密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 小麥葉片中潛伏侵染白粉菌的 f. f. I 摘 要 小麥白粉病是小麥生產(chǎn)上的主要病害之一，病害流行的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)是綜合防治的重要部分。盡 早、準(zhǔn)確地估計(jì)病害發(fā)生趨勢(shì)是有效的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的關(guān)鍵。雖然我國(guó)小麥白粉病發(fā)生規(guī)律因地區(qū)和氣候條件而異，但對(duì)越冬麥苗和越夏自生麥苗的潛育侵染程度做及時(shí)、準(zhǔn)確 的 監(jiān)測(cè)成為不同地區(qū)病害預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)中普遍存在的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而這方面的進(jìn)展受到傳統(tǒng)、落后方法的制約，如葉片或幼苗取樣培養(yǎng)的方法耽工、費(fèi)時(shí)、靈敏性差?？焖侔l(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)顯示了有效改進(jìn)流行學(xué)方法的巨大潛力。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)原理、技術(shù)和方法探討準(zhǔn)確、快速地測(cè)定小麥白粉病潛育侵染的新方法，為改進(jìn)流行學(xué)的傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。 本研究根據(jù)小麥白粉菌（ f. 糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ 列設(shè)計(jì)合成常規(guī) 物 1、 1、 1。應(yīng)用小麥其它病原真菌做參照，表明所設(shè)計(jì)的三對(duì)引物 均對(duì)小麥白粉菌有特異性，能區(qū)分小麥白粉菌和其它麥類病害。 其中 1 較 1、 1靈敏性更高，可檢測(cè)到 1粉菌 在 篩選獲得的特異性引物 1 所擴(kuò)增產(chǎn)物的序列基礎(chǔ)上， 設(shè)計(jì)合成了 外引物，并對(duì)其進(jìn)行靈敏性測(cè)定。應(yīng)用所設(shè)計(jì)的 程， 從純培養(yǎng)的病原菌中可檢 測(cè)到的最低病菌 量為 本研究建立了從小麥病葉中提取白粉菌 技術(shù)。 應(yīng)用常規(guī) 室內(nèi)用不同接種量人工接種白粉菌后在不同潛育侵染階段取樣的小麥葉片做病原菌的 定分析。用最低接種量 300個(gè)孢子 /，采用常規(guī) 用 從接種 1d 后的小麥葉片中檢測(cè)到潛伏侵染的白粉菌。 在人工接種的條件下常規(guī) 檢測(cè)相同程度的潛伏侵染至少提前 2潛育侵染早期和接種濃度低時(shí)， 常規(guī) 檢測(cè)效果上有明顯優(yōu)勢(shì)。 從北京和山東兩地的秋苗上，共選取 11 個(gè)采樣點(diǎn)對(duì)人工接種小麥白粉菌或自然侵染的葉片取樣，用常規(guī) 未顯癥葉片的檢測(cè)結(jié)果表明， 常規(guī) 定的葉片侵染率對(duì)葉片離體培養(yǎng)測(cè)得的侵染率的直線回歸預(yù)測(cè)式只在 平上顯著 （ P = 有 6 個(gè)樣點(diǎn)未測(cè)到侵染病葉。而 定的葉片侵染率與葉片離體培養(yǎng)測(cè)得的侵染率的直線回歸式極顯著 ( P = 此結(jié)果表明， 法的預(yù)測(cè)性比常規(guī) 法要好，但其預(yù)測(cè)結(jié)果比實(shí)際葉片侵染率偏高，顯示 高靈敏特性。