密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 二化螟 素受體蛋白 氨肽酶 N 和鈣粘蛋白基因的克隆及 在昆蟲細胞系的表達 (I 摘 要 二化螟 嚴重威脅我國 水稻生產(chǎn)的 重 要害蟲。 近年來，受 耕作制度和種植結(jié)構(gòu)的改變、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻品種的大面積種植 、天氣等原因 的影響 ，二化螟的發(fā)生逐年加重，而且由于 化學農(nóng)藥長期大量反復的使用， 使 其 抗藥性明顯上升 ，更加難以防治 。轉(zhuǎn) 因水稻的出現(xiàn)為防治二化螟提供了新的有效的方法 ， 但是從生物學角度來看，昆蟲對轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性是一種脅迫進化現(xiàn)象 。因此，研究 殺二化螟的機理、 二化螟 對 生 抗性 的 可能機制，可以為將來轉(zhuǎn)基因水稻 的 推廣 、 制定 抗性 治理 策 略 、延長轉(zhuǎn)基因水稻的 使用期限 等 提供 重要 的理論依據(jù) 。 本論 文研究了 二化螟 素的主要受體 氨肽酶 N（ ， 鈣粘蛋白 （ ， 利用 合 術(shù) 的 方法 得到 了 二化螟 中腸 鈣粘蛋白 基因 的 全長序列 ，并在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中成功的進行了表達 。 主要結(jié)果如下： 利用 合 術(shù)的 方法 得到了二化螟中腸 氨基氨肽酶 N 基因的全長序列 ， 同時 利用 術(shù)得到 鈣粘蛋白基因的全長序列 。 其中 數(shù)據(jù)庫比對鑒定為氨肽酶 N 基因家族的1 個成員，其基因全長 已在 記， 登錄的序列號為： 基因全長 3292碼 1075 個氨基酸， 其 C 端有一段 25 個氨基酸組成的片段 ， 具有親脂性 和跨膜特性 ； 鈣粘蛋白基因 在 錄的序列號為 ： 因全長 5148編碼 1715 個氨基酸 ，有16 個鈣粘蛋白重復 域 ，與 歐洲玉米螟等其他鱗翅目昆蟲 鈣粘蛋白具有較高的同源性 ，同源性達73%。 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)作為四大表達系統(tǒng)之一，已廣泛應用于重組蛋白的表達。該系統(tǒng)具有許多優(yōu)點，如多角體啟動子控制下的高效表達，比較完善的轉(zhuǎn)錄后加工修飾，容 易從細胞中純化，無內(nèi)毒素污染等。將 鈣粘蛋白的 基因 克隆 到 達系統(tǒng)中桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體多角體基因啟動子的下游，篩選出重組質(zhì)粒 的基因； 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 體內(nèi)進行重組，經(jīng)抗性和藍白斑篩選，獲得桿狀病毒重組載體 的基因 ； 轉(zhuǎn)染粉紋夜蛾（ 胞（ 獲得含 目的 基因的重組桿狀病毒，重組病毒感染 胞后，得到表達的蛋白。 經(jīng)過 析和 點 雜交 結(jié)果 顯示， 鈣粘蛋白 基因 在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中 得到了表達 ，且 均 為 受體蛋白。 關(guān)鍵詞 二化螟， t)， 受體 蛋白 ， 氨肽酶 N（ ）， 鈣粘蛋白 ( 桿狀病毒表達系統(tǒng) he is a on C. of of of . to it to be t a to of to is a of t in . t to of t . t in t In ( t . PN CR as PN CR PN a of by in PN PN 292 075 a 25 in of of 148 715 6 to As of in of as by of of PN or It B e+, of of of PN of ， 目 錄 第一章 引言 . 1 化螟的危害及轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)展 . 1 t 毒素的殺蟲機理 . 2 內(nèi)外 體的研究進展 . 4 肽酶 N（ . 5 粘蛋白（ . 6 性磷酸酯酶（ . 8 動蛋白 (. 8 酯 (. 8 術(shù) . 8 蟲桿狀病毒表達系統(tǒng) . 10 論文研究的目的與意義 . 