密級(jí)： 論文編號(hào) : 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 萊克多巴胺酶聯(lián)免疫吸附法 （ 建立 I 縮略詞表 抗體 抗原 堿性磷酸酶 牛血清白蛋白 牛血清白蛋白萊克多巴胺偶聯(lián)物 s 弗氏完全佐劑 二甲基亞砜 N, N, 酶聯(lián)免疫吸附分析法 N - 13-（ 3 碳二亞胺（水溶性碳二亞胺） S 氣質(zhì)聯(lián)用 辣根過(guò)氧化物酶 高效液相色譜法 s 弗氏不完全佐劑 免疫球蛋白 G 免疫親和層析法 鑰孔銅藍(lán)蛋白 鑰孔銅藍(lán)蛋白萊克多巴胺偶聯(lián)物 液相層析法 S 液質(zhì)聯(lián)用 M 摩爾 /升 質(zhì)譜法 核磁共振波譜 鄰苯二胺 光密度值 磷酸鹽緩沖液 酶標(biāo)板洗滌液 聚乙二醇 萊克多巴胺 3,3,5,5 四甲基聯(lián)苯胺 要 2 腎上腺素受體激動(dòng)劑作為藥物治療哮喘已經(jīng)有 30 年了。不幸的是這類藥物被非法用來(lái)作為家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑，用以改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在脂肪和肌肉之間的重分配，增加瘦肉。這種非法應(yīng)用對(duì) 食用殘留有此類藥物畜產(chǎn)品的消費(fèi)者產(chǎn)生了毒害作用。萊克多巴胺是 2 腎上腺素受體激動(dòng)劑家族中的一員，除了美國(guó)等少數(shù)國(guó)家允許其在合理的范圍內(nèi)作為豬飼料添加劑使用外 ,大多數(shù)國(guó)家（如歐盟和我國(guó)）都禁止其作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用 。然而，在我國(guó)，受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，許多不法企業(yè)和生產(chǎn)廠商利用此藥物的危害還沒(méi)有受到人們重視之際，進(jìn)行非法添加，這給人民的身體健康和生命安全造成潛在的危害。因此，必須建立快速、靈敏、有效的檢測(cè)方法。 目前，萊克多巴胺的檢測(cè)方法主要有：色譜法，毛細(xì)管電泳法，免疫傳感器法， 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ 。由于色譜法、毛細(xì)管電泳法所需的儀器設(shè)備昂貴，樣品前處理復(fù)雜，一次檢測(cè)樣品量少，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不易普及等缺點(diǎn)，因而，只作為實(shí)驗(yàn)室的確證方法。 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ 克服了以上缺點(diǎn)，作為快速篩選方法 ,得到廣泛的應(yīng)用。目前此種方法在國(guó)外已有報(bào)道，并且已有商品試劑盒出售，但價(jià)格昂貴。我國(guó)還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。為了改變國(guó)外在此方面的壟斷，降低檢測(cè)成本，必須建立有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，因而在 948項(xiàng)目的資助下，本實(shí)驗(yàn)旨在建立萊克多巴胺 法。 萊克多巴胺分子量?jī)H為 340，屬小分子半抗原（ 本身 沒(méi)有免疫原性，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才成為完全抗原或包被抗原，載體蛋白質(zhì)一般用 本論文用多元酸酐法和混合酸酐法相結(jié)合將鹽酸萊克多巴胺與載體蛋白偶聯(lián)合成了人工抗原。偶聯(lián)分兩步：第一步用戊二酸酐活化萊克多巴胺成萊克多巴胺 二步用混合酸酐法將其與 聯(lián)，通過(guò)控制載體蛋白的濃度，合成了不同偶聯(lián)比的免疫原和包被抗原。經(jīng)核磁共振法和紫外吸收法鑒定，偶聯(lián)成功，用紫外吸收法測(cè)定了偶聯(lián)比。用免疫原免疫兔子獲得了多克隆抗體，間接 測(cè)效價(jià)，以兩倍的陰性血 清 的陽(yáng)性血清的稀釋度為效價(jià)，達(dá)到 6000 以上。間接抑制 測(cè)抗血清的特異性，其 0ng/克侖特羅，沙丁胺醇，特布他林無(wú)交叉反應(yīng)。 制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線。 間接抑制 測(cè)限為 0.9 ng/性范圍為 25 ng/收率為 114.%，變異系數(shù)為 直接競(jìng)爭(zhēng) 測(cè)限為 1 ng/性范圍為1 17.5 ng/收率為 變異系數(shù)為 對(duì) 量做了評(píng)價(jià)，符合檢測(cè)要求。 與國(guó)外產(chǎn)品有差距，需進(jìn)一步改善。 