I 密級 : 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué) 位 論 文 胸膜肺炎放線桿菌 素的結(jié)構(gòu)與功能分析及其突變體的研究 on on 文摘要 豬傳染性胸膜肺炎（ 是由胸膜肺炎放線桿菌（ 起的豬的 一種 呼吸道疾病。 素。 為了進一步了解該毒素的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及為拓展重組毒素蛋白的應(yīng)用奠定堅實的理論基礎(chǔ)， 本實驗以 清 7 型的一株現(xiàn)地分離株 為研究對象， 利用原核表達載體 素的結(jié)構(gòu)基因 達產(chǎn)物都以包涵體形式存在。包涵體蛋白 經(jīng)過 洗滌、變性、復(fù)性和純化 后 ，使重組蛋白在體外氧化重折疊并恢復(fù)到了天然蛋白狀態(tài)。通過未活化蛋白以及活化后蛋白的溶血試驗，證實了活化基因 產(chǎn)物對 素溶血活性是必需的。此外，本試驗還以 疫動物，分析了 A 的免疫原性以及對同型菌株 (清 7 型 )和異型菌株(清 1 型 4074 株 )攻擊的免疫保護情況。結(jié)果表明， 為抗原成分添加到滅活苗中后可以提高滅活苗的免疫效果，不但可以提供完全的同型保護，而且對異型菌的攻擊也具有一定保護作用。 自從 1986 年第一個基因缺失的基因工程疫苗在美國批準(zhǔn)上市以來，基因缺失技術(shù)已成為研究病原微生物毒力基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及構(gòu)建減毒突變株的一個有效和實用的實驗手段，目前已應(yīng)用到許多種致病微生物的研究工作中 。正是在這一時代背景下， 開展了基因缺失和分子致弱的相關(guān)研究。 雖然在這方面國外已經(jīng)取得了很多進展，但國內(nèi)關(guān)于 子致弱的研究基礎(chǔ)還很薄弱，所以在這方面作一些有益的探索將有助于縮小我國與其它國家的差距。 本試驗以清 7 型 的 因為研究對象， 把含有 后在體外構(gòu)建 C 基因的精確缺失并在缺失位點插入 建用于突變 C 基因的轉(zhuǎn)移載體 把該載體用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入 生型菌株中，使 色體上的同源片段發(fā)生同源重組，這樣，C 基因完全被 而達到將 了獲得最大的電轉(zhuǎn)化效率和重組效率，用 梭載體 受態(tài)細(xì)胞進行了預(yù)轉(zhuǎn)化。在試驗了不同組合的電轉(zhuǎn)化參數(shù)并對轉(zhuǎn)化條件進行優(yōu)化后 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電轉(zhuǎn)化參數(shù)為：電壓 2500v、電阻 400、電容 25f 、轉(zhuǎn)化體系 200l、脈沖長度達 右并進行兩次脈沖時，可使 得最大轉(zhuǎn)化效 率，此時的轉(zhuǎn)化子數(shù)為 138。利用 清 7 型 獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目明顯低于國外報道的同型菌株的轉(zhuǎn)化子數(shù)。由此我們得出結(jié)論認(rèn)為， 清 7型 關(guān)鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌， 素，結(jié)構(gòu)，功能， 突變體 is a PP is In to be by a 25-4 PP , to of px we A is to C. be of be by of A be of C is to be in to of A, we A by 4074). A is a it be It by by to be 986, of a in of of of it is a to an to of it in a of by it is or no it A on do to on PP a CR in by to PP on on be As a be on In to we PP of of we of by we PP is a to of to 錄 第一章 引 言 . 1 1 . 1 . 1 . 5 . 6 . 7 2 . 8 穿梭載體 . 9 自殺載體 . 10 . 11 本研究的主要內(nèi)容和意義 . 11 第二章 素的結(jié)構(gòu)與功能分析 . 13 1 材料和方法 . 13 菌株和質(zhì)粒 . 13 試劑及儀器 . 