I 密級： 論文編號： 中國農業(yè)科學院 碩士學位論文 重組 白在豬瘟的檢測 及免疫方面的應用研究 2 I 2 要 接種疫苗 并 檢測 疫 抗 體水平是預防與控制豬瘟的重要技術手段 。 本研究通過原核表達系統(tǒng)高效表達了可溶性的 2 蛋白，用親和層析方法純化，獲得 重組 白 抗原。進行了 豬瘟的檢測及免疫 方面的應用研究：建立了一種檢測 體的間接 法，研制了 相應的 診斷 試劑盒； 將 純化的重組 白 制 作為亞單位分子疫苗 ，通過免疫本動物豬，研究了免疫效果。以上研究 為最終成功研制安全、高效 、可鑒別 的豬瘟亞單位疫苗 奠定了基礎 。 2 蛋白。 應用 增了中國 化弱毒（ 因，構建了原核表達載體轉入到宿主菌 ，在較低的溫度（ 16）和硫代 度（ ）下對重組菌進行了誘導表達，高效表達了可溶性的重組 白。結果顯示，白在大腸桿菌中得到了高效表達，可溶性蛋白的表達量占融合蛋白的 40%。 2 蛋白。 合蛋白與谷胱甘肽的結合是可逆的，用加入還原性谷胱甘肽的洗脫液可以高效地把結合態(tài) 合蛋白洗脫下來。本實驗使用 附型樹脂顆粒，通過親和層析方法快速、簡易、高效地從表達菌中分離純化出重組 白 ， 親和層析純化后其純度可達到約 85%，其濃度可達 5mg/為研究豬瘟診斷試劑盒和新型亞單位分子疫苗奠定了堅實 的物質基礎。 體的間接 法，并研制出相應的 豬瘟 間接 劑盒。 用純化的重組 白作為抗原包被酶標板，以辣根過氧化物酶 (記的兔抗豬 二抗，建立了檢測豬瘟病毒抗體的間接 法，并確定了 佳工作條件：抗原包被濃度分別為 g/被條件為 37放置 1h 后，再 4過夜；豬瘟陽性血清 (180)在 37作用 45標二抗 (1 1000)在 37作用 45物溶液 37顯色 15過敏感性實驗、特異性試 驗、重復性試驗、對比實驗和穩(wěn)定性試驗，表明：該方法的 敏感性為 與國外 司的同類試劑盒比較，兩者的符合率為 92%。 用已建立的方法檢測送檢 血清樣本 500 份， 陽性率為 2 蛋白進行本動物 免疫 實驗。 利用大腸桿菌表達的可溶性重組 白作為抗原，用弗式佐劑乳化后經皮下途徑接種 40日齡仔豬 （ 豬瘟病毒抗 原抗 體 皆為 陰性 ） 7 頭。 每次免疫后 21 天后采血，利用夾心 正向間接血凝檢測抗體的變化，第二次免疫后 21 天時進行攻毒保護試驗。結果表明，第二次加強免疫后 抗體水平明顯上升；攻毒后對照組 4 頭豬中有三頭在 3 8 天之間全部死亡，第四頭豬在 14 天時處于頻死狀態(tài)，疫苗免疫豬全部存活，無豬瘟病毒感染后的臨床癥狀； 無菌采免疫組豬的扁桃體和脾臟，利用 法擴增 因，結果為陰性，利用 司 本動物試驗結果證明利用大腸桿菌表達的重組 且有確實的免疫效果。 關鍵詞 ： 重組 白 ；豬瘟； 和層析； 蛋白純化；間接 V in is , B, C ) 2 by It by It is 2 at 2 be by of 2 in 0%. a of of be in or of E2 in 5%, 5 mg/ an of 7 1h at a 1:80) RP 1: 1000) 7 5to a by of In 500 by it 7 21we 1of bs to It 2 2 英文縮略表 縮寫 英文名稱 中文名稱 體 原 瘟 瘟 病毒 d 甲亞砜 聯(lián)免疫吸附試驗 g 谷胱甘肽轉移酶 h 時 根過氧化物酶 免疫球蛋白 