文中對(duì)抗原合成影響因素，特異性響因素進(jìn)行了較為詳細(xì)的討論，并受育種學(xué)中奶牛體型參數(shù)與產(chǎn)奶相關(guān)性中得到啟發(fā)，提出了免疫動(dòng)物體型參數(shù)與免疫反應(yīng)性的相關(guān)性設(shè)想。 關(guān)鍵詞： 萊克多巴胺 偶聯(lián) 半抗原 - as in 0 to of by of to of is a of - a a of u in of as as in in of in by of is a of C,C/C/MS so be is SA to In to LH to to to MR V in 0 ng/ml t of of its 14.%V% of of its V% of in . In of of of of 錄 第一章 序 言 . 1 研究背景 . 1 2. 1 半抗原免疫檢測(cè) . 3 小分子有機(jī)物半抗原免疫分析發(fā)展史 . 3 酶聯(lián)免疫吸附法（ 本原理 . 3 人工抗原偶聯(lián)方法 . 4 小分子半抗原免疫檢測(cè)影響因素 . 5 萊克多巴胺 性質(zhì) . 9 萊克多巴胺殘留檢測(cè)研究進(jìn)展 . 10 樣品前處理 . 11 萊克多巴胺色譜法檢測(cè) . 12 免疫分析法 (. 12 本研究?jī)?nèi)容、目的、意義 . 15 第二章 萊克多巴胺偶聯(lián)物制備與鑒定 . 16 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備 . 16 試劑及配制 . 16 主要儀器設(shè)備 . 17 試驗(yàn)方法 . 17 工抗原制備 . 17 萊克多巴胺與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián) . 18 萊克多巴胺與 聯(lián) . 18 工抗原偶聯(lián)鑒定與偶聯(lián)比計(jì)算 . 19 酶標(biāo)記抗原鑒定 . 20 親和層析介質(zhì) 聯(lián)鑒定 . 20 親和層析介質(zhì) 聯(lián)量 . 20 免疫鑒定 . 21 結(jié)果與分析 . 21 人工抗原偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象 . 21 人工抗原 偶聯(lián)鑒定結(jié)果與偶聯(lián)比計(jì)算 . 21 酶標(biāo)記抗原紫外鑒定 . 26 聯(lián)鑒定結(jié)果 . 26 聯(lián)量 . 26 討論 . 28 偶聯(lián)原理 . 28 偶聯(lián)鑒定 . 29 控制偶聯(lián)比 . 30 影響人工抗原偶聯(lián)的因素 . 30 酶標(biāo)抗原偶聯(lián) . 31 親和層析介質(zhì)偶聯(lián) . 32 小結(jié) . 32 V 第三章 萊克多巴胺多克隆抗體的制備 . 33 材料 . 33 試劑及配制 . 33 免疫動(dòng)物 . 34 儀器與材料 . 34 方法 . 34 兩種抗原采用常量長(zhǎng)程免疫法制備抗血清 . 34 不同偶聯(lián)比免疫原微量短程免疫法制備抗血清 . 35 結(jié)果與分析 . 36 兩種抗原采用常量長(zhǎng)程免疫法制備抗血清 . 36 不同偶聯(lián)比免疫原微量短程免疫法制備抗血清的檢測(cè) . 38 討論 . 43 原理 . 43 影響抗體特異性因素 . 43 小結(jié) . 45 第四章 萊克多巴胺 的建立 . 46 試劑配制 . 46 方法步驟 . 46 抗體提純 . 46 間接競(jìng)爭(zhēng) 的建立 . 47 直接競(jìng)爭(zhēng) 的建立 . 48 結(jié)果與分析 . 49 親和層析結(jié)果 . 49 間接競(jìng)爭(zhēng) 標(biāo)準(zhǔn)曲線 . 50 直接競(jìng)爭(zhēng) . 51 討論 . 53 間接抑制 直接競(jìng)爭(zhēng) 缺點(diǎn) 比較 . 53 免疫親和柱層析 . 54 酶標(biāo)抗原 . 54 響因素 . 54 小結(jié) . 55 第五章 萊克多巴胺競(jìng)爭(zhēng) 質(zhì)量評(píng)價(jià) . 56 材料與試劑 . 56 儀器 . 56 兩種測(cè)量方法 . 56 溶液配制 . 56 樣品預(yù)處理 . 57 添加樣品制備 . 57 方法步驟 . 57 的操作步驟 . 57 B 操作步驟 . 57 與 測(cè)定結(jié)果精密度比較 . 57 與 樣品添加回收比較 . 58 與 重復(fù)性比較 . 58 結(jié)果與分析 . 59 精密度比較 . 59 、 樣品添加回收比較 . 60 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) . 61 討論 . 61 小結(jié) . 62 結(jié) 論 . 63 參考文獻(xiàn) . 64 致 謝 . 76 作者簡(jiǎn)介 . 