14 . 14 . 15 . 16 的制備、洗滌和溶解 . 16 . 16 . 17 活化及未活 化 . 18 . 18 素的動物實驗 . 18 2 結(jié)果 . 19 . 19 . 32 . 33 . 34 . 35 活 化及未活化 . 35 . 36 . 36 . 37 3 討論 . 41 . 41 溶血活性的影響 . 44 V . 46 . 48 第三章 分子致弱 . 50 1 材料和方法 . 50 株和質(zhì)粒 . 50 試劑及儀器 . 50 . 51 移重組質(zhì)粒的構(gòu)建 . 51 備及純化 . 53 . 54 電轉(zhuǎn)化 . 54 . 57 2 結(jié)果 . 59 . 59 . 59 移重組質(zhì)粒的構(gòu)建 . 60 梭載體 預(yù)轉(zhuǎn)化 . 61 . 63 3 討論 . 64 為什么要插入 . 64 影響同源重組效率的因素 . 64 影響電轉(zhuǎn)化效率的因素 . 66 沒有篩選到突變株的可能原因 . 71 今后解決辦 法 . 73 第四章 結(jié)論 . 75 參考文獻 . 76 致 謝 . 84 作者簡歷 . 85 附 圖 .國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引 言 1 第一章 引 言 1 素 豬傳染性胸膜肺炎（ 是由胸膜肺炎放線桿菌 （ 起的 一種嚴(yán)重的豬 呼吸道疾病 。其典型的病理特征是肺臟的出血、壞死以及 與 胸膜 發(fā)生 纖維素性粘連。該病是世界范圍內(nèi)的多發(fā)病、常見病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。 為 胸膜肺炎的病原菌， 一個最主要的毒力因子是其分泌到 菌 細(xì)胞外的外毒素。通過結(jié)構(gòu)基因序列分析和免疫血清學(xué)的研究，把 in 素家族， 素是一群可以 使 靶細(xì)胞膜形成孔的蛋白毒素，常見于一些病原性的 大腸桿菌的 溶血素 et 1985)，百日咳波特氏桿 菌的雙功能腺苷酸環(huán)化酶溶血素et 1988)，溶血巴氏桿菌的白細(xì)胞毒素 Lo et 1987)和放線共生放線桿菌毒素 et 1989) 以及腦膜炎奈瑟 氏 球菌的兩個鐵調(diào)控外分泌蛋白毒素 et 1994） 。 毒素，包括 et 1991； et 1993,1994； et 1994； 994)。最近又報道發(fā)現(xiàn)了一個新的 素 據(jù)稱其只在體內(nèi)表達(999)。 在前三種毒素中， 有溶血活性和細(xì)胞毒性作用， 血活性強于 有細(xì)胞毒性作用。沒有任何一種血清型 同時產(chǎn)生這三種 多數(shù)只產(chǎn)生兩種，如血清型 1、 5、 9、 11 產(chǎn)生 血清型 2、 3、 4、 6、 8產(chǎn)生 數(shù)血清型 菌 只產(chǎn)生一種 素，如血清型 10 只產(chǎn)生 清型 7、12 只產(chǎn)生 然有證據(jù)顯示某些血清型 菌 的毒力要強于其它血清型，但所有血清型 可以產(chǎn)生相同的疾病，這些差別至少在某種程度上與產(chǎn)生不同組合的 素有關(guān)，例如毒力最強的血清型既可以產(chǎn)生 可以產(chǎn)生 正因為毒素至關(guān)重要， 素的研究成為世界學(xué)者關(guān)注的重點。 素的分子結(jié)構(gòu) 如果要產(chǎn)生和分泌具有 生物活性的 素，需要相鄰的按一定順序排列的四個基因四個基因位于同一個操縱子內(nèi)。 因編碼毒素的結(jié)構(gòu)蛋白， 因編碼活化蛋白，其作用類似乙酰轉(zhuǎn)移酶，參與毒素 A 翻譯后的修飾，使之具有生物學(xué)活性。 型分泌功能的膜相關(guān)蛋白。另外還有一個 因位于操縱子中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引 言 2 之外，主要負(fù)責(zé) 素從細(xì)菌細(xì)胞的輸出。 素的不同成員具有明顯的氨基酸同源性和共同的結(jié)構(gòu)特征： N 端疏水結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé) 在靶細(xì)胞膜上 形成 孔道 和跨膜區(qū)， C 端有 一連串九肽序列 (復(fù)區(qū)，富含甘氨酸（ 天門冬氨酸（ 個結(jié)構(gòu)域在不同的 素中串連重復(fù) 8 26 次。甘氨酸豐富的重復(fù)序列在其它 素中已被證實對高效結(jié)合 很重要的，在保證最大溶血活性所需要的平方面具有重要作用。