碎的樣品與2 5 m 1 5 0 m m t r i s 緩沖液( p h 8 5 ) 混合，振蕩0 5 h ，勻漿；后加 入1 5 m l 庚烷( n h e p t a n e ) 振蕩5 m i n 去脂；1 0 1 5 以4 0 0 0 轉(zhuǎn)分，離心5 m i n ，用巴氏 德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層i 再用1 5 m l 庚烷( n h e p t a n e ) 重復(fù)以上 操作；然后稱6 9 勻漿物，加入離心管中；以后的操作按3 5 1 進(jìn)行。 3 6 樣品的殘留檢測(cè) 3 6 1 試劑和儀器 試劑：6 個(gè)c l b 的標(biāo)準(zhǔn)液( 濃度分別為0 ，0 1 ，0 3 ，0 9 ，2 7 ，8 1 n g m 1 ) ，c l b 過氧化物酶標(biāo)記物，酶反應(yīng)底物，顯色劑，反應(yīng)終止液，p b s ，p b s t 洗液( 由上海賽 群生物有限公司提供) 。 儀器：m u l t i s k a nm k 3 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀( 上海雷勃分析儀器有限公司) ；2 0 u l ，5 0 u l ， 1 0 0 u l ，2 0 0 u l 微量加樣器。 3 6 2 測(cè)定 首先將待測(cè)定的樣品對(duì)應(yīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的9 6 個(gè)微孔編號(hào)( 見表5 ) ，以保證 樣品于后期酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀所出數(shù)據(jù)一一對(duì)應(yīng)。 寸一 。卿囂靶制崆n iii。1【馥gii。n寸博崾如爨廿1器鬲蜓q豁避噠一n0囂崾iii=怔螻議曾p。，冷村狀如驟武懨哥晶器麗一j8_【最嶂如煦 h一墨禳圃吲冥s世毯噠輿障一區(qū)世漲蜊憫蛞疑g導(dǎo)1器皸豆晾導(dǎo)罱懨a(罨。旺母挺島導(dǎo)1壬永鑿稍氓增肇墨靶靶q螺*簽塒哪匿球菸婆基疑蠱七b鬲丑草u一獸n怔竣p。，nn箍世1圭挺麗器蹭蜷髓一j8_【曩障(僻氓v廿器窨皿雄兩罐婪 s蟲剮文錳燃姑蜷蠱一n0n o 0 5 ) 。但從表中可 以看到，對(duì)照組的平均增重為8 k g ，試驗(yàn)1 組的平均增重為1 0 1 k g ，比對(duì)照組增加2 6 2 5 ； 試驗(yàn)2 組的平均增重為1 0 6 2 k g ，比對(duì)照組增加3 2 7 5 。顯示出試驗(yàn)組體重增加的幅度 大于對(duì)照組。而從采食量來看，對(duì)照組總采食量為2 6 7 1 4 k g ，試驗(yàn)1 組總采食量為 2 5 1 0 4 k g ，比對(duì)照組下降6 0 2 ；試驗(yàn)2 組總采食量為2 4 8 5 1 k g ；比對(duì)照組下降6 9 7 。 4 2 3 剖檢變化 4 2 3 1 小白鼠剖檢變化 在活體解剖后( 見版圖1 3 1 7 ) ，可以看到對(duì)照組脂肪明顯多于試驗(yàn)組，而試驗(yàn)組的 劑量越高，皮下脂肪層越薄。對(duì)照組皮下血管較淡，腎臟、心臟、腹腔周圍脂肪明顯， 腸系膜網(wǎng)膜脂肪明顯，腿部肌肉上有一層白膜；而試驗(yàn)組皮下血管明顯，腎臟、心臟、 腹腔周圍無臘肪，腸系膜網(wǎng)膜薄，腿部無脂肪。 4 2 3 2 豬剖檢變化 豬在屠宰后，測(cè)得各試驗(yàn)組的組織器官的重量( 見表1 0 ) ( 見版圖1 8 ) 。從表1 0 中可以看到試驗(yàn)組的各器官均大于對(duì)照組，呈現(xiàn)一定的規(guī)律性。特別是試驗(yàn)2 組脾臟較 對(duì)照組重6 3 5 ，心臟重2 3 3 ，其次為腎臟重2 0 5 ，肺臟重1 6 o ，肝臟重8 7 。 從剖檢分析來看試驗(yàn)組肝臟體積大于對(duì)照組，輕微腫大；試驗(yàn)組的肺臟有膨脹現(xiàn)象，體 積較大，明顯產(chǎn)生間質(zhì)水腫，出血和炎癥；對(duì)照組的脾臟質(zhì)地細(xì)膩，試驗(yàn)組與對(duì)照組比 2 1 較脾臟邊緣外翻且粗糙。