本研究 對(duì)小麥白粉病的早期、快速 和準(zhǔn)確 的監(jiān)測(cè) 及 預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 關(guān)鍵詞 ：小麥白粉菌 ， 伏侵染，病害監(jiān)測(cè) by f. is of of as an in of to is a in in of a of is to in as of of to on or is of a to in of to a be to of of . f. on of to in by in of by 1、 1、 1) on of . f. of by of of 1/R1 a of 2/1, as NA . A CR an an on CR 1/of CR as as .1 fg by of A NA in of by on of to CR to in of 00 cm of NA in CR CR CR -3 CR a CR in of at CR to of A of to of CR to a of CR = 1 CR CR = a of CR CR in of of . f. CR a in be to of in f. 錄 第一章 引言 1 麥白粉病概述 1 麥白粉病發(fā)生、分布和危害 1 害癥狀 1 原菌形態(tài)及生物學(xué)特性 2 害侵染循環(huán)和生活史 2 物病害和病原菌的監(jiān)測(cè) 3 物病害的監(jiān)測(cè) 3 物病原菌的監(jiān)測(cè) 3 種常用分子標(biāo)記技術(shù) 4 子技術(shù)在植物病原菌檢測(cè)方面的應(yīng)用 5 原菌分子檢測(cè)的靈敏性與病害的早期監(jiān)測(cè) 6 研究?jī)?nèi)容、目的及意義 8 第二章 常規(guī) 物的設(shè)計(jì)及其特異性與靈敏性分析 9 料與方法 9 試植物材料來(lái)源和準(zhǔn)備 9 試菌株來(lái)源、收集與保存 9 試材料的 取 11 原菌的常 規(guī) 14 規(guī) 物的特異性檢 測(cè) 17 規(guī) 物靈敏性測(cè)定 17 果與分析 17 原菌 測(cè) 17 規(guī) 物特異性的檢測(cè) 18 規(guī) 物靈敏性測(cè)定 20 結(jié) 22 第三章 23 料與方法 23 物設(shè)計(jì) 23 引物的特異性分析 23 引物的靈敏性測(cè)定 24 程 24 靈敏性分析 24 果與分析 24 引物特異性分析 24 V 引物靈敏性測(cè)定 25 靈敏性測(cè)定 26 常規(guī) 敏性的比較 26 結(jié) 28 第四章 人工接種葉片的潛育侵染測(cè)定 29 料與方法 29 試植物材料和白粉菌菌株 29 試材料的準(zhǔn)備 29 工接種 29 樣 29 麥葉片基因組 提取 29 工接種的小麥葉片中的白粉菌 測(cè) 30 據(jù)分析 31 結(jié)果與分析 31 規(guī) 測(cè)小麥葉片中顯癥白粉菌 31 同侵染量未顯癥小麥葉片中白粉菌的 測(cè) 31 結(jié) 35 第五章 田間小麥葉片潛育侵染的測(cè)定 36 料與方法 36 驗(yàn)材料的獲得 36 規(guī) 測(cè) 36 據(jù)分析 36 果與分析 36 國(guó)農(nóng)科院植保所農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田小麥葉片常規(guī) 間檢測(cè) 36 東煙臺(tái)大莊頭村小麥葉片常規(guī) 間檢測(cè) 37 常規(guī) 法估計(jì)田間侵染葉片的潛育侵染率 38 結(jié) 40 第六章 結(jié)論與討論 42 論 42 論 42 進(jìn)的 提取小麥白粉菌、小麥銹菌 優(yōu)勢(shì) 42 于利用 計(jì)引物 43 43 癥時(shí)期 測(cè)與最終發(fā)病率關(guān)系 44 于 改進(jìn) 45 研究的創(chuàng)新點(diǎn)和在流行學(xué)和病害防治方面的應(yīng)用價(jià)值 46 參考文獻(xiàn) 47 附錄 52 謝 55 作者簡(jiǎn)歷 56 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引言 麥白粉病發(fā)生、分布和危害 小麥白粉病是由專性寄生真菌 f. 