密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 大白菜游離小孢子培養(yǎng)及其胚胎發(fā)生 和加倍機(jī)理的研究 F N . F N . 要 游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在植物育種以及相關(guān)的基礎(chǔ)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景，近年來(lái)這 一技術(shù)在蕓薹屬植物中得到迅速發(fā)展。為了進(jìn)一步完善大白菜游離小孢子培養(yǎng)體系，本試驗(yàn)以不同胚誘導(dǎo)能力的基因型大白菜為試材，針對(duì)培養(yǎng)體系中的預(yù)處理方法、胚胎移植成苗培養(yǎng)方法等進(jìn)行了新的嘗試與改良；通過(guò)細(xì)致的顯微觀察，對(duì)大白菜小孢子離體培養(yǎng)過(guò)程中的胚胎發(fā)生和自然加倍機(jī)理進(jìn)行研究與探討。 大白菜小孢子提取過(guò)程中進(jìn)行短期的預(yù)處理，增加 取培養(yǎng)基的蔗糖濃度、添加適當(dāng)濃度的甘露醇不會(huì)影響小孢子的活力，卻潛在影響了后期小孢子培養(yǎng)的脫分化，明顯提高了離體小孢子培養(yǎng)的胚胎誘導(dǎo)率。 取培養(yǎng)基兩組處理中，蔗糖濃度為 17%和甘 露醇濃度 8%的處理效果最好，各材料每皿平均出胚量與對(duì)照相比都達(dá)到極顯著水平。參試的 9 份材料顯示兩組處理都有效的提高了大白菜小孢子的出胚量，但大白菜基因型仍然是影響小孢子胚胎發(fā)生的主要因素。 大白菜小孢子子葉期胚移植成苗實(shí)驗(yàn)表明，子葉期胚直接轉(zhuǎn)入 體培養(yǎng)基進(jìn)行 25 /16h 光照培養(yǎng)，大多數(shù)胚狀體子葉變肥厚，愈傷化，往往要通過(guò)二次分化才能發(fā)育為正常植株。對(duì) 5 份參試材料培養(yǎng)的子葉期胚進(jìn)行 4低溫前處理，低溫處理雖然不能完全克服大白菜不同基因型子葉期胚向植株移植培養(yǎng)的差異，但能有效降低培養(yǎng)過(guò)程胚的死亡率，與對(duì)照 相比都不同程度提高了胚狀體的成苗率，同時(shí)大部分子葉期胚能不經(jīng)過(guò)二次分化而快速的生長(zhǎng)為正常植株。比較各處理 8周的培養(yǎng)結(jié)果， 4低溫 10 天處理與對(duì)照相比在子葉期胚的成苗率和死亡率上都達(dá)到最佳效果。 通過(guò)顯微觀察，誘導(dǎo)適期的大白菜小孢子是成功獲得胚狀體的前提，單核靠邊期小孢子經(jīng)熱激誘導(dǎo)啟動(dòng)的標(biāo)志是圓球型小孢子體積明顯膨大，同時(shí)觀察到細(xì)胞核發(fā)生自然加倍，單核小孢子變?yōu)槎扼w的單細(xì)胞。說(shuō)明大白菜小孢子在培養(yǎng)初期就可能完成胚胎的自然加倍。顯微觀察發(fā)現(xiàn)熱激誘導(dǎo)啟動(dòng)下，大白菜小孢子的胚胎發(fā)育途徑是幾種方式并存的，但以 B 途徑 為主要發(fā)育途徑，此外還存在少量的 A 途徑發(fā)育和不對(duì)稱分裂的細(xì)胞團(tuán)。啟動(dòng)后以 B 途徑為主要發(fā)育途徑的大白菜小孢子離體培養(yǎng) 48 小時(shí)發(fā)生第一次細(xì)胞分裂，形成兩個(gè)對(duì)稱的子細(xì)胞，離體培養(yǎng) 72 小時(shí)發(fā)生第二次細(xì)胞分裂，形成對(duì)稱的四細(xì)胞團(tuán)，之后細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)對(duì)稱分裂最終形成胚狀體。 鍵詞： 大白菜，小孢子培養(yǎng)，自然加倍， B 途徑，蔗糖，甘露醇，低溫預(yù)處理 is to A to In of to of of to n to . of of 5 of a on of In to of at 5 so 5 6h of to to to 5 an of )5 in In of of 0d. of be to up of to be is be of 8 of 2 of to is A be , V 目 錄 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 . 1 1 1 發(fā)展進(jìn)程 . 1 1 2 研究現(xiàn)狀 . 2 1 2 1 供體植株對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響 . 