密級 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 黃瓜重要抗病基因的分子 標(biāo)記研究及遺傳圖譜的構(gòu)建 ap of 要 黃瓜是全球普遍栽培的主要蔬菜作物，其栽培面積在我國保護(hù)地蔬菜中居首位，對保 證我國蔬菜周年均衡供應(yīng)方面具有十分重要的作用。目前黃瓜的分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)比較薄弱，這一方面給黃瓜分子遺傳的研究造成困難，另一方面也為我國在分子生物學(xué)的研究進(jìn)入世界研究前沿帶來了機(jī)遇。因此，開展黃瓜的分子育種研究具有重要的理論和應(yīng)用意義。 建立分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)系統(tǒng)并構(gòu)建飽和通用的黃瓜遺傳圖譜是開展黃瓜分子育種研究的基礎(chǔ)。黃瓜的重要經(jīng)濟(jì)性狀較多，其中抗病性尤為重要，但抗病性的鑒定在技術(shù)上較為復(fù)雜，易受環(huán)境、菌種質(zhì)量、操作水平等影響，特別是多種病害的同時鑒定，更有許多技術(shù)上的問題有待解決。因此，建立黃瓜抗病 性分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)系統(tǒng)是首選研究課題。黃瓜分子遺傳圖譜構(gòu)建的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，但是已構(gòu)建的圖譜多數(shù)是以 作圖群體的臨時圖譜，并且圖譜的飽和度均不高，采用的作圖群體和分子標(biāo)記各異，缺乏通用性和實(shí)用性。因此，采用永久作圖群體構(gòu)建飽和通用的黃瓜遺傳圖譜是當(dāng)前需要解決的問題。 本項(xiàng)研究從當(dāng)前黃瓜分子生物學(xué)研究的現(xiàn)狀、育種的需求以及我們已有的工作基礎(chǔ)出發(fā)，確定以建立黃瓜抗病性分子標(biāo)記輔助育種系統(tǒng)為切入點(diǎn)，首先開展五種主要病害抗性基因連鎖分子標(biāo)記研究；與此同時，以 體為材料構(gòu)建黃瓜分子遺傳圖譜，逐步 對重要性狀進(jìn)行基因定位，并且開始篩選用于圖譜整合的 定標(biāo)記，為最終通過圖譜整合策略，構(gòu)建高密度、通用性和實(shí)用性強(qiáng)的黃瓜栽培種分子遺傳圖譜打好基礎(chǔ)。 本項(xiàng)研究取得如下主要結(jié)果： 1. 利用黃瓜重組自交系群體和 2 個 離群體，對五種主要病害的抗性遺傳規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：黃瓜抗病材料“秋棚”對小西葫蘆黃化花葉病毒（ 番木瓜環(huán)斑病毒西瓜株系（ 西瓜花葉病毒（ 種病毒的抗性分別由一對隱性基因控制，但也存在微效基因的修飾作用，同時，三種病毒病的抗性基因存在緊密連鎖關(guān)系；抗病 材料“ 枯萎病生理小種 4 的抗性由一對顯性基因控制，對白粉病的抗性符合一對隱性主基因 s，一對顯性加強(qiáng)基因 R 和一對抑制基因 I 控制的遺傳模式。 2. 利用上述材料，對五種主要病害的分子標(biāo)記進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，并建立了抗病毒病的分子標(biāo)記輔助育種系統(tǒng)。 1) 獲得與 性基因連鎖的 記 記 及 記 12 連鎖距離 分別為 510101014 6 2) 獲得與 性基因連鎖的共顯性 記 記與 病基因連鎖的 記 連鎖距離 分別為 2 9 3) 獲得與 病基因連鎖的 記 連鎖距離 為 3 4) 獲得與枯萎病抗性基因連鎖的 記 記 和 記 連鎖距離 分別為 77 14 5) 獲得與白 粉病抗性基因連鎖的共顯性 記 連鎖距離 分別為 5 13得與白粉病感病基因連鎖的 記 記 連鎖距離 均為 7 6) 應(yīng)用上述連鎖標(biāo)記，初步建立了抗病毒病的分子標(biāo)記輔助育種系統(tǒng)。