12 第二章 研究內(nèi)容和技術(shù)路線 . 13 要研究內(nèi)容 . 13 隆 因序列及序列分析 . 13 胞系中的表達及功能鑒定 . 13 究的技術(shù)路線 . 13 究的技術(shù)路線 (圖 . 13 究的技術(shù)路線 (圖 . 14 第三章 因的克隆及序列分析 . 15 驗材料和方法 . 15 料和試劑 . 15 菌培養(yǎng)基 . 15 粒 提液 . 15 脂糖凝膠電泳緩沖液 . 16 要試劑 . 16 器設備 . 16 驗方法 . 17 提取 . 17 轉(zhuǎn)錄 . 17 因克隆引物設計 . 18 物的純化回收 . 19 化產(chǎn)物與 體連接 . 19 化 . 20 粒 提取 . 20 定 . 20 列測定 . 21 果與分析 . 21 因的克隆、鑒定 . 21 列結(jié)果與分析 . 23 論 . 32 第四 因的克隆及序列分析 . 33 驗材料和方法 . 33 驗方法 . 33 提取 . 33 轉(zhuǎn)錄合成 . 33 因克隆引物設計： . 33 物的純化回收 . 34 化產(chǎn)物與 體連接 . 34 化 . 34 粒 提取 . 34 定 . 34 列測定 . 34 果與分析 . 35 因的克隆、鑒定 . 35 酸序列結(jié)果與分析 . 35 論 . 49 第五章 表達及鑒定 . 50 料和試劑 . 50 料 . 50 要試劑 . 50 分儲存液配 方 . 50 驗方法 . 52 切重組和供體質(zhì)粒 . 52 收 . 52 收產(chǎn)物酶切 . 53 收 . 53 接 . 53 化 . 53 粒 提取 . 54 酶切鑒定 . 54 制作 . 54 . 55 單菌落 . 55 取重組 . 55 定 . 55 轉(zhuǎn)染 . 56 蛋白的純化 . 56 白鑒定 . 57 果與分析 . 58 組轉(zhuǎn)移載體 構(gòu)建 . 58 組桿狀病毒的鑒定 . 59 組桿狀病毒轉(zhuǎn)染 胞 . 60 因在昆蟲 胞中的表達 . 60 論 . 62 第六章 主要結(jié)論 . 63 1. 首次克隆了二化螟的 因 序列 . 63 2. 克隆了二化螟的 因序列 . 63 3. 利用桿狀病毒昆蟲表達系統(tǒng)表達 . 63 參考文獻 . 64 致 謝 . 72 作 者 簡 歷 . 73 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 芐青霉素 氨肽酶 N 狀緣膜囊 43狀病毒表達系統(tǒng) 溴 3吲哚 bD半乳糖苷 血清蛋白 云金芽胞桿菌 粘蛋白 化 乙 錠 大霉素 脂酰肌醇錨 丙基 代半乳糖苷 那霉素 堿基對 道爾頓 化硝基四氮唑蘭藍 OD 光度 酸鹽緩沖液 合酶鏈式反應 二烷基苯磺酸鈉 環(huán)素 X溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩 士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 化螟的危害及轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)展 二化螟 屬于鱗翅目 蛾科 ( 草螟 亞科( 禾草螟屬 ( 是世界性重要農(nóng)業(yè)害蟲 ，廣泛分布于亞歐大陸多個國家，在我國南方、北方各稻區(qū)都有分布。二化螟是水稻等禾本科作物鉆 蛀性害蟲，食性較雜，除危害茭白、甘蔗等作物外，更是嚴重威脅著水稻生產(chǎn)的主要害蟲 。 二化螟具有越冬場所多，轉(zhuǎn)株危害等特點，危害分蘗發(fā)棵期水稻，造成枯鞘和枯心；危害孕穗和抽穗期水稻，造成死孕穗或白穗；危害乳熟期水稻，造成蟲傷株，被害嚴重時倒伏 （ 盧代華 等 ， 2004） 。 我國稻螟為害的確切記載始于 1022 年 ， 20 世紀 50 年代中期以前 ， 以二化螟 危害 為主 ， 此后十幾年中 ， 三化螟 遍大發(fā)生 ， 70 年代 ， 我國螟害輕微 ，自 70 年代中期推廣種植雜交稻后，除華南部分稻區(qū)仍以三化螟 為害為主外，長江流域廣大稻區(qū)，二化螟 發(fā)生、危害 呈明顯上升 趨勢 ，為害逐年加重，已經(jīng)成為雜交水稻上最重要的害蟲。 1993 年 ， 二化螟急劇回升 ， 三化螟也隨之回升 ， 1996 年 兩 種稻螟大發(fā)生 ， 此后連年暴發(fā)成災目前我國螟災的主要特點是蟲口密度高、受害范圍廣、受害程度重、持續(xù)時間長、經(jīng)濟損失大 。 螟災 全國年發(fā)面積約1500 萬 防治 約 3800 萬 。 