2 1 2 2 小孢子的誘導(dǎo)時(shí)期 . 3 1 2 3 小孢子胚胎發(fā)育途徑 . 3 1 2 4 培養(yǎng)技術(shù) . 4 1 2 5 小孢子胚誘導(dǎo)再生植株的研究 . 6 1 3 游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用前景 . 7 1 3 1 在育種上的應(yīng)用 . 7 1 3 2 在基礎(chǔ)研究上的應(yīng)用 . 7 1 3 3 應(yīng)用于種子生理研究和種質(zhì)保存 . 8 1 4 存在的問題及展望 . 8 1 5 本研究的目的和意義 . 9 第二章 蔗糖、甘露醇預(yù)處理對(duì)大白菜小孢子培養(yǎng) 胚胎發(fā)生的影響 . 10 2 1 引言 . 10 2 2 試驗(yàn)材料與方法 . 10 2 2 1 試驗(yàn)材料 . 10 2 2 2 主要試劑 . 10 2 2 3 試驗(yàn)方法 . 10 2 3 結(jié)果與分析 . 11 2 3 1 提取培 養(yǎng)基成份對(duì)大白菜小孢子胚胎誘導(dǎo)的影響 . 11 2 3 2 高濃度蔗糖、甘露醇 取培養(yǎng)基對(duì)小孢子培養(yǎng)的影響 . 12 2 3 3 良培養(yǎng)基提取大白菜小孢子 25直接培養(yǎng)的胚胎誘 導(dǎo) . 18 2 4 小結(jié) . 19 第三章 低溫預(yù)處理對(duì)提高大白菜小孢子胚狀體成苗率 的研究 . 20 1 引言 . 20 3 2 材料與方法 . 20 3 2 1 材料 . 20 3 2 2 試劑 . 21 3 2 3 方法 . 21 3 3 結(jié)果與分析 . 21 3 3 1 低溫處理對(duì)大白菜子葉期胚生長(zhǎng)發(fā)育的影響 . 21 3 3 2 低溫處理對(duì)大白菜子葉期胚成苗轉(zhuǎn)化的影響 . 22 3 4 小結(jié) . 26 第四章 大白菜游離小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生及發(fā)育途徑 . 27 4 1 引言 . 27 4 2 材料與方法 . 27 4 2 1 材料 . 27 4 2 2 方法 . 27 4 3 結(jié)果與分析 . 27 4 3 1 大白菜離體培養(yǎng)的適期小孢子形態(tài) . 27 4 3 2 經(jīng)熱激誘導(dǎo)啟動(dòng)的小孢子形態(tài) . 28 4 3 3 大白菜小孢子啟動(dòng)后的細(xì)胞分裂 . 28 4 3 4 胚狀體發(fā)育的不同步性 . 29 4 4 小結(jié) . 30 第五章 大白菜游離小孢子培養(yǎng)胚胎發(fā)生的加倍機(jī)理 . 31 5 1 引言 . 31 5 2 材料與方法 . 31 5 2 1 材料 . 31 5 2 2 試劑 . 31 5 2 3 試驗(yàn)方法 . 31 5 3 結(jié)果與分析 . 32 5 3 1 大白菜小孢子的配子體發(fā)育 . 32 5 3 2 大白菜小孢子誘導(dǎo)啟動(dòng)后核的分裂 . 32 4 小結(jié) . 35 第六章 討論與結(jié)論 . 36 6 1 預(yù)處理對(duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生的影響 . 36 6 2 低溫預(yù)處理對(duì)大白菜子葉期胚向植株移植培養(yǎng)的影響 . 37 6 3 大白菜游離小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生及發(fā)育途徑 . 38 6 4 大白菜游離小孢子培養(yǎng)細(xì)胞分裂以及核加倍機(jī)理 . 39 6 5 結(jié)論 . 40 參考文獻(xiàn) . 42 附 錄 . 48 致 謝 . 52 作者 簡(jiǎn)歷 . 53 略詞表 4， 6鹽酸 4， 6二 脒基 2苯基吲哚 養(yǎng)基：蔗糖濃度為 13%的 養(yǎng)基 養(yǎng)基：無(wú)蔗糖的 養(yǎng)基 體再生培養(yǎng)基：蔗糖濃度為 瓊脂濃度 養(yǎng)基 養(yǎng)基：蔗糖濃度為 13%的 養(yǎng)基 單核靠邊期小孢子： 從四分體釋放出來(lái)的小孢子隨體積增大，小孢子 細(xì)胞質(zhì)發(fā)生液泡化，逐漸形成一個(gè)中央大液泡，細(xì)胞核隨著從中央移到細(xì)胞的一側(cè)，此時(shí)的小孢子稱為單核靠邊期小孢子。 