利用單個分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，三種病毒病分子標(biāo)記檢測結(jié)果與表型鑒定的符合率為 82%利用兩側(cè)標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，符合率達(dá)到 95% 3. 利用（秋棚歐洲八號）的黃瓜重組自交系為作圖群體，構(gòu)建了我國第一張黃瓜分子遺傳圖 譜。圖譜由 9 個連鎖組群組成，包含 238 個標(biāo)記，總長為 記平均間隔 是目前國內(nèi)密度最大的黃瓜栽培種永久分子遺傳圖譜。由于作圖群體為世界上應(yīng)用最廣的歐洲溫室生態(tài)型和華北露地型黃瓜的雜交后代，該圖譜具有較好的代表性，可以作為基本圖譜與其他圖譜進(jìn)行整合，構(gòu)建高密度、代表性和通用性更好的黃瓜分子遺傳圖譜。 4. 黃瓜對 種病毒的抗性基因被定位在上述遺傳圖譜的第二連鎖群上，并且簇聚在 15區(qū)間。其中， 種抗性基因在遺傳圖譜上的同時定位是國內(nèi)外首次報道。 5. 利用上述黃瓜 重組自交系群體和 2個 適于圖譜整合的錨定 記進(jìn)行了篩選，獲得了在 親本間有多態(tài)性的 物近 20 個和能夠直接用于圖譜整合的 記 3 個，但還不足以用來進(jìn)行圖譜整合，今后需要繼續(xù)尋找更多的錨定分子標(biāo)記。 關(guān)鍵詞 黃瓜，抗病性，分子標(biāo)記，遺傳圖譜 is it is in a in is us to on on of in is of in of is by so in of a of 2 is of on we to up a at to a on SR to to in My to 1. 2 I on to as a to as a to by a s, a a . 2. I to a 1) to 1010101cM 2) MV to MV 2cM 3) to 4) to 7cM 4 5) SR to cM 3 63to 6) of C1 of 2% AS of 5%3. IL of a o. 8 a 38 139 4 3 89 in a 27.5 an in it be as to to 4. 5 cM of MV 5. IL 2 of to SR 0 be in a 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 增片段長度多態(tài)性 卞青霉素 菌人工染色體 bp 基對 合分組分析法 解擴(kuò)增多態(tài)性序列 補(bǔ) cM 摩 六烷基 溴化銨 二胺四乙酸 達(dá)序列標(biāo)簽 丙基硫代 of 然比 記輔助選擇 苷酸結(jié)合位點(diǎn) 等基因系 體親本 放閱讀框 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 量性狀基因座位 R 抗病 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 病基因類似物 組自交系 S 病 異性序列擴(kuò)增 鏈核苷酸多態(tài)性 單序列重復(fù) 列標(biāo)簽位點(diǎn) 目 錄 第一章 引言 . 1 瓜主要病害抗性遺 傳規(guī)律研究進(jìn)展 . 3 瓜枯萎病抗性遺傳規(guī)律研究進(jìn)展 . 3 瓜白粉病抗性遺傳規(guī)律研究進(jìn)展 . 4 瓜病毒病抗性遺傳規(guī)律研究進(jìn)展 . 7 子標(biāo)記技術(shù)與分子標(biāo)記輔助選擇研究進(jìn)展 . 8 用分子標(biāo)記的種類、原理 . 8 子標(biāo)記輔助選擇育種研究進(jìn)展 . 11 因組圖譜與比較圖譜研究進(jìn)展 . 14 因組圖譜的種類 . 14 因組圖譜作圖的原理和基本方法 . 15 建基因組圖譜時存在的問題與解決途徑 . 16 較圖譜研究 . 17 瓜分子育種研究進(jìn)展 . 