G 道爾頓 L 相阻斷 酶聯(lián)免疫吸附試驗 m 克隆抗體 克隆抗體斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗 密度值 酸鹽緩沖液 0 磷酸鹽吐溫緩沖液 乙二醇 （氫離子當量濃度指數(shù)） 四甲基聯(lián)苯胺 間接血凝試驗 呼吸與繁殖障礙綜合征病毒 分鐘轉速 分鐘 二烷基硫酸鈉 十二烷基硫酸鈉 g 克 L 升 錄 第一章 緒 言 瘟研究進展 . 1 述 . 1 瘟病原、臨床癥狀與發(fā)病機理 . 1 瘟的分布與危害 . 2 瘟的流行動態(tài) . 2 瘟的診斷 . 3 瘟的防制 . 5 瘟病毒研究進 展 . 7 瘟病毒粒子的結構 . 7 瘟病毒理化特性 . 8 瘟病毒的抗原性、毒力和分型 . 8 瘟病毒的分子生物學研究 . 9 第二章 豬瘟病毒 白在大腸埃希氏菌中的可溶性表達 . 12 料與方法 . 12 株 . 12 株和質粒 . 12 和試劑 . 12 器和設備 . 12 計合成引物 . 12 取病毒 克隆目的片段 . 13 建重組表達載體 . 14 導表達重組蛋白 . 14 定所表達的蛋白 . 15 果 . 15 的基因的克隆 . 15 組表達載體的鑒定 . 16 組蛋 白的表達 . 17 達產物的檢測 . 17 論 . 18 達載體、宿主菌與外源基因 . 18 融合蛋白 可溶性表達條件 . 18 第三章 豬瘟病毒重組 白的純化 19 材料與 方法 . 19 劑 . 19 料與方法 . 19 關溶液的配制 . 19 達重組 白工程菌的制備 . 20 和層析法純化流程 . 20 縮 白濃度、純度的測定 . 21 白活性測定 . 21 果 . 22 和層析法純化流程結果 . 22 縮 白濃度、純度的測定 . 22 2 蛋白活性測定 . 22 論 . 22 第四章 基于重組 白建立并優(yōu)化檢測 豬瘟病毒抗體的間接 . 25 料和方法 . 25 原 . 25 劑和耗材 . 25 需溶液的配制 . 25 接 法的建立 . 26 感性試驗 . 27 異性試驗 . 27 復性試驗 . 27 比試驗 . 27 間血清樣品的檢測 . 27 果 . 28 接 法最佳工作條件的確定 . 28 接 法陰陽性臨界值的確定 . 29 感性試驗 . 29 異性試驗 . 30 復性試驗 . 31 比試驗 . 31 間血清樣品的檢測 . 32 存期試驗 . 33 論 . 五章 重組 白亞單位 疫苗豬體免疫試驗 . 34 料和方法 . 34 疫材料 . 34 要試劑 . 34 苗的制備及免疫劑量 . 34 驗動物及分組免疫 . 34 體的監(jiān)測 . 35 果 . 35 驗豬體內 異性抗體的變化 . 35 毒試驗 . 36 論 . 36 第六章 全文結論 . 38 參考文獻 . 39 致 謝 . 44 者簡歷 45 圖表清單 圖 2增 因 12 圖 2核表達載體 構建策略圖 1 6 圖 2切鑒定 1 6 圖 2析 37 和不同 度誘導表達的 結 1 7 圖 2 17 圖 3和層析法純化流程 白 12 圖 32 蛋白 1 6 圖 3白純化系統(tǒng)示意圖 16 圖 4接 法 1 6 表 4陣滴定的 P/N 值結果 18 表 4佳包被條件結果 18 表 4佳 反應時間 結果 18 表 4感性試驗結果 19 表 4斷試驗結果 19 表 4叉試驗結果 19 表 4復試驗結果 20 表 4比試驗結果 20 表 4間血清樣品檢測結果 21 表 4存期試驗結果 21 表 5驗動物分組 21 圖 5劑盒檢測 異性抗體 28 表 5毒結果 28 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第 一 章 緒言 1 第一章 緒 言 瘟研究進展 述 豬瘟是豬的一種高度接觸性傳染病，以發(fā)熱和出血為主要特征，死亡率非常高（蔡寶祥，1999）。