胚胎發(fā)育 A 途徑 ： 小孢子誘導(dǎo)脫分化啟動(dòng)后，小孢子核由正常的有絲分裂形成一個(gè)大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)小的生殖細(xì)胞。以后營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)分裂，產(chǎn)生一個(gè)單倍體的球型胚狀體，胚狀體最終由于花粉外壁的破裂而被釋放出來(lái)。 胚胎發(fā)育 B 途徑 ： 小孢子誘導(dǎo)脫分化啟動(dòng)后有絲分裂形成兩個(gè)均等的細(xì)胞而不分化為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞，這兩個(gè)均等細(xì)胞再繼續(xù)分裂，最終形成胚狀體。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 1 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 蕓薹屬植物種 質(zhì)資源十分豐富，在我國(guó)栽培的蕓薹屬植物中一部分是重要的葉菜類蔬菜，一部分是油料作物，二者在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中都占有重要的地位。我國(guó)在蕓薹屬植物常規(guī)育種方面成績(jī)顯著，但隨著育種目標(biāo)的不斷推進(jìn)，僅僅依靠常規(guī)育種手段已經(jīng)不能滿足育種工作的需要。單倍體育種技術(shù)為縮短育種年限、提高育種效率提供了可能。游離小孢子培養(yǎng)是獲得單倍體的主要途徑之一，隨著小孢子培養(yǎng)方法的日趨完善，這一技術(shù)開始被廣泛應(yīng)用于常規(guī)雜交育種，逐漸成為作物改良和新品種培育工作的一個(gè)重要手段。 游離小孢子培養(yǎng)是在花藥培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)，由于小孢子 為單細(xì)胞，具有天然的分散性，數(shù)量巨大，易于獲得，它克服了花藥培養(yǎng)的諸多缺陷，同時(shí)它是一種在單細(xì)胞水平上獲得純系的培養(yǎng)方法，能直接利用高等植物的未成熟花粉即小孢子離體培養(yǎng)成單倍體植株，再經(jīng)過(guò)人工或自然加倍而成為純合的二倍體植株。在植物育種、基因工程以及生理研究等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景，從而受到研究人員的廣泛親睞。 1 1 發(fā)展進(jìn)程 1972 年 用看護(hù)培養(yǎng)法培養(yǎng)番茄的離體花粉，獲得了單倍體無(wú)性繁殖系；之后 1973）首次成功應(yīng)用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得了毛葉曼陀羅的小孢子胚與再生植株；二十 世紀(jì) 80 年代， 1985； 1986）在煙草上成功建立了有效的游離小孢子培養(yǎng)體系，并對(duì)小孢子的離體萌發(fā)和離體胚胎發(fā)生的調(diào)控進(jìn)行了研究。 1982 年， 次報(bào)道了甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)成功獲得了小孢子胚及其再生植株，使十字花科蕓薹屬作物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入快速發(fā)展階段。在此后的二十年間，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)先后在蕓薹屬作物的結(jié)球甘藍(lán)、大白菜、花椰菜、小白菜、黑芥、葉芥、青花菜等十余種蔬菜中獲得成功，并在材料基因型、培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件、胚狀體的植株再生和加倍等方面的研究取得了一 定進(jìn)展（ 1989；1989；張鳳蘭等， 1994；王蒂等， 1996），使游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系得到不斷地完善。 