18 質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究 . 18 標(biāo)性狀的連鎖分子標(biāo)記與分子標(biāo)記輔助選擇 . 19 種純度的鑒定 . 19 子標(biāo)記遺傳圖譜的建立及基因定位 . 20 項(xiàng)研究的目的和意義 . 24 第二章 黃瓜五種主要抗病基因的連鎖分子標(biāo)記研究 . 26 料與方法 . 27 料 . 27 法 . 27 果與分析 . 35 瓜三種病毒病抗性基因簇聚性與相關(guān)分子標(biāo)記研究 . 35 黃瓜枯萎病生理小種 4抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記研究 . 52 黃瓜白粉病主效基因緊密連鎖的分子標(biāo)記研究 . 55 論 . 63 要病害抗性基因遺傳規(guī)律的探討 . 63 于 . 64 子標(biāo)記輔助選擇影響因素探討 . 66 第三章 黃瓜分子遺傳圖譜構(gòu)建與重要抗病基因定位研究 . 68 料和方法 . 68 料 . 68 法 . 69 果與分析 . 74 瓜分子遺傳圖譜的構(gòu)建 . 74 瓜主要 病毒病抗性基因的基因定位 . 80 瓜圖譜整合的錨定標(biāo)記的篩選 . 81 論 . 85 研究構(gòu)建的遺傳 圖譜與其他黃瓜遺傳圖譜的比較 . 85 2群體在構(gòu)建遺傳連鎖圖譜中的優(yōu)劣性比較 . 85 . 86 用 . 86 瓜遺傳圖譜構(gòu)建難點(diǎn)探討 . 86 全文結(jié)論 . 88 參考文獻(xiàn) . 90 致 謝 . 99 作者簡歷 . 100 圖表目錄 表 經(jīng)發(fā)表的黃瓜遺傳圖譜 . 25 表 瓜 . 37 表 黃瓜 . 41 表 黃瓜 . 42 表 子標(biāo)記檢測與田間抗感表型的符合率 . 50 表 時使用 R%） . 51 表 子標(biāo)記檢測與田間抗感表型的符合率 . 51 表 檢測與田間抗感表型的符合率 . 52 表 9032 的 . 56 表 黃瓜白粉病主效基因連鎖的 . 61 表 于圖譜分析的 . 75 表 于圖譜分析的 . 76 表 于圖譜分析的 物對堿基序列 . 76 表 建圖譜的標(biāo)記 . 77 表 種分子標(biāo)記在分子遺傳圖譜上的分布 . 79 表 洲八號和秋棚兩個親本之間具有多態(tài)性的 . 82 表 . 83 表 9032兩個親本之間具有多態(tài)性的 . 84 圖 試黃瓜 親本接種 . 35 圖 . 36 圖 體中的柱型分布 . 37 圖 瓜 . 38 圖 物 . 39 圖 物 增結(jié)果 . 39 圖 物 1的 . 41 圖 物 增結(jié)果 . 41 圖 物 . 42 圖 物 . 43 圖 物 . 43 圖 物 . 44 圖 物 . 45 圖 物 . 45 圖 洲八號和秋棚兩個親本差異片段序列比對 . 46 圖 物 . 47 圖 物 . 47 圖 物 試黃瓜雙親、 . 48 圖 三種病毒病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖 . 49 圖 萎病標(biāo)記研究中供試親本及 . 52 圖 萎病標(biāo)記研究中 感池的擴(kuò)增譜帶 . 53 圖 萎病標(biāo)記研究中 感池的擴(kuò)增譜帶 . 53 圖 物 2單株中的 擴(kuò)增結(jié)果 . 54 圖 物 2群體中的 果 . 54 圖 物 2單株的擴(kuò)增結(jié)果 . 55 圖 粉病標(biāo)記研究中供試親本及 . 57 圖 粉病標(biāo)記研究中 . 58 圖 粉病標(biāo)記研究中 感池的擴(kuò)增譜帶 . 58 圖 物 供試親本及 . 59 圖 物 供試親本及 . 60 圖 粉病標(biāo)記研究中 . 60 圖 物 2單株的擴(kuò)增結(jié)果 . 61 圖 物 . 62 圖 物 供試雙親及 . 62 圖 黃瓜白粉病抗性相關(guān)基因連鎖的分子標(biāo)記遺傳距離 . 