起的氣傳性病害。在世界各主要產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其中以歐洲的發(fā)病最為嚴(yán)重。如英國(guó) 1959 年至 1962 年之間，白粉病危害損失為 70 公斤 /公頃，奧地利 1971 年小麥產(chǎn)量損失為 5 20；美國(guó)東部各州尤其是東南部沿大西洋和墨西哥灣各州，白粉病一直是小麥生產(chǎn)上重要病害；印度、新西蘭等國(guó)家因白粉病危害小麥產(chǎn)量損失達(dá) 45。前蘇聯(lián)小麥生產(chǎn)區(qū)也常常大面積發(fā)生白粉病，危害異常嚴(yán)重（吳兆蘇， 1990）。我國(guó)小麥白粉病是由戴芳瀾先生于 1927 年首先在江蘇省發(fā)現(xiàn)。過(guò)去主要在我國(guó)西南各省 和山東沿海地區(qū)發(fā)生較重， 20 世紀(jì) 70 年代后期以來(lái)小麥白粉病日益擴(kuò)展蔓延北移，全國(guó)已有 20 多個(gè)省市發(fā)生，以西南地區(qū)和河南、湖北、江蘇、安徽等地發(fā)生較重，而且西北地區(qū)和東北遼寧等省春麥區(qū)，也日趨嚴(yán)重（何家泌等， 1998；劉萬(wàn)才等， 1998；孫黛珍等， 2004）。 1990 我國(guó)小麥白粉病發(fā)病面積達(dá) 1207 萬(wàn)公頃，占全國(guó)小麥總面積（ 3037 萬(wàn)公頃）的 39%，糧食損失達(dá) 4 億公斤 （朱建祥 1992）。 目前小麥白粉病發(fā)病面積已居小麥四大病害之首（白粉病、銹病、赤霉病、紋枯?。ㄖx皓等， 1998）。 害癥狀 小麥從幼苗至成 株各生育階段均可受白粉菌的侵害。小麥白粉病發(fā)病特點(diǎn)是先在田間出現(xiàn)發(fā)病中心，然后由發(fā)病中心向全田水平擴(kuò)展。其侵染部位主要是葉片，但嚴(yán)重時(shí)葉鞘、莖稈和穗部也可受害。早期發(fā)病的植株，看不到明顯的癥狀。隨著病情的發(fā)展，在葉片上開(kāi)始出現(xiàn)褪綠斑，而后逐漸擴(kuò)大為近圓形或橢圓形的病斑，表面覆有一層白粉狀霉層，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，病斑連成一片形成大片白色至灰色霉層。一般葉片表面比背面發(fā)生重，下部葉片比上部葉片受害重，霉層厚度可達(dá) 2 右。霉層中的白粉菌菌絲初生時(shí)為薄絲綢狀，其先產(chǎn)生病菌無(wú)性階段分生孢子，后期白粉狀霉層逐漸由灰 褐色變?yōu)辄S褐色至黑褐色的小圓粒即病菌有性階段的閉囊殼，導(dǎo)致葉片褪綠發(fā)黃乃至枯死。小麥穎殼受害時(shí)能引起枯死使麥粒不飽滿甚至腐爛，發(fā)病嚴(yán)重的病株矮而弱，不抽穗或抽出的穗短而?。ê渭颐诘龋?1998）。 原菌形態(tài)及生物學(xué)特性 白粉菌是以菌絲寄生在寄主表面，并以吸器伸入寄主表皮細(xì)胞吸取營(yíng)養(yǎng)，菌絲上垂直著生短形的分生孢子梗和分生孢子。小麥白粉菌的分生孢子成串地著生于分生孢子梗上，自頂端而下逐個(gè)成熟脫落，由氣流傳播引起再侵染。分生孢子的壽命較短，侵染力只能維持 3 4天，發(fā)病植株上的灰白色粉層狀霉層就是病菌的分生孢子及 菌絲。植株感病后期在霉層中產(chǎn)生的黑褐色小點(diǎn)，即菌絲叢上產(chǎn)生的閉囊殼為病菌的有性世代 (何家泌等， 1998)。 