表 1薹屬作物游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株一覽表 of 號(hào) 稱 丁名 表作者 表時(shí)間 甘藍(lán)型油菜 982 2 埃塞俄比亞芥 982 3 黑芥 989 4 大白菜 989 5 羽衣甘藍(lán) 989 6 結(jié)球甘 藍(lán) 990 7 青花菜 991 8 芥藍(lán) 991 9 小白菜 992 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 2 10 油用蕪菁 992 11 花椰菜 992 12 白菜型油菜 992 13 根芥 巖 1992 14 抱子甘藍(lán) 992 15 蕪菁甘藍(lán) 993 16 蕪菁 994 17 紫菜薹 光濤 1996 18 菜薹 996 19 包心芥菜 玉萍 1998 20 球莖甘藍(lán) 準(zhǔn) 1999 1 2 研究現(xiàn)狀 1 2 1 供體植株對(duì)小孢子胚胎發(fā)生的影響 1 2 1 1 基因型對(duì)胚胎誘導(dǎo)的影響 在蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)中，供體植株的基因型是影響小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)鍵因素。這主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面。一方面，不同基因型決定供體植株是否能夠誘導(dǎo)出胚，另一方面體現(xiàn)在不同基因型誘導(dǎo)出胚的產(chǎn)胚率的差異。余鳳群等（ 1995）用 130 份甘藍(lán)型油菜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，有35 份獲得胚狀體；張德雙等（ 1998）誘導(dǎo) 13 份青花菜材料，有 8 份材料有胚胎發(fā)生；嚴(yán)準(zhǔn)等（ 1999）在同樣條件下對(duì) 4 種甘藍(lán)類材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，只有苤藍(lán)有胚狀體產(chǎn)生，青 花菜只誘導(dǎo)出大量愈傷組織，青苤藍(lán)和結(jié)球甘藍(lán)既無(wú)胚狀體又無(wú)愈傷產(chǎn)生，都證明了基因型對(duì)小孢子胚胎發(fā)生能力的影響。在大白菜游離小孢子培養(yǎng)中，曹鳴慶等（ 1993）對(duì) 17 個(gè)不同基因型大白菜，包括了早熟到晚熟的各種類型進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示：供試的 17 份大白菜中有 16 個(gè)基因型獲得了小孢子胚。栗根義（ 1993）對(duì) 13 份大白菜材料進(jìn)行培養(yǎng)，有 12 份材料誘導(dǎo)出胚。說(shuō)明在適宜的條件下，大白菜的大多數(shù)基因型都可以通過(guò)游離小孢子培養(yǎng)的方法獲得小孢子胚。 此外，供體材料的不同基因型之間產(chǎn)胚率也存在較大差異。曹鳴慶等（ 1993）研 究發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)胚率最高的大白菜材料其平均產(chǎn)胚率可達(dá) 350 個(gè) /蕾，而大多數(shù)基因型的大白菜平均產(chǎn)胚量在 2 個(gè)/蕾以下。栗根義（ 1993）在大白菜游離小孢子培養(yǎng)不同基因型胚誘導(dǎo)效果中也得到相同結(jié)論。997)研究大白菜不同品種的小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生能力，發(fā)現(xiàn)熱帶品種有較高的胚胎發(fā)生能力，而日本當(dāng)?shù)仄贩N則較差。劉凡（ 2001）調(diào)查大白菜小孢子胚胎發(fā)生能力與植株類型的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，小孢子胚胎發(fā)生能力與大白菜抱合類型、熟性有一定相關(guān)性，其中，疊抱類型產(chǎn)胚率高于合抱類型，早熟類型產(chǎn)胚率高于中、晚類型。蕓薹屬其他 植物如菜心、芥藍(lán)等在胚狀體的誘導(dǎo)率上也同樣受到基因型的顯著影響（朱允華等， 2003；何杭軍等， 2004；王濤濤等， 2004）。 1 2 1 2 供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)胚胎誘導(dǎo)的影響 由于小孢子活力受供體植株影響，因此，供體植株生長(zhǎng)的環(huán)境條件直接影響了游離小孢子培中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 3 養(yǎng)的胚狀體誘導(dǎo)頻率。