63 圖 . 77 圖 . 78 圖 . 78 圖 棚 歐洲八號的重組自交 系遺傳圖譜 . 80 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 黃瓜（ .）在世界上廣泛栽培，中國是世界上黃瓜栽培面積最大、總產(chǎn)量最高的國家，據(jù)農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)統(tǒng)計， 2005 年我國黃瓜總播種面積為 公頃，其中保護(hù)地栽培面積達(dá) 62 萬公頃。近年來，我國黃瓜遺傳育種取得很大成績，通過常規(guī)育種已經(jīng)育成許多優(yōu)良品種在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。當(dāng)前，特別需要開展黃瓜的分子育種技術(shù)研究，使之與常規(guī)育種相結(jié)合，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)兼抗多種病害的黃瓜新種質(zhì)與品種。與美國等發(fā)達(dá)國家相 比，我國在葫蘆科瓜類作物基因組學(xué)研究水平上雖然存在一定差距，但與茄科作物、十字花科蕓薹屬蔬菜作物相比，從研究的起點(diǎn)與時間上來看仍處于同一起跑線，我國還有力爭趕上的可能。根據(jù)“有所為、有所不為”的原則，只要發(fā)揮自己的優(yōu)勢，在學(xué)習(xí)與引進(jìn)國外的研究成果的基礎(chǔ)上，我國完全有可能也有必要在葫蘆科瓜類作物的基因組學(xué)研究開展一些具有原創(chuàng)新性的研究，為我國瓜類蔬菜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供強(qiáng)有力的技術(shù)與資源保證。 分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，使黃瓜育種中的間接選擇成為可能，大大提高了遺傳分析的準(zhǔn)確性和選育的有效性，因而分子育種技術(shù)在黃 瓜的遺傳育種領(lǐng)域越來越受到重視。遺傳圖譜構(gòu)建和分子標(biāo)記輔助選擇（ 分子育種技術(shù)研究的兩個重要研究內(nèi)容。一張高密度的遺傳圖譜是進(jìn)行遺傳育種工作的前提，也為基因定位、克隆及基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究打下基礎(chǔ)。飽和的遺傳圖譜可以為育種工作者提供該物種詳細(xì)的基本資料，而重要性狀的基因定位，將使育種的目的性更強(qiáng)、效果更好。傳統(tǒng)的形態(tài)和生化方法獲得的標(biāo)記數(shù)目少，很難使遺傳圖譜精密，很難反映基因組的全部情況。目前蔬菜作物中已經(jīng)構(gòu)建了番茄、甘藍(lán)、馬鈴薯、辣椒、萵苣、胡 蘿卜、芥菜、豌豆、黃瓜、白菜、芹菜等大約 20 種蔬菜遺傳圖譜，其中番茄、馬鈴薯、甘藍(lán)等作物的圖譜已經(jīng)趨于飽和，包含上千個分子標(biāo)記。早在 1992 年， 就首次發(fā)表了番茄的高密度連鎖圖譜，此圖以 記為主并包括同工酶和形態(tài)學(xué)等遺傳標(biāo)記共1030 個，平均每 有 1 個標(biāo)記，并與經(jīng)典圖、細(xì)胞學(xué)圖作了對比，使番茄的遺傳圖譜達(dá)到一個新的水平，成為當(dāng)時高等植物中標(biāo)記最多的遺傳圖譜。迄今，番茄的遺傳圖譜已經(jīng)發(fā)展到 1668個分子標(biāo)記，并由 多種分子標(biāo)記組成。分 子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)準(zhǔn)確、快速、且不受基因型影響，因而在多基因聚合上具有獨(dú)特優(yōu)勢，成為目前研究的熱點(diǎn)（劉志文等， 2005）。目前在水稻、棉花、小麥等大田作物均有利用 術(shù)實(shí)現(xiàn)抗病性改良的報道。