同時(shí)解剖腹股溝深淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組正常，而試驗(yàn)1 組充血， 試驗(yàn)2 組出血：解剖腹股溝淺淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、試驗(yàn)1 組都正常，試驗(yàn)2 組出血。 表1 0 豬各組織器官的重量g 5 分析與討論 5 1e l i s a 方法檢測(cè)克倫特羅的優(yōu)點(diǎn) 本試驗(yàn)采用的鹽酸克倫特羅殘留酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海塞群生物科技有限 公司，并由上海市科委組織專家鑒定，上海市獸藥飼料監(jiān)察所實(shí)踐驗(yàn)證，其靈敏度高， 平均檢測(cè)下限為o 1 n g ?；厥章蕿椋? 0 1 5 ，特異性強(qiáng)，與鹽酸克倫特羅同類藥物 無交叉反應(yīng)，測(cè)試數(shù)據(jù)可靠。 本試驗(yàn)采用e l i s a 方法對(duì)c l b 在豬各組織的殘留情況作了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)此法相 對(duì)g c m s 等方法有三大優(yōu)點(diǎn)：一是檢測(cè)樣品的前處理采用溶劑提取的方法，不復(fù)雜，容 易掌握，僅需要h c l 、n a o h 、磷酸二氫鉀緩沖液、t f i s 緩沖液、庚烷( n h e p t a n e ) 幾種 常用試劑，污染?。憾撬璧脑O(shè)備便宜，一臺(tái)g c m s 儀需要上百萬元人民幣，而酶聯(lián) 免疫檢測(cè)儀僅3 4 萬元。這就可滿足縣級(jí)以下單位對(duì)肉中鹽酸克倫特羅殘留的檢測(cè)。三 是從采樣到出結(jié)果整個(gè)過程僅需5 6 h ，這將大大提高對(duì)鹽酸克倫特羅非法使用的檢測(cè) 力度，對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展和保障人民的健康具有重要的意義。 5 2 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物各組織器官的殘留規(guī)律 本研究表明：對(duì)不同種屬的兩種動(dòng)物( 小白鼠和豬) ，采用口服的飼喂方法，飼喂 不同劑量的鹽酸克倫特羅3 0 d 和3 5 d 后，鹽酸克倫特羅在動(dòng)物體內(nèi)的殘留在一定程度上 呈現(xiàn)一致的規(guī)律性。即組織器官的c l b 殘留量均隨飼喂劑量的增加而增加：不論c l b 劑量的高低，同一飼喂劑量機(jī)體的組織器官中的肺臟和肝臟有較高的殘留，高于腎臟， 而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心臟、脾臟和肌肉。 5 2 1 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物心臟的殘留規(guī)律 本研究?jī)H對(duì)豬的心臟中的c l b 殘留進(jìn)行了檢測(cè)。本研究的結(jié)果顯示豬對(duì)照組、試 2 2 驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的心臟殘留量分別為未檢出、5 9 1 n g g 、7 1 o n g g 。試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的用藥劑量逐漸加大，而結(jié)果顯示其殘留量也逐漸升高，表明殘留量有隨用藥劑量增 大而增大的趨勢(shì)。但心臟中的最高殘留也僅7 1 o n g g ，較肝臟3 5 0 8 n g g 、肺臟4 1 5 5 n g g 、 腎臟2 3 2 3 n g g 低。因此，鹽酸克倫特羅在動(dòng)物心臟的殘留較其它組織低。故在許多的 殘留研究中，對(duì)雞( m a l u c e k k i ，1 9 9 4 ) 、羊( e l l i o t ，1 9 9 3 ) 、豬( b r a m b i l l a ，1 9 9 4 ；楊志凌， 2 0 0 1 ) 都很少把心臟作為研究對(duì)象。 