小麥白粉菌對(duì)濕度的適應(yīng)范圍很寬，分生孢子在相對(duì)濕度 5% 100%下均可萌發(fā)和侵染，濕度越大，萌發(fā)率越高，但在水滴中萌發(fā)率反而降低。分生孢子在 30 溫度范圍內(nèi)均可萌發(fā)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 但以 10 20 為最適宜，直射陽(yáng)光對(duì)孢子萌發(fā)有抑制作用，所以小麥植株過(guò)密，通風(fēng)透光不良或陰雨天氣等條件下病害發(fā)生最重 (郭小山等， 2006)。 害侵染循環(huán)和生活史 病菌的孢子隨氣流傳播到感病品種的植株上，遇到適宜條件即萌發(fā)長(zhǎng)出 芽管，芽管前端膨大形成附著胞，并產(chǎn)生較細(xì)的附著絲直接穿進(jìn)葉表面的角質(zhì)層，侵入表皮細(xì)胞，形成初生吸器，吸收寄主營(yíng)養(yǎng)，并向寄主體外長(zhǎng)出菌絲，隨后在菌絲叢中心產(chǎn)生分生孢子梗和分生孢子，分生孢子成熟后脫落，由氣流傳播引起再侵染，病菌在植株生長(zhǎng)后期進(jìn)行有性生殖，在菌絲叢上產(chǎn)生閉囊殼，閉囊殼成熟后在適宜條件下釋放子囊孢子侵染植株致?。▓D 1 1）。 圖 1 1 小麥白粉菌侵染過(guò)程示意圖 生芽管 ； 絲擴(kuò)展 ； 囊殼、子囊及子囊孢子。 (11989，原圖 ； 1971，原圖 ) . f. in 麥白粉菌的越夏方式有兩種 ： 一是以分生孢子在夏季氣溫較低地區(qū)（旬平均 24 以下）的自生麥苗或夏播小麥上繼續(xù)侵染繁殖，或以潛育菌絲狀態(tài)渡過(guò)夏季。如貴州的貴陽(yáng)地區(qū)、四川的雅安和川北的阿壩州、湖北的鄂西北及鄂西山區(qū)、河南 的豫北和南陽(yáng)地區(qū)、陜西中秦嶺北麓及渭北山區(qū)、甘肅天水地區(qū)等等。而在廣大的平原區(qū)，由于夏季氣溫較高，病原菌難以存活，加上大多數(shù)自生麥苗到播前已經(jīng)死亡，因此小麥白粉病菌不能在這些地區(qū)越夏。小麥白粉病另一種越夏該方式是以病殘?bào)w上的閉囊殼在低溫干燥的條件下越夏。越夏菌源成為秋苗發(fā)病的初始侵染源，使秋苗受侵發(fā)病。入冬后病菌越冬也有兩種方式，當(dāng)氣溫較高時(shí)，病菌以分生孢子形態(tài)在麥苗表面越冬；而當(dāng)氣溫較低時(shí)以菌絲體潛伏在寄主組織內(nèi)越冬。影響病菌越冬存活率低主要因素是冬季氣溫和濕度，如冬季溫度高，雨季較多或土壤濕度大，則有利 于病菌越冬。早春氣溫回升，小麥返青后，病菌開(kāi)始侵染循環(huán)過(guò)程并造成為害（何家泌等， 1998； 董金皋， 2001；劉萬(wàn)才， 1994）。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 物病害和病原菌的監(jiān)測(cè) 物病害的監(jiān)測(cè) 植物病害流行系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)（ of 對(duì)病害流行系統(tǒng)的實(shí)際狀態(tài)和變化進(jìn)行全面、持續(xù)、定性與定量的觀察、表述和記錄。病害的流行系統(tǒng)的監(jiān)測(cè)不僅要獲取某種病害發(fā)生狀態(tài)的時(shí)序數(shù)據(jù)，而且要對(duì)病害流行系統(tǒng)的各個(gè)組分和影響因素進(jìn)行觀測(cè)，包括寄主、病原物、環(huán)境和人類的耕 作栽培活動(dòng)。植保工作是對(duì)有害生物的系統(tǒng)管理。在一定防治目標(biāo)要求下，防治決策是管理的核心，預(yù)測(cè)是決策的基礎(chǔ)，實(shí)況監(jiān)測(cè)是預(yù)測(cè)和決策必不可少的依據(jù)。