該病早期被稱為豬霍亂 (我國民間稱之為爛腸瘟，歐洲為了與非洲豬瘟相區(qū)別，將其稱為古典豬瘟（ 1957 年 據 道，豬瘟樣疫病最早約 1810年出現(xiàn)于美國田納西州，后來大約在 1833 年又在美國俄亥俄州暴發(fā)（ J, 1957）。但 1968 年據 道，該病于 1862 年首先出現(xiàn)于英格蘭，然后傳到歐洲大陸。我國關于 報道，最初是從東南大學農科系于 1925 年研究 疫血清的記載開始的，至于何時發(fā)現(xiàn)和證明豬瘟存在，沒有明確的文字記載。 由于豬瘟具有高度接觸傳染性和巨大的經濟破壞力，國際獸疫局 其列為 A 類傳染?。?1998）。 A 類傳染病是指癥狀特別嚴重、傳播迅速、無國界，能造成巨大的社會經濟損失和嚴重公共衛(wèi)生問題，對動物及其產品國際貿易有嚴重影響，按照 “國際動物衛(wèi)生法（ ”必須向 報的傳染?。?由于不同毒株的毒力不同，豬感染該病后引起疾病的嚴重程度差異相當大。目前，豬瘟主要分布在亞洲、非洲、南美洲和歐洲的 40 多個國家和地區(qū)。 豬瘟的爆發(fā)嚴重影響豬及豬制品貿易 。 調查顯示，現(xiàn)階段 然是對全球養(yǎng)豬業(yè) 威脅最大的疾?。?et 在我國 ， 豬瘟的危害也十分嚴重，每年因豬瘟死亡的豬占飼養(yǎng)總數(shù)的 3%劉湘濤等， 1995）。但也有一些國家，包括澳大利亞、加拿大、新西蘭、美國和一些歐盟成員國，在采取了嚴格的措施后，成功地消滅了豬瘟 (, et 瘟病原、臨床癥狀與發(fā)病機理 豬瘟的病原是豬瘟病毒 ( 早在 1885 年和 1886 年 ， 提出：豬瘟是一種由霍亂沙門氏菌引起的細菌性疾病。1903 年 先證實：豬瘟的致病因子是濾過性的病毒。近幾年來，通過對該病毒的蛋白結構、核酸序列以及基因重組和表達等方面的深入研究，證明了該病毒的基因結構、復制類型以及表達方式和黃病毒極為相似，應歸屬于黃病毒科 (史國瑞， 1993），因此豬瘟病毒便歸為黃病毒科 (病毒屬 (這個屬的成員還有在抗原性和結構上與 切相關的牛病 毒性腹瀉病毒 (綿羊邊界病病毒 ( M,1977)。 自然條件下， 般通過口腔粘膜感染 且只 感染豬， 其 潛伏期為 7 10 天。感染豬發(fā)生結膜炎和白細胞減少等癥狀，最典型的癥狀是皮膚和粘膜的斑點性出血?；夹笾袠猩窠浵到y(tǒng)紊亂、便秘及隨后的腹瀉也是特征性的表現(xiàn)。臨床癥狀的嚴重性取決于動物的年齡和病毒的毒力。成年豬感染后常表現(xiàn)為溫和或亞臨床癥狀；仔豬受其影響更嚴重，感染后死亡率可達 90%。經胎盤感染后的影響主要取決于妊娠的時間，可能會導致流產、死胎、木乃伊胎、畸胎及產出體質差或持續(xù)性病毒血癥的仔豬（王鎮(zhèn)等， 2000；李成等， 1989）。持續(xù)性感染的仔豬出生時可能表現(xiàn)正常，但都最終死亡。 