一般從發(fā)育健壯、在適宜環(huán)境條件下生長(zhǎng)的供體植株采集花蕾培養(yǎng)胚狀體的效果較好，但不同品種適宜的環(huán)境條件不同。 為（ 1989）大白菜供體植株生長(zhǎng)的最適條件是日照 1418 小時(shí)，溫度 1520。張鳳蘭、釘貫靖久等（ 1994）利用人工 氣候室研究了光照和溫度對(duì)大白菜小孢子胚胎發(fā)生的影響，結(jié)果表明對(duì)胚狀體發(fā)生能力較強(qiáng)的品種，在 14h 長(zhǎng)日照和 15度條件下出胚率顯著高于 12h 短日照、 25溫度條件下生長(zhǎng)的植株；對(duì)胚狀體發(fā)生能力較弱的品種，環(huán)境條件對(duì)小孢子培養(yǎng)影響顯著，供體植株生長(zhǎng)在日照 1 4 小時(shí)、溫度 15條件下小孢子誘導(dǎo)成胚率最高。花椰菜培養(yǎng)采自生長(zhǎng)在春天 1020溫室的供體植株效果最好（ 1992）。 為了獲得活力較高的小孢子，供體植株的栽培季節(jié)也很重要。曹鳴慶（ 1993）認(rèn)為大白菜的開花季節(jié)為 45 月，此時(shí)溫度 一般較高，為了提高小孢子胚胎發(fā)生率應(yīng)把供體植株花期安排在冬季和早春。花椰菜的花藥培養(yǎng)也是冬、春季效果好于夏、秋季（ 1992）。除日照、溫度外，供體植株?duì)I養(yǎng)狀況也影響小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生； 1988）認(rèn)為供體植株栽培過(guò)密會(huì)減少小孢子胚胎發(fā)生頻率。因此為供體植株創(chuàng)造適宜的生長(zhǎng)條件，使其不受逆境沖擊，是提高小孢子培養(yǎng)出胚率的重要保證。 1 2 2 小孢子的誘導(dǎo)時(shí)期 小孢子的發(fā)育時(shí)期通常分為單核期、二核期和三核期。理論上每個(gè)小孢子都具有細(xì)胞全能性，但實(shí)際培養(yǎng)中并非任何時(shí)期的小孢子都適于培養(yǎng)，只有 那些處于一定發(fā)育時(shí)期的小孢子離體后才可能從原來(lái)配子體發(fā)育途徑經(jīng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換到孢子體發(fā)育途徑形成胚狀體，并進(jìn)一步分化成植株。在植物花藥和花粉培養(yǎng)中，小孢子最適于培養(yǎng)的時(shí)期通常為單核花粉期和二核花粉早期，蕓薹屬植物也是如此（ 1988； 1988），因而如何獲得盡可能多的適合發(fā)育時(shí)期的小孢子群體就成了游離小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。 984)在進(jìn)行甘藍(lán)型油菜花藥培養(yǎng)時(shí)曾指出，花蕾的形態(tài)是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標(biāo)，但它也隨著供體植株基因型、生長(zhǎng)條件和年齡、花序等的變化而變化。 1989）顯微觀察結(jié)果表明：大白菜小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳時(shí)期為單核中期至單核晚期；曹鳴慶（ 1993）報(bào)道大白菜花蕾在 2小孢子處于單核中期至單核晚期的比例最大，小孢子胚的產(chǎn)率最高。當(dāng)大白菜花蕾長(zhǎng)度小于 大于 ，均不能誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生。 （ 1975）在進(jìn)行白菜型油菜花藥培養(yǎng)、 （ 1984； 1985）進(jìn)行抱子甘藍(lán)花藥培養(yǎng)、 （ 1986）在進(jìn)行甘藍(lán)花藥培養(yǎng)時(shí)都發(fā)現(xiàn)小孢子的發(fā)育階段和花蕾中花瓣 /花藥長(zhǎng)度比密切相關(guān)。此外，也有以雙核期小孢子比 例作為小孢子群體是否適宜培養(yǎng)的指標(biāo)。張德雙等認(rèn)為雙核期小孢子比例對(duì)青花菜游離小孢子培養(yǎng)影響較大，只有比例適宜，才能獲得大量小孢子胚，因?yàn)榍嗷ú送换ɡ僦行℃咦影l(fā)育極不同步，依據(jù)花蕾或花瓣與花藥長(zhǎng)之比來(lái)確定最適合的小孢子培養(yǎng)時(shí)期都有較大的不確定性（ 1998）。因此在蕓薹屬植物的實(shí)際培養(yǎng)中要根據(jù)不同品種，依據(jù)不同的形態(tài)指標(biāo)來(lái)獲取最適宜誘導(dǎo)的小孢子群體。 