監(jiān)測(cè)的目的是在生產(chǎn)上為進(jìn)行有害生物的預(yù)測(cè)和防治決策提供可靠的依據(jù)，在科學(xué)研究上為有害生物發(fā)生發(fā)展規(guī)律和預(yù)測(cè)方法的研究服務(wù) (曾士邁等， 1994；肖悅巖等， 1998)。 在制定監(jiān)測(cè)的項(xiàng)目、方法和標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，首先要考慮病害預(yù)測(cè)或病害管理的具體要求。（ 1）若為了掌握病害逐年發(fā)生情況需要了解生產(chǎn)田中病害發(fā)生和危害程度以決定是否需要防治時(shí)。這類調(diào)查時(shí)間應(yīng)選在該病害防治時(shí)期或作物形成產(chǎn) 量的關(guān)鍵生育期或病害發(fā)生盛行期，調(diào)查項(xiàng)目單一，方法簡(jiǎn)便，注重大范圍普查和分類調(diào)查，不苛求精度。常以病害種類、病田率、病點(diǎn)率為代表。（ 2）若要了解病害發(fā)生的動(dòng)態(tài)規(guī)律，做好預(yù)測(cè)工作，則要堅(jiān)持定時(shí)、定點(diǎn)、定量的病害調(diào)查，強(qiáng)調(diào)數(shù)據(jù)規(guī)范性，以便長(zhǎng)期積累、比較。（ 3）若要進(jìn)行某一病害流行學(xué)研究，則需對(duì)該病害系統(tǒng)的主要組分進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這要求對(duì)病害的系統(tǒng)調(diào)查以及對(duì)有關(guān)氣象因素、栽培條件、寄主狀況進(jìn)行觀測(cè)，還要注意、對(duì)比調(diào)查和特殊項(xiàng)目的監(jiān)測(cè)（肖悅巖等， 1998）。 對(duì)植物病害的監(jiān)測(cè)，目前主要是采用人工調(diào)查病害的發(fā)生強(qiáng)度即病情， 常常調(diào)查病害發(fā)生的普遍率（ 嚴(yán)重度（ 病指（ 來(lái)代表病情的嚴(yán)重程度。 植物病原菌的數(shù)量是病害流行的一個(gè)重要驅(qū)動(dòng)變量，病原菌的侵染能力、生存力、傳播能力與病害的流行速度、流行長(zhǎng)短及分布有很重要的關(guān)系，而且病原菌與寄主基因型、生育階段、環(huán)境的互作及病原菌的遺傳影響病原菌在當(dāng)前流行季節(jié)和下一個(gè)流行季節(jié)的菌量和流行潛能（周益林等， 2004）。因此病原菌監(jiān)測(cè)工作在研究病害流行也是至關(guān)重要的。如子囊殼成熟進(jìn)度可作為小麥赤霉病 、梨黑星病等病害中短期預(yù)測(cè)的依據(jù)， 對(duì)病原菌的監(jiān)測(cè)方法視具體的病害特點(diǎn)而定?？罩墟咦用芏鹊谋O(jiān)測(cè)常用于氣傳病害，孢子捕捉方法有：凡士林玻片法，培養(yǎng)基平面玻皿法，孢子捕捉器法，還可采用定點(diǎn)置放的或車載移動(dòng)的生物捕捉法。車載移動(dòng)的生物捕捉法就常用于小麥白粉病菌等專性寄生病害的監(jiān)測(cè)。其中凡士林玻片法、培養(yǎng)基平面玻皿法經(jīng)濟(jì)且簡(jiǎn)單易行，適用于較大孢子，但易受旋風(fēng)、渦流影響，捕捉效能不高，不適于定量準(zhǔn)確度要求高的監(jiān)測(cè)工作。孢子捕捉器法，特別是移動(dòng)式孢子捕捉器具有效率高、取樣均勻、范圍大、樣本代表性高 ， 不破壞捕捉的孢子等特 點(diǎn)，用此代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工調(diào)查方法，可大大降低工作量，提高效率。對(duì)土傳病害常用土壤帶菌量來(lái)監(jiān)測(cè)病原物及其動(dòng)態(tài)，土壤中病原物定量測(cè)定分為直接計(jì)數(shù)和不能直接計(jì)數(shù)兩種方法。