在 缺失這樣的重復(fù)序列可以導(dǎo)致結(jié)合能力下降以及溶血活性的喪失，但其溶血活性可以通過添加相對高濃度的 得以部分恢復(fù)。所以可以據(jù)此推斷該結(jié)構(gòu)域 與 合，是 素發(fā)揮溶血活性所必需的。 C 端還有一個結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)結(jié)合 泌信號，在 N 端和 C 端之間，是強親和毒素的活性位點，在 素中高度保守。 一種強溶血 活性和 強細(xì)胞毒 性 的 蛋白， 分子量為 105原來的 、 5、 9、 10和 11以及 et 1994)。 它對肺泡巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞具有很強的細(xì)胞毒性作用。 縱子包含四個基因：活化基因 構(gòu)毒素基因 兩個分泌必需基因 些基因以前在血清 型 1 中分別命名為 在血清 9 型中稱為 個分泌必需基因 別與 對應(yīng)。有證據(jù)顯示， 合成受培養(yǎng)基中游離的 度的調(diào)節(jié)，在 度高的培養(yǎng)基中，以 主要轉(zhuǎn)錄本的 縱子的數(shù)量顯著高于度低的培養(yǎng)基，總 以 探針的雜交結(jié)果顯示，前者 雜交強度比后者高 10 倍。與此相比，不論有否 雜交強度都是一致的。 這種調(diào)節(jié)作用是通過改變 轉(zhuǎn)錄水平以及 穩(wěn)定性來實現(xiàn)的。在 間有不依賴 因子的轉(zhuǎn)錄終止信號，由一個 19 5干環(huán)結(jié)構(gòu)以及富含 U 的延伸序列組成。該轉(zhuǎn)錄信號負(fù)責(zé)終止 一個短的轉(zhuǎn)錄本，只包含 導(dǎo)，大小為 主要地位；另外一個終止信號位于 止密碼子下游 106， 含有一個24 4干環(huán)結(jié)構(gòu)，可能是整個 縱子的轉(zhuǎn)錄終止信號，轉(zhuǎn)錄本大小為 含整個操縱子 由 導(dǎo)。血清型 2、 4、 6、 7、 8、 12 沒有 此這些血清型不能產(chǎn)生 反，這些血清型擁有一個截短的 縱子，包含 結(jié)構(gòu)基因 3末端。這個不完整的 縱子可能是通過缺失 大部分 形成的。血清 3 型參考株缺少整個 操縱子，所以不能產(chǎn)生和分泌 過對結(jié)構(gòu)基因 實 大腸桿菌 有最高的同源性，其次是 源性最高的區(qū)域為三個疏水區(qū)以及富含甘氨酸的重復(fù)區(qū)，這兩個區(qū)域都是 素的典型特征。有趣的是，盡管先前曾在 用 使 以分泌，但這兩個分子的 C 末端的同源性卻較?。ㄔ谄渌?素中，結(jié)構(gòu)基因的 3端負(fù)責(zé)編碼分泌信號）。 照不同 素的活化基因進行比較，也得到了類似結(jié)果。有一種有趣的現(xiàn)象應(yīng)值得 我們注意，所有 清型的參考菌株中都不會同時含有 因。不同菌種間分泌蛋白 B 和 D 的同源性顯著高于活化蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，這在 素中是很典型的。 C 末端富含 13 個甘氨酸重復(fù)序列，可以高效 結(jié)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引 言 3 合 所以其溶血活性不需很高濃度的 性 以及弱細(xì)胞毒 性 的蛋白，即原來的 子量為 103過單克隆抗體證實，除血清型 10 以外，所有血清型 的 能產(chǎn)生這種毒素， 能產(chǎn)生此毒素 （ et 1989; et 。根據(jù) 明從血清 5 型首先克隆出編碼 化蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的基因，對它們進行了測序并分別命名為 序列與血清 9型的 來證實 同一種蛋白。 縱子僅包含活化基因 結(jié)構(gòu)蛋白基因 有分泌蛋白基因 兩個分泌蛋白基因很可能在進化過程中被刪 除掉，因為在 操縱子中保留有 部分 3末端以及完整的 于與 度同源以及功能相近，所以最終被刪除掉。血清 3 型參考株缺少整個 操縱子，沒有 以與其它血清型相比，分泌的 通過對 列進行分析， 推測 白 的 分子量為 C 末端含有 8 個富含甘氨酸的重復(fù)序列，也許是因為 甘氨酸的重復(fù)數(shù)較少，所以需要高濃度的 才能達到最 大溶血活性。與 比， 表達不受培養(yǎng)基中 調(diào)節(jié)。