77 附錄： 合物的核磁共振氫譜 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序 言 1 第一章 序 言 研究背景 近 年來(lái)， 由食品引起的中毒傷亡事件屢見(jiàn)不鮮， 全球食品安全問(wèn)題已成為媒體和公眾普遍關(guān)注的首要問(wèn)題 ，引起了全世界高度重視。 飼料是動(dòng)物食品， 它不僅是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)載體，同時(shí)也是各種藥物載體。 飼料中某些非營(yíng)養(yǎng)性添加劑直接影響著動(dòng)物安全和畜產(chǎn)品質(zhì)量，并通過(guò)食物鏈進(jìn)而影響著人類健康和生命安全，許多食品安全問(wèn)題追根溯源是由飼料安全引起的。比如上世紀(jì) 80 年代末陸續(xù)發(fā)生的“瘦肉精”事件就是由于“瘦肉精”添加于飼料，殘留于動(dòng)物體內(nèi)，人食用殘留有“瘦肉精”的動(dòng)物食品而引起中毒。這曾一度引起世界人民的恐慌。從這個(gè)角度來(lái)看，飼料安全即食品安 全（楊曙明，2003）。 因此，飼料安全問(wèn)題受到了世界各國(guó)政府高度重視。 我國(guó)政府也出臺(tái)了一系列法律、法規(guī)加強(qiáng)飼料安全監(jiān)管，并著手建立飼料質(zhì)量監(jiān)測(cè)體系（甘肅省農(nóng)牧廳， 2002）。 飼料檢測(cè)也從早期單純營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)發(fā)展為營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)與安全檢測(cè)并重，甚至安全檢測(cè)有超過(guò)營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)之趨勢(shì)。近幾年，飼料安全檢測(cè)技術(shù)得到長(zhǎng)足發(fā)展，并成為飼料科學(xué)新的研究方向。飼料檢測(cè)技術(shù)集化學(xué)、物理、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、微電子學(xué)于一體，已成為多學(xué)科交叉的前沿科學(xué)。飼料安全檢測(cè)技術(shù)方興未艾，有開(kāi)辟一新領(lǐng)域之趨勢(shì)。 “瘦肉精”即克侖特羅， 2 腎上腺素受體激動(dòng)劑類藥物。此類藥物用于治療呼吸系統(tǒng)疾病已經(jīng)有 30 年了。不幸的是這類藥物被非法用來(lái)作為家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加于飼料，用以改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在脂肪和肌肉之間的重分配，增加瘦肉。由于非法應(yīng)用，食用殘留有此類藥物畜產(chǎn)品的消費(fèi)者產(chǎn)生了毒害作用。萊克多巴胺也是 2 腎上腺素受體激動(dòng)劑家族中的一員，屬違禁藥物 ，目前在我國(guó)，作為 克侖特羅的替代品 非法添加比較嚴(yán)重，這給人民的身體健康和生命安全造成潛在的危害。因此，必須盡快建立檢測(cè)方法，打擊非法應(yīng)用，保障人民健康和生命安全。 2 述 2動(dòng) 劑的結(jié)構(gòu)、作用與腎上腺素和去甲腎上腺素相似，有三個(gè)活性基團(tuán)組成：芳香環(huán)， 些基團(tuán)形成的特異性結(jié)構(gòu)構(gòu)成了與 前人工合成此類藥物有 20種之多， 分為苯胺類、苯酚類和雙苯烷胺類（ 998） 。這些藥物的作用機(jī)理是與 組織細(xì)胞如血管平滑肌、細(xì)支氣管平滑肌的 2受體結(jié)合，激活細(xì)胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶，引起細(xì)胞產(chǎn)生一系列變化，導(dǎo)致氣管、支氣管平滑肌松弛，骨骼肌收縮，血管平滑肌松弛中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 序 言 2 過(guò)敏介質(zhì)釋放減少，并增加呼吸道纖毛運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)痰液排出 (方炳虎等 1997)，因此 ，最初用來(lái)治療呼吸系統(tǒng)疾病。由于其對(duì)心肌，氣管平滑肌和血管平滑肌有上述作用，因此若過(guò)量使用，必將對(duì)人和動(dòng)物的健康產(chǎn)生影響，如心跳加快和呼吸困難等癥狀。 自上世紀(jì) 80年代初期以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)其添加于飼料中可提高 胴體瘦肉率和促進(jìn)生長(zhǎng)，因而 作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑、營(yíng)養(yǎng)重