5 2 2 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物肝臟的殘留規(guī)律 本研究顯示小白鼠對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組、試驗(yàn)3 組中的殘留量分別為未檢 出、1 0 3 8 n g g 、1 8 1 7 n g g 、2 4 2 8 n g g ；豬對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的殘留量分別為 未檢啦、3 3 8 4 n g g 、3 5 0 8 n g g ；小白鼠肝臟的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相關(guān) ( p 0 0 1 ) ，豬肝臟的c l b 殘留量有隨用藥劑量增大而增大的趨勢(shì)。兩種動(dòng)物試驗(yàn)均 表明在同一劑量下，肝臟較其它組織有較高的殘留，其殘留量?jī)H次于肺臟。這與楊志凌 ( 2 0 0 1 ) 、b r a m b i l l a ( 1 9 9 4 ) 和s m i t h ( 2 0 0 0 ) 的報(bào)道相一致。 肝臟有較高的殘留可能一是因?yàn)楦闻K中藥物代謝酶齊全，含量豐富是藥物代謝的主 要器官；二也可能是由于肝臟中含有大量的結(jié)合蛋白，對(duì)藥物具有強(qiáng)的結(jié)合和滯留能力， 并且血流充沛的緣故。因此，肝臟具有體積大，采樣既方便又容易，運(yùn)送與處理都較方 便，c l b 殘留量高的特點(diǎn)，可作為監(jiān)測(cè)鹽酸克倫特羅殘留的主要器官。 5 2 3 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物脾臟的殘留規(guī)律 本研究?jī)H對(duì)豬的脾臟c l b 殘留進(jìn)行了檢測(cè)。本研究的結(jié)果顯示豬對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的脾臟殘留量分別為未檢出、6 3 1 n g g 、7 8 3 n g g 。試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的 用藥劑量逐漸加大，而結(jié)果顯示其殘留量也逐漸升高，表明用脾臟c l b 殘留量有隨藥 劑量增大而增大的趨勢(shì)。但脾臟的最高殘留量也僅為7 8 3 n g g ，較肝臟3 5 0 8 n 【g g 、肺臟 4 1 5 5 n g g 、腎臟2 3 2 3 n g g 低。因此，脾臟中的殘留相對(duì)少很少將其作為c l b 殘留研究 對(duì)象。 5 2 4 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物肺臟的殘留規(guī)律 本研究顯示小白鼠對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組、試驗(yàn)3 組中的殘留量分別為未檢 出、1 1 4 s n g g 、1 9 6 1 n g g 、2 6 3 3 n g g 、：豬對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的殘留量分別 為未檢出、3 8 6 3 n g g 、4 1 5 5 n g g ；小白鼠肺臟的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相 關(guān)( p 0 0 1 ) ，豬肺臟的c l b 殘留量有隨用藥劑量增大而增大的趨勢(shì)。研究顯示不論 小白鼠還是豬肺臟都是殘留最高的內(nèi)臟器官，這可能因?yàn)榉闻K對(duì)c l b 有較強(qiáng)的親和力 的緣故。這與楊志凌( 2 0 0 1 ) 在對(duì)豬混飼鹽酸克倫特羅( 5 m g k g ) 3 0 d 后，鹽酸克倫特 羅在肺臟中的殘留最高為4 7 6 0 n g g ，m e y e r 和r i n k e ( 1 9 9 1 ) ，s m i t h ( 2 0 0 0 ) 的報(bào)道相一致。 