從血清7 型克隆的 因，最初分別命名為 過 列分析，證實它們與血清 5 型和 9 型的 因具有很高的同源性，說明 因在各個血清型中 都 高度保守。 雖沒有溶血活性，卻有很強的細(xì)胞毒性 (et 1991)，以前被稱作胸膜毒素分子量為 120最開始稱為 通 過在大腸桿菌中克隆和表達 結(jié)構(gòu)蛋白基因 ，發(fā)現(xiàn)它存在于血清型 2、 3、 4、 6 和 8 參考菌株中。在以上血清型中，可以找到它的一個完整的操縱子，包括：活化基因 構(gòu)基因 兩個分泌基因 前它們分別被命名為 在己從血清 8 型參考株中獲得了 因的 列。 氨基酸序列表明，其具有典型的 素特征，在蛋白 N 末端有 3 個疏水區(qū)，在 C 末端部分有 13 個富含甘氨酸的重復(fù)區(qū)。 雖然沒有溶血活性，但與 樣，都具有協(xié)同溶血活性，即性（ et 1991; 1992; et 1994; et 1995）。 是近年來才發(fā)現(xiàn)的 一種 素。 人于 1997 年在 清 1 型菌株 似于腦膜炎奈瑟球菌 因的序列 ， 表明 存在第四種 素基因的可能性。之后， 研究人員分別從 清 1 型 和 3 型 中克中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引 言 4 隆了整個毒素基因并進行了測序和表達，并對表達的產(chǎn)物進行了功能分析，他們將該毒素命名為 et 1999）。 血清 1 型的 的結(jié)構(gòu)蛋白命名為 血清 3 型的結(jié)構(gòu)蛋白命名為 805 個氨基酸，分子量為 202論等電點為 有高度的 同源性，中間的 300 個氨基酸的同源性最高。正如 碼 74它的大小與 游的不明功能的 似，但卻與它沒有高的同源性。 碼157 個氨基酸，分子量為 論等電點為 報道的已知蛋白沒有任何相似性，包括 質(zhì)蛋白， 因通常位于 素結(jié)構(gòu)基因的上游。但 佛與 于可見的溶血性和協(xié)同溶血表型是必需的。另外， 在 上游，有 105片斷，與經(jīng)典的 啟動子序列具有一定的同源性。 是在 末端有一個 825缺失。 522 個氨基酸，分子量為 170 理論等電點為 前 3/4 部分除了 11個氨基酸的差別外，其它部分基本相同，在 100 位氨基酸和 600 位氨基酸之間，是強的疏水區(qū)域。必須指出的是， （ , 與 導(dǎo)活化的 et 1994）十分相似。 素蛋白分子的典型結(jié)構(gòu)特征，包括 基化作用位點，以及 C 末端結(jié)合 富含甘氨酸的九肽 重復(fù) 序列。 末端部分含有 24 個富含甘氨酸的九肽重復(fù)序列，在 4 個，兩者的組成是相似的，只是 1146 1428 位氨基酸在 之以短肽 A C 末端的結(jié)構(gòu)是不 同尋常的，除了典型的九肽重復(fù)外，未知作用的 鮮明序列也被發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域重復(fù)，并且與九肽重復(fù)一起形成一個模塊結(jié)構(gòu)。 當(dāng) A 的 全部基因序列或 N 末端以及 C 末端序列與 體連接后在 進行表達時，獲得的 和 的部分肽段的產(chǎn)量顯著高于表達全部序列所產(chǎn)生的完整的 化的 溶液在 4 以及 保存時是很穩(wěn)定的，而 以及完整的 A 則存在著降解現(xiàn)象。當(dāng) C 末端帶有 10簽 的 起在 誘導(dǎo)表達時，它所產(chǎn)生的重組蛋白表現(xiàn)出微弱的溶血活性，以及類似于金黃色葡萄球菌鞘磷脂酶（ 的協(xié)同溶血作用（ 在這方面與 素最為接近。這些活性需要另外一個基因存在，即 已被證實位于 A 基因之前，與 A 基因協(xié)同翻譯。重組 白的溶血活性僅出現(xiàn)于生長細(xì)胞下面，即把菌落從血平板上移開后才能看到溶血現(xiàn)象，而 用也只出現(xiàn)在生長細(xì)胞周圍相對狹窄的區(qū)域內(nèi)。這兩個事實可能有四方面的原因：（ 1）歸因于在 A 分泌活性的缺乏 ，（ 2）歸因于額外 基的存在，（ 3）歸因于這個大蛋白低的擴散能力，或者說（ 4）歸因于以上諸因素的某些共同作用。當(dāng) 分別表達時，既沒有發(fā)現(xiàn) 表達的 去了溶血活性和 性，可能是因為在苛刻的純化條件下（經(jīng)過 6M 的鹽酸胍處理），使蛋白發(fā)生了變性。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引 言 5 素的致病機制 致肺炎的發(fā)病機理的研究始于二十世紀(jì)六十年代早期。 