1 2 3 小孢子胚胎發(fā)育途徑 人們?cè)谘芯亢瘫究谱魑锏挠坞x小孢子培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，小孢子形成花粉植株的發(fā)生過(guò)程存在雄核發(fā)育的多途徑并存現(xiàn)象，蕓薹屬在這一領(lǐng)域的研究還未見詳 細(xì)報(bào)道。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 4 目前，根據(jù)脫分化啟動(dòng)的小孢子第一次分裂情況將胚胎發(fā)育途徑分為 A 途徑（不均等分裂）和 等分裂）兩大類，其中 A 途徑又可以根據(jù)第二次分裂及其以后的情況作進(jìn)一步的細(xì)分。在水稻、小麥、大麥、玉米的相關(guān)研究中都報(bào)道了小孢子胚胎發(fā)育的多途徑現(xiàn)象，但產(chǎn)生的原因目前尚無(wú)公認(rèn)的確切解釋。朱至清等（ 1988）在研究小麥雄核發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育以 A 途徑為主和 B 途徑為主受基因型影響；郭向榮等（ 1997）研究大麥小孢子培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)不同預(yù)處理方法改變離體小孢子的第一次有絲分裂方式，從而形成不同的主要發(fā)育途徑。低溫預(yù)處理胚胎發(fā) 育以 A 途徑為主，直接游離培養(yǎng)以 B 途徑為主；此外，還有不少研究者認(rèn)為胚胎發(fā)育以 A 途徑為主還是 B 途徑為主與小孢子培養(yǎng)時(shí)所處的發(fā)育階段密切相關(guān)（ 1980；何定綱， 1985）。 1 2 4 培養(yǎng)技術(shù) 1 2 4 1 預(yù)處理 在游離小孢子培養(yǎng)過(guò)程中，為了誘導(dǎo)小孢子的胚胎發(fā)生往往需要進(jìn)行預(yù)處理。預(yù)處理的目的是通過(guò)外界的脅迫作用使小孢子發(fā)生一系列的生理生化變化，促使小孢子完成脫分化啟動(dòng)，從而改變小孢子的發(fā)育途徑。目前見于報(bào)道的主要預(yù)處理方法包括：高溫預(yù)處理、低溫預(yù)處理、甘露醇預(yù)處理、秋水仙素預(yù) 處理和饑餓預(yù)處理。不同物種采用的預(yù)處理方法不同。預(yù)處理首先在曼佗羅和煙草上取得較好的試驗(yàn)結(jié)果，此后在茄科作物中， 1997）對(duì)辣椒的花藥培養(yǎng)采用低溫預(yù)處理獲得明顯的胚誘導(dǎo)效果； 1996）在茄子花藥培養(yǎng)中進(jìn)行蔗糖的饑餓預(yù)處理和 3天 35高溫預(yù)處理獲得很好的胚誘導(dǎo)效果。在禾本科的花藥和小孢子培養(yǎng)中對(duì)小麥、玉米采取30溫預(yù)處理，水稻進(jìn)行 9溫預(yù)處理，大麥進(jìn)行甘露醇預(yù)處理都取得了明顯效果（郭向榮等， 1999）；在十字花科蕓薹屬作物中， 1985）首次報(bào)道在油菜游離小孢子培養(yǎng)中將直接分離的小孢子群體在 32條件下高溫預(yù)處理 3 天再轉(zhuǎn)入 25培養(yǎng)，結(jié)果與 25培養(yǎng)效果有明顯差異。此后 1988）和 1978）完善了高溫預(yù)處理技術(shù)，使甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)胚誘導(dǎo)率明顯提高。栗根義（ 1993）在大白菜游離小孢子培養(yǎng)中認(rèn)為高溫預(yù)處理對(duì)大白菜小孢子胚誘導(dǎo)是很必要的，它改變了細(xì)胞的發(fā)育途徑，促進(jìn)胚胎的形成。劉公社（ 1995）研究大白菜小孢子培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)高溫預(yù)處理可抑制小孢子的配子體發(fā)育途徑，有效的提高單核小孢子核對(duì)稱分裂的頻率，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明游離小孢子存在高溫敏感期，即小孢子在 32培養(yǎng) 1 天便可達(dá)到最佳胚誘導(dǎo)效果，如果熱激時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而影響小孢子的活力。