5 2 5 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物腎臟的殘留規(guī)律 本研究顯示小白鼠對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組、試驗(yàn)3 組腎臟中的殘留量分別為 未檢出、4 9 7 n g g 、9 0 4 n g g 、1 2 0 o n g g ；豬對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的殘留量分別 為未檢出、1 9 8 8 n g g 、2 3 2 3 n g g ：小白鼠腎臟的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相 關(guān)( p o 0 1 ) ，豬腎臟的c l b 殘留量有隨用藥劑量增大而增大的趨勢(shì)。腎臟中的殘留 較高( 僅次于肺臟和肝臟) ，這可能是由于腎臟組織是藥物的排泄器官并且其含有大量 的結(jié)合蛋白，對(duì)藥物具有強(qiáng)的結(jié)合和滯留能力的緣故。 5 2 6 鹽酸克倫特羅在動(dòng)物肌肉的殘留規(guī)律 本研究顯示小白鼠對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組、試驗(yàn)3 組中的殘留量分別為未 檢出、1 0 5 n g g 、1 7 9 n g g 、2 3 8 n g g ；豬對(duì)照組、試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的殘留量分別為 未檢出、7 0 3 n g g 、8 1 7 n g g ：小白鼠肌肉的c l b 殘留量與用藥劑量呈極顯著正相關(guān)( p 0 0 5 ) 。但在小 白鼠試驗(yàn)中，試驗(yàn)2 組、試驗(yàn)3 組的平均增重呈負(fù)增加，且采食量呈下降趨勢(shì)，這可能 反應(yīng)出c l b 影響了小白鼠f 常的生長(zhǎng)，對(duì)小白鼠造成了毒性作用。豬試驗(yàn)1 組、試驗(yàn) 2 組的平均增重比對(duì)照組分別增加2 6 2 5 、3 2 7 5 ，試驗(yàn)1 組、試驗(yàn)2 組的采食量比 對(duì)照組分別下降6 0 2 、6 9 7 ，這可能正是由于c l b 對(duì)豬的抑制脂肪沉積，增加蛋白 質(zhì)沉積的作用，從而不需要采食太多的能量，提高平均增重。這說f ! j j 本試驗(yàn)采用的c l b 劑量約為o 1 6 o 6 4 m g k g b w ，已達(dá)到了生產(chǎn)中應(yīng)用以提高豬生產(chǎn)性能的劑量而豬的 各組織均表現(xiàn)出了不同程度的病理變化，這表明在畜牧生產(chǎn)中非法添加c l b 在達(dá)到提 高生產(chǎn)性能目的時(shí)，可能已經(jīng)造成了豬自身的毒害。 5 4 實(shí)際生產(chǎn)中防止鹽酸克倫特羅的漏檢的方法 本研究發(fā)現(xiàn)，口服鹽酸克倫特羅的豬在體態(tài)和生活行為均發(fā)生異常。并且在豬肝臟、 肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織器官發(fā)生了肉限可見的病理變化，同時(shí)證明了肝臟、肺臟、 腎臟有較高的殘留。這表明：在實(shí)際生產(chǎn)中可仔細(xì)觀察屠畜的體態(tài)和行為，并在屠宰動(dòng) 物時(shí)剖解肝臟、肺臟、脾臟和淋巴結(jié)等組織如發(fā)現(xiàn)病理癥狀就可即時(shí)及時(shí)檢出疑似鹽 酸克倫特羅豬肉，防止漏檢錯(cuò)判和中毒事件的發(fā)生，具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。 綜上所述，本試驗(yàn)采用e l i s a 方法對(duì)小白鼠的肌肉和肝臟、肺臟、腎臟等內(nèi)臟器 官，豬的肌肉和心臟、肝臟、脾臟、腫臟、腎臟等內(nèi)臟器官中赫酸克倫特羅的殘留情況， 做了系統(tǒng)全面的分析，找出了適合的檢測(cè)器官和方法。研究了小自鼠和豬對(duì)黼酸克倫特 羅的毒性表現(xiàn)，并進(jìn)行了相應(yīng)的剖檢分析，為官觀檢驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù)。目前，就鹽酸 克倫特羅對(duì)動(dòng)物毒性方面的研究報(bào)道較少，本研究為其積累資料。