致的肺炎損傷的宏觀表現(xiàn)是 ，肺臟表面有許多大小不等的炎性區(qū)域、出血和壞死。在疾病的早期階段，炎癥反應(yīng)的特征是出血、中性 粒 細(xì)胞浸潤、 漿液性和 纖維素性滲出；巨噬細(xì)胞浸潤以及明顯的纖維素性變性只在疾病的晚期階段出現(xiàn)。在感染的前幾個小時，纖維蛋白性滲出、炎性細(xì)胞浸潤以及出血導(dǎo)致肺泡間隙增厚。肺組織的壞死以及纖維樣胸膜粘連是急性反應(yīng)的后繼表現(xiàn)。早期的肺水腫、壞死和微管栓塞與中性細(xì)胞的活化有關(guān)。在 個小時內(nèi)，血小板在毛細(xì)血管凝集并黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上，中性細(xì)胞在肺泡間隔內(nèi)浸潤，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹。在壞死區(qū)附近，巨噬細(xì)胞增大且數(shù)量顯著增 加，巨噬細(xì)胞攝食中性細(xì)胞、血小板以及在肺血管內(nèi)循環(huán)的血纖蛋白。在肺炎病灶區(qū)，肺泡和血管內(nèi)的巨噬細(xì)胞都是很豐富的。 感染后存活的動物表現(xiàn)為損傷的完全消退或廣泛的、局部的纖維樣變性或炎性區(qū)肺組織的液化壞死。 大量研究表明 ， 肺炎損傷主要是 菌毒素的作用。用超聲 波 處理的細(xì)菌培養(yǎng)物和細(xì)菌 培養(yǎng) 上清液接種動物能夠?qū)е屡c自然感染相似的病變，這一結(jié)果強有力地支持了上述觀點。致病性細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素會導(dǎo)致宿主細(xì)胞和組織的損傷或破壞其防御機制，屬于細(xì)胞孔形成蛋白家族的外毒素 素是許多引起人和動物疾病的革蘭氏陰性菌重要的毒 力因子。 素一般具有細(xì)胞特異和種特異的溶血性、白細(xì)胞毒性和白細(xì)胞刺激等作用。 先入侵機體的第一道防線，高濃度的 透破壞細(xì)胞質(zhì)膜，形成孔道，改變 了 膜通透性， 使 細(xì)胞外的 入 和細(xì)胞內(nèi)K+流失，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失衡導(dǎo)致細(xì)胞裂解。 、 脂質(zhì)雙層膜上形成孔道的能力是不同的。 和 的孔道形成活性相似，也就是說在相同的毒素濃度下形成的孔道數(shù)量相當(dāng)，然而在相同的條件下， 成的單個孔道的傳導(dǎo)性卻顯著低于 ； 成的單孔道傳導(dǎo)性與 相似，但其孔道形成活性卻至少比 低 10倍。以上結(jié)果顯示，在這三種毒素中， 與 象，這與兩者的 列高度同源以及對綿羊紅細(xì)胞的溶血能力相似是一致的；而且，兩者形成的單孔道的直徑也相似，都大約為 小一些，為 三種 有很強的細(xì)胞毒性，卻沒有絲毫溶血活性，盡管 單孔道傳導(dǎo)性比 5倍，但兩者相同 的孔道形成活性應(yīng)足以使紅細(xì)胞膜穿透性增加從而破裂溶解。所以，可以推斷，對于紅細(xì)胞來說，這三種 且這種影響更為強烈，以至于在沒有鞘磷脂酶或磷酸脂酶等活化底物協(xié)同作用的情況下， 成的孔道并不能導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解。 賴性。 合重復(fù)區(qū)都是溶細(xì)胞所必需的。雖然 素可以溶解紅細(xì)胞，但它們所具有的白細(xì)胞調(diào)節(jié)活性在致病性中更為重要。微量的 細(xì)胞脫顆粒，稍大量的 素能夠殺死白細(xì)胞，還可以使單核細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素 1（ 腫瘤壞死因子（ 加大量的 增強組胺和類花生四烯酸中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 引 言 6 的產(chǎn)生，釋放這些裂解素，破壞肺泡內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的連接，使組織損傷。另外， 素對肺泡巨噬細(xì)胞以及中性細(xì)胞的強氧化作用，還可以使其釋放氧殘基，從而表現(xiàn)出對宿主細(xì)胞的毒性作用（ et 1994）。 素的免疫原性 “第一代疫苗” 全菌體 滅活苗的免疫效果非常有限，它僅能減輕臨床 癥狀和肺炎的嚴(yán)重程度，減少死亡率，動物會出現(xiàn)亞臨床癥狀和進一步發(fā)展為慢性感染。 研究表明，用滅活苗免疫動物，至少需要兩次注射才能使動物