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第 一 章 緒言 2 毒動物體內的靶細胞是內皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和一些表皮細胞。病理變化因臨床癥狀的不同而不同（ W, et 在胚胎發(fā)育的早期階段，病毒會影響器官的分化而導致畸形；出生后的感染主要引起血管內皮的損傷和出血體質的血栓。造成的病理損傷可能包括淋巴組織的實質變性 、血管內皮組織的細胞增生、非化膿性腦膜腦炎等。急性感染期間， 能引起機體的免疫抑制；急性感染末期，循環(huán)系統(tǒng)和淋巴組織中 B 淋巴細胞數(shù)量減少（ 2000） 。急性感染后 2 周即可檢測出中和抗體，而對于慢性感染豬，感染后第一個月的月末幾天才能檢測到中和抗體，隨后抗體消失（ 2000；, et 持續(xù)性病毒血癥的感染豬 則 很少產生特異性抗體。康復豬可獲得被動保護達幾年甚至終生。母源抗體半衰期約為 14 天，被動免疫通常在第 5 周 對仔豬產生保護，但不能阻止病毒的復制和散播。 瘟的分布與危害 豬瘟是一種嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)并具有重要經濟意義的病毒性疾病，被世界動物衛(wèi)生組織 (入 16 種 A 類法定傳染病（ 1998）。 1996 年，在意大利舉行的國際豬獸醫(yī)大會上肯定 養(yǎng)豬業(yè)的頭號大敵（洪文學， 1997）。我國農業(yè)部于 1999 年 2月發(fā)布了第 96 號公告，也將豬瘟列為一類動物疫病。 自 豬瘟 發(fā)現(xiàn)以來，世界各國對該病 的防制作出了巨大的努力，而且在北美、澳洲和北歐的一些 地區(qū)還成功 消滅了豬瘟，但豬瘟 仍然在世界 許多地區(qū)廣泛傳播，并造成了巨大的經濟損失。據糧農組織 世界衛(wèi)生組織 (動物衛(wèi)生年鑒 (1982)公布，全世界現(xiàn)有 44 個國家和地區(qū)存在豬瘟，主要分布在南美、歐洲和遠東的一些國家和地區(qū)。聯(lián)合國衛(wèi)生組織 1998 年的資料指出，豬瘟在非洲的馬達加斯加、美洲的古巴、海地、亞洲的大部分地區(qū)，歐洲的一些國家和地區(qū)仍在發(fā)生和流行（何北慶， 1999）。近期 世界各國仍不斷 暴發(fā)豬瘟， 2002 年 1 月，德國萊茵 區(qū)和 盧森堡 區(qū)的野豬發(fā)生豬瘟； 2002 年 3 月，保加利亞持續(xù)發(fā)生豬瘟； 2002 年 4 月，韓國和羅馬尼亞發(fā)生豬瘟，法國在野豬中發(fā)生豬瘟； 2002 年 5 月，斯洛文尼亞在野豬中檢測出豬瘟病毒； 2002 年 6 月克羅地亞發(fā)生了豬瘟（高彥生等， 2002）。在中國的大陸和臺灣地區(qū)也有豬瘟流行，其中大陸多以散發(fā)和慢性病例為主（ u, et 2001）。 急性 高燒和復合性出血 為主要臨床 癥狀 ，但是近些年來該病常表現(xiàn)出慢性或非典型的流行特征：感染豬不表現(xiàn)出任何病癥，但病毒 能通過接觸或豬肉產品 的加工和 運 輸 而迅速擴散，引起豬瘟暴發(fā)，造成巨大的經濟損失。例如，美國在 1962 年實施聯(lián)邦政府豬瘟根除計劃