具有重要意義。 6 結(jié)論 6 1 在豬的各組織器官的中肺臟和肝臟有較高的殘留，高于腎臟，而遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心臟、脾 臟和肌肉。 6 2 豬在肝臟、肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結(jié)等組織均發(fā)生了輕微腫火、膨脹、間質(zhì)水腫， 出血和炎癥等肉眼可見的病理變化。 6 3 肝臟、肺臟都具有殘留量高體積大，采樣既方便又容易，運(yùn)送與處理都較方便的 優(yōu)點(diǎn)，因此，是可食組織中檢測(cè)鹽酸克倫特羅殘目的主要器官。 6 a 在屠宰檢驗(yàn)過程中，若發(fā)現(xiàn)肝臟、肺臟、腎臟和淋巴結(jié)等組織出現(xiàn)上述肉眼可見的 病理變化的胴體，可初步判定為c l b 殘留疑似病豬，即時(shí)檢出，再輔以e l i s a 檢測(cè)， 能有效地防止漏檢錯(cuò)判和中毒事件的發(fā)生，具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。 參考文獻(xiàn) 陳瓊，連玉華2 0 0 0 某肉聯(lián)廠屠宰豬“瘦肉精”殘留的檢測(cè)畜牧與獸醫(yī)3 2 ( 4 ) ：3 1 3 2 陳忠熙一起克倫特羅食物中毒的調(diào)查中國(guó)衛(wèi)生監(jiān)督雜志2 0 0 1 8 ( 5 ) ：2 0 5 - 5 0 6 陳新謙，金有豫1 9 9 9 新編藥物學(xué)( 第1 4 版) 北京人民衛(wèi)生出版社 金米聰，姚潯平，符展明等2 0 0 3 某市肉豬中瘦肉精殘留的檢測(cè)畜牧與獸醫(yī)3 5 ( 4 ) ：3 3 - 3 5 賴碧清，黃理芳2 0 0 2 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7 c i m a t e r o l i n d u c e dm u s c l e h y p e r t r o p h y a n da l t e r e de n d o c r i n e s t o t u si n l a m b s j a n i m s c i 6 5 ：1 5 1 4 1 5 2 7 b i o l a t t ib ，c a s t a g n a r om ，b o l l oe ，a p p i n os 1 9 9 4 g e n i t a ll e s i o n s f o l l o w i n gl o n g t e r ma d m i n i s t r a t i o no f c l e n b u t e r o li nf e m a l ep i g s v e t e r i n a r yp a t h o l o g y 3 l ( 1 ) ：8 1 - 9 2 b l e c h a e 1 9 9 8 i m m u n o m o k u l a t i o n ：am e a n so fd i s e a s e p r e v e n t i o n i ns t r e s s e d l i v e s t o c k j a n i ms c i6 6 ：2 0 8 4 2 0 9 5 b r a i n s ，c h p ，e ta 1 1 9 9 9 o n l i n ec o u p l i n go fs o l i d p h a s ee x t r a c t i o nw i t hm a s ss p e c t r o m e t r yf o rt h e a n a l y s i so fb i o l o g i c a ls a m p l e s i d e t e r m i n a t i o no fc l e n b u t e r o l i nu r i n e j o u r n a lo fc h r o m a t o g r a p h y a 8 6 3 ( 1 ) ：1 1 5 1 2 2 b e r g g r e nc ，, b a y o u d hs ，s h e r r i n g t o nd 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