特別是水稻利用 術(shù)，已取得較大的育種成效，育成一批水稻新品系 (黎志康， 2005；萬建民， 2006)。然而，與水稻等大田作物相比，黃瓜乃至整個蔬菜作物分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)比較薄弱，已經(jīng)定位的蔬菜重要農(nóng)藝性狀的主效基因不是很多，可用于 基因更是有限，已經(jīng)構(gòu)建的圖譜常常采用不同的標(biāo)記技術(shù)和親本材料，致使在應(yīng)用標(biāo)記 信息進(jìn)行品種改良時常常出現(xiàn)混淆或受挫。同時可用于 于操作的 記不是很多， 析技術(shù)要求較多，成本相對較高。技術(shù)上的相對滯后，已經(jīng)成為瓜類蔬菜作物聚合多基因難的一個重要原因。因此，構(gòu)建飽和通用的遺傳圖譜并進(jìn)行重要性狀的基因定位獲得簡單實(shí)用的緊密連鎖分子標(biāo)記將是今后黃瓜分子育種工作的重點(diǎn)。 與水稻等大田作物相比，黃瓜分子標(biāo)記輔助育種研究存在不少差距，但目前隨著生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的爆炸式增長以及日新月異的分子標(biāo)記技術(shù)支持，黃瓜的基因組學(xué)研究仍取得了很大進(jìn)展。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 2 分子標(biāo)記技術(shù)已開始廣泛應(yīng)用于黃瓜遺傳圖譜的構(gòu) 建、重要性狀的基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇、種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定、種子純度與活力鑒定等黃瓜遺傳育種的諸多方面，同時還啟動了一些重要基因的克隆和分離研究 (顧興芳等， 2005)。 自上世紀(jì) 80 年代開始，世界各國學(xué)者陸續(xù)利用各種表型標(biāo)記（形狀、抗病、抗逆等標(biāo)記）、生化標(biāo)記（同工酶標(biāo)記）、分子標(biāo)記（ ），構(gòu)建了近 20張黃瓜遺傳圖譜。已有的研究表明，黃瓜是遺傳變異相對狹窄的異交作物（ et 1994；et 1990）， 栽培品種的遺傳多樣性相對較低（ et 1997； et 1996；et 1987），已構(gòu)建的黃瓜遺傳圖譜的飽和度也較低（ et 1992； et 996； et 1997； et 2000）。采用多種類型的分子標(biāo)記，增加標(biāo)記的數(shù)量以及對基于不同分離群體構(gòu)建的圖譜進(jìn)行整合集成是較大幅度提高黃瓜分子圖譜飽和度的重要途徑。對已有分子圖譜的整合將有利于與重要經(jīng)濟(jì)性狀緊密連鎖的分子標(biāo) 記鑒定，從而促進(jìn)標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助選擇方面的應(yīng)用（ et 1995）。美國 學(xué)的 驗(yàn)室在黃瓜分子圖譜的構(gòu)建和整合工作中做出了卓有成效的工作（ et 2000），他將以黃瓜栽培種和栽培種雜交為群體的所獲得的 5 個連鎖圖譜（ 1987; 1992; et 1994; 1996; 1997）整合成一個具有 134 個位點(diǎn)的連鎖圖譜，圖譜長度 431個標(biāo)記間平均間隔 時，他還將以黃瓜栽培種和野生種雜交為群體的所獲得的 5 個連鎖圖譜整合成一個具有 147 個位點(diǎn)的連鎖圖譜，圖譜長度 458個標(biāo)記間平均間隔 以往工作基礎(chǔ)上， 001)對上述群體進(jìn)行了 析，并以他們作為錨定標(biāo)記進(jìn)行圖譜整合工作。以黃瓜栽培種和栽培種雜交為群體，10 個連鎖群，包含 態(tài)學(xué)等 255 個標(biāo)記，平均標(biāo)記間隔為 雖然整合后的圖譜密度大大