高溫預(yù)處理在蕓薹屬其他植物如結(jié)球甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、花椰菜、青花菜等小孢子培養(yǎng)中都獲得明顯的胚誘導(dǎo)效果（ 1981；1989； 1990）。另外，在油菜的小孢子培養(yǎng)中還采取低溫預(yù)處理。王亦菲（ 2002）報(bào)道油菜在 4低溫預(yù)處理 1脫分化啟動(dòng)最為有利。余鳳群（ 1995）報(bào)道甘藍(lán)型油菜 6 理 1d 胚誘導(dǎo)效果最好。目前低溫預(yù)處理的方法在油菜中被 普遍采用，但在其他蕓薹屬植物中還未見報(bào)道。此外， 996)在甘藍(lán)型油菜的游離小孢子培養(yǎng)中用秋水仙素預(yù)處理對(duì)比高溫預(yù)處理，獲得的小孢子再生植株加倍率達(dá) 90%，明顯高于高溫預(yù)處理獲得的小孢子植株 6%的二倍體比例。顧宏輝（ 2004）在白菜型油菜小孢子培養(yǎng)中進(jìn)行秋水仙素預(yù)處理也顯著提高了小孢子胚產(chǎn)率和再生植株的二倍體株率。因此，在游離小孢子培養(yǎng)中前期的預(yù)處理是非常必要的，它不僅提高了小孢子胚產(chǎn)率，同時(shí)采取不同的預(yù)處理方法也會(huì)影響小孢子再生植株的二倍體株率。 1 2 4 2 培養(yǎng)基 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 5 培養(yǎng)基是誘導(dǎo) 胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)，用于小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分因植物材料的不同而差異較大，但其組成應(yīng)盡可能確保維持小孢子活力，提供小孢子胚胎發(fā)生所必需的有機(jī)、無(wú)機(jī)成分，以達(dá)到高的胚誘導(dǎo)頻率。一般來(lái)說(shuō)，小孢子提取液多參考原生質(zhì)體的分離液，而培養(yǎng)基則多借鑒同種植物花藥培養(yǎng)的培養(yǎng)基（劉公社，朱自清等， 1993）。十字花科植物花藥培養(yǎng)和游離小孢子培養(yǎng)中誘導(dǎo)胚狀體生成的基本培養(yǎng)基見于報(bào)道的主要有 。 1982 年 用改良的 養(yǎng)基獲得甘藍(lán)型油菜胚狀體，使 養(yǎng)基在蕓薹屬作物中被廣泛應(yīng)用。與 5 等培養(yǎng)基相比， 主要特點(diǎn)是大量元素含量較低。余鳳群（ 1995）比較了 5、 1/2 1/2養(yǎng)基對(duì)甘藍(lán)型油菜游離小孢子的影響，發(fā)現(xiàn)在 養(yǎng)基上未產(chǎn)生胚狀體，在 1/2 1/2養(yǎng)基上形成少量胚狀體，在 養(yǎng)基上獲得大量胚狀體，由此認(rèn)為小孢子胚易于發(fā)生在離子濃度低的培養(yǎng)基中。其他添加物，如脯氨酸和谷氨酰胺對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。脯氨酸能加速小孢子分裂，促進(jìn)胚狀體發(fā)生，谷氨酰胺對(duì)胚狀體正常發(fā)育有利，兩者配合，能降低畸形胚的發(fā)生，從而提高再生植株率。 蕓薹屬 植物游離小孢子培養(yǎng)培養(yǎng)基中的糖類不僅提供了小孢子發(fā)育所需的碳源，同時(shí)也起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。不同糖類具有不同的生理效應(yīng)，在大白菜游離小孢子培養(yǎng)中，培養(yǎng)基使用的碳源主要為蔗糖， 1990)在對(duì)大白菜小孢子培養(yǎng)的研究中比較了蔗糖與麥芽糖的作用效果，設(shè)計(jì)了 7%、 10%、 13%三個(gè)濃度梯度，發(fā)現(xiàn)小孢子胚產(chǎn)率隨糖濃度增高而提高，蔗糖的出胚率高于麥芽糖的，且培養(yǎng)基中麥芽糖濃度超過(guò) 10%反而抑制小孢子的胚胎發(fā)生。大白菜小孢子培養(yǎng)選擇的最適蔗糖濃度為 10% 1991）認(rèn)為蔗糖是誘導(dǎo)分 裂所必須的，它能有效提高小孢子的胚胎發(fā)生能力。也有學(xué)者認(rèn)為高濃度的蔗糖可保持小孢子的活力，而低濃度蔗糖能促進(jìn)小孢子分裂及進(jìn)一步發(fā)育。在蕪菁培養(yǎng)中，先用 16%的蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng) 2換成蔗糖為10%培養(yǎng)基，可使培養(yǎng)效率明顯提高（陳軍等， 1995）。 