估計年防治代價約 60 億元 ， 殘蟲造成作物損失近 65億元 ， 總經(jīng)濟損失約 115 億元 。 由此可見 ， 當前稻螟已取代稻飛虱、棉鈴蟲成為影響我國國計民生的頭號害蟲 （ 盛承發(fā) 等， 2003）。 因為耕作制度和種植結(jié)構(gòu)的改變、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻品種的大面積種植 ， 以及天氣等情況的影響 ， 是 稻螟種群數(shù)量呈回升趨勢 的主要原因 ，而且 化學農(nóng)藥的長期大量反復的使用， 使 稻螟的抗藥性明顯上升 ，防治更加困難 。 同時，由于化學殺蟲劑的大量施用，不但增加水稻生產(chǎn)成本，而且 給環(huán)境帶來了負面影響， 造成了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題 ， 破壞了自然界的生態(tài)平衡，給人類的身心健康帶來了威脅， 更 嚴重阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。 蘇云金芽胞桿菌 (前被全世界廣泛應用于害蟲防治工作。殺蟲晶體蛋白 (稱內(nèi)毒素（ (黃大昉 等 ， 2001)是蘇云金芽胞桿菌的主要活性成分。 敏感昆蟲有強烈的毒性，而對高等動物和人無毒?，F(xiàn)在 翅目 鞘翅目 昆蟲，此外，研究還發(fā)現(xiàn) 膜翅目、同翅目、食毛目的多種害蟲及植物病原、線蟲、螨類和原生動物也有控制作用（ et 1998）。 由于 生的殺蟲晶體蛋白對昆蟲具有專一、高效和對人畜安全等優(yōu)點，使其相關(guān)基因成為目前應用廣泛的抗蟲基因。自 1987 年，比利時和美國的科研人員分別將 因轉(zhuǎn)入煙草和番茄以來， 國外 先后獲得了棉花、玉米、馬鈴薯、煙草、水稻、番茄等 40 多種能夠高劑量表達轉(zhuǎn)基因植物，我國也先后將 因轉(zhuǎn)入了煙草、甘藍、棉花、玉米和水稻等作物 (黃大昉 等 ， 2001)。轉(zhuǎn) 因棉花在我國于 1997 年開始商業(yè)化種植，到 目前 種植面積已 超過 400 萬公頃，占棉花總播種面積的 三分之二以上 。 目前 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的商業(yè)化種植 是 國內(nèi)外廣泛關(guān)注 、討論 的熱點問題 ， 轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的遺傳轉(zhuǎn)化、基因漂流、靶標害蟲的抗性風險、對非靶標生物和稻田節(jié)肢動物群落的影響以及 士學位論文 第一章 引言 2 殺蟲蛋白在土壤中的殘留等方面的研究 已廣泛開展。 現(xiàn)有研究表明 ， 稻對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等主要靶標害蟲具有較高的抗性水平 ， 對稻飛虱、葉蟬、捕食性天敵等非靶標生物的生長發(fā)育和稻田節(jié)肢動物群落的穩(wěn)定性無明顯影響 ， 靶標害蟲的抗性和轉(zhuǎn)基因水稻與雜草稻、野生稻之間的基因漂移風險是轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻商業(yè)化種植的主要環(huán)境安全問題 （ 韓蘭芝 等， 2006） ，但是關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻對靶標害蟲的抗性風險評估 等 問題還 很少研究 。 由于轉(zhuǎn)入的抗蟲基因在植株體內(nèi)持續(xù)表達，能有效的 、 持續(xù)較長的時間對整個植株起到保護作用，可顯著降低農(nóng)藥的用量，并且專一性很 高 ， 能與其它 防治方法一起作為害蟲綜合防治 體系的主要措施 ，具有很高的經(jīng)濟價值 （ 張少燕， 2002） 。但是這樣就 使得 昆蟲 在整個生長周期都受到 蟲蛋白的高壓選擇，存在產(chǎn)生抗性的可能 ， 直接 威脅各種 劑、 轉(zhuǎn) 因作物 的使用壽命。 自 1985 年 1985） 首次報道 了 印度谷螟 劑產(chǎn)生了抗性； （ 1990） 在田間發(fā)現(xiàn)小菜蛾 劑產(chǎn)生 了 抗性 ； 2001） 在 澳洲新南威爾士和昆士蘭州 田間抗性監(jiān)測中發(fā)現(xiàn) 棉鈴蟲 H. 能夠在 （ 2004） 報道粉紋夜蛾 溫室對 劑產(chǎn)生抗性。 而室內(nèi)篩選實驗 則表明了 有更 多種昆蟲可以對 蟲劑或 轉(zhuǎn) 因 植物 產(chǎn)生抗性，