一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基的外源激素是小孢子培養(yǎng)中必不可少的成分，但關(guān)于外源激素對(duì)小孢子胚胎發(fā)生和植株再生的影響還未取得一致認(rèn)識(shí)。許艷輝（ 2001）報(bào)道 6大白菜小孢子胚胎發(fā)生有一定的促進(jìn)作用，但對(duì)難成胚基因型作用不大。李巖（ 1993）發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加少量 激素（ A）有利于小白菜游離小孢子胚胎發(fā)生，其胚產(chǎn)量明顯高于不加外源激素的對(duì)照。而 1989）認(rèn)為不含激素的培養(yǎng)基與加有 6培養(yǎng)基對(duì)胚狀體誘導(dǎo)效果相同。張德雙（ 1999）在對(duì)花椰菜的研究中也認(rèn)為外源激素不是誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的必要因素，這在茄科作物的小孢子培養(yǎng)中也有體現(xiàn)。但目前仍不能排除外源激素在小孢子雄核發(fā)育過(guò)程中所起的作用。 此外鐵鹽也是培養(yǎng)基的一個(gè)重要組成部分，與胚狀體的正常發(fā)育密切相關(guān)，缺鐵將導(dǎo)致幼胚停止發(fā)育（ 1972）；但鐵鹽濃度過(guò)高也會(huì)抑制小孢子的胚胎發(fā)生 ， 992)認(rèn)為低濃度鐵鹽有利于油菜小孢子的胚胎發(fā)生，而李光濤等（ 1996）誘導(dǎo)紫菜苔小孢子胚狀體時(shí)認(rèn)為培養(yǎng)初期較高濃度鐵鹽有利于小孢子的胚胎發(fā)生，因而在實(shí)際培養(yǎng)中要根據(jù)不同材料適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基中的鐵鹽濃度。 另外，大量試驗(yàn)研究表明培養(yǎng)基中添加適量活性炭也能明顯促進(jìn)小孢子的胚胎發(fā)生（劉凡，2001），這可能是活性炭在游離小孢子的培養(yǎng)過(guò)程中吸附了小孢子釋放的有毒物質(zhì)。申書興（ 1999）研究大白菜小孢子培養(yǎng)認(rèn)為添加適量活性炭不僅提高小孢子的產(chǎn)胚率，尤其對(duì)胚胎發(fā)生難誘導(dǎo)的基因型效果顯著。此外， 992)認(rèn)為培養(yǎng)基的 也會(huì)影響胚胎發(fā)生， 右有利于白菜胚的生成。 1998）等在培養(yǎng)基中加入硝酸銀促進(jìn)了青花菜的胚胎發(fā)生。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)研究進(jìn)展 6 1 2 4 3其他影響因素 游離小孢子培養(yǎng)中，小孢子由單細(xì)胞發(fā)育為胚狀體受到諸多因素的影響。 1988）在研究甘藍(lán)型油菜的游離小孢子培養(yǎng)認(rèn)為小孢子在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)向培養(yǎng)基釋放有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)大大降低了小孢子啟動(dòng)分裂的能力，故在培養(yǎng)期間更換新鮮的培養(yǎng)基或稀釋培養(yǎng)基能促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)生；顧宏輝（ 2004）研究白菜型油菜小孢子培養(yǎng)也獲得 相同結(jié)論：小孢子培養(yǎng)中更換新鮮培養(yǎng)基比對(duì)照產(chǎn)胚量提高 。 早期的研究對(duì)小孢子培養(yǎng)的密度沒有引起足夠的重視， （ 1990）在油菜培養(yǎng)上進(jìn)行了較為深入的研究表明小孢子密度高達(dá) 40000 個(gè) /成的胚狀體數(shù)量隨密度的增加而增加，當(dāng)密度超過(guò) 100000 個(gè) /對(duì)小孢子的胚胎發(fā)生有害。一般在培養(yǎng)初期適當(dāng)稀釋小孢子濃度有利于已啟動(dòng)胚胎發(fā)生的小孢子更好的生長(zhǎng)發(fā)育。 1991)研究甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)認(rèn)為對(duì)胚胎發(fā)生能力強(qiáng)的基因型，適當(dāng)降低小孢子濃度有利于胚的發(fā)育，此外， 1988）和 1988）認(rèn)為對(duì)小孢子