直接計(jì)數(shù)的如菌核、線蟲(chóng)、真菌孢子等能目測(cè)或鏡檢計(jì)數(shù)的。不能直接計(jì)數(shù)的，則需選用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行定量分離，以定量土樣培養(yǎng)出的菌落數(shù)反應(yīng)土壤中病原物的量或其發(fā)病強(qiáng)度，或者進(jìn)行生物測(cè)定，以指示植物的發(fā)病數(shù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 量反應(yīng)土壤中該病原物的多少。選擇性分離和生物測(cè)定當(dāng)方法標(biāo)準(zhǔn)化后，可以獲得可重復(fù)的可靠數(shù)據(jù)，但當(dāng)監(jiān)測(cè)的地塊很大、土樣很多時(shí)，所需的試驗(yàn)室或溫室的工作量很大 。 在病害流行學(xué)研究中，為減免病原物數(shù)量測(cè)定的繁難，常用病害數(shù)量間接估計(jì) “菌源量 ”（病原物群體數(shù)量）。這類觀測(cè)，大多是通過(guò)肉眼觀察和儀器測(cè)量獲得測(cè)量值和估計(jì)值，或通過(guò)抽樣調(diào)查和數(shù)理統(tǒng)計(jì)獲得相對(duì)可靠的代表值。但它的代表性也有很大局限性，因?yàn)槟軌驕y(cè)計(jì)的病害數(shù)量只能是以發(fā)病的，而潛育狀態(tài)的那一部分病害也許不多，也許很多，卻是無(wú)法目測(cè)的。如小麥條銹病為例，流行條件適合時(shí)，潛育量可達(dá)發(fā)病量的幾十上百倍（曾士邁等， 1994）。目前傳統(tǒng)病害和病原菌監(jiān)測(cè)的方法主要存在的問(wèn)題是工作繁瑣費(fèi)時(shí)，耗費(fèi)大量人力物力，工作量大，效率較 低 ， 且很難準(zhǔn)確測(cè)定或監(jiān)測(cè)病害處于潛伏狀態(tài)時(shí)的菌量等。而現(xiàn)代生物學(xué)方法如生化和分子生物學(xué)方法和技術(shù)能夠提供更快速、經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行的方法，可解決傳統(tǒng)方法很難解決的問(wèn)題。 種常用分子標(biāo)記技術(shù) 近十多年來(lái)，現(xiàn)代生物科學(xué)發(fā)展突飛猛進(jìn)，生物技術(shù)特別是分子標(biāo)記技術(shù)也有很大的發(fā)展，在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用也日趨成熟，被廣泛應(yīng)用于生物起源進(jìn)化、系統(tǒng)分類、物種多樣性、遺傳育種、品種鑒定、基因組作圖或基因定位、基因定位克隆等領(lǐng)域的研究（陳文炳等， 1997；傅榮昭等，1998；邱芳等， 1998；龔鵬等， 2001；陳文炳等， 2001；郭金平等， 2003）。 分子標(biāo)記是指以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。它是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)的最為理想的遺傳標(biāo)記。廣義的分子標(biāo)記技術(shù)指生物大分子水平上應(yīng)用于區(qū)別物種的標(biāo)記技術(shù)，包括 蛋白質(zhì) (包括酶類 ) 等分子水平的標(biāo)記。狹義的分子標(biāo)記技術(shù)僅指 記。 子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)大致可分為三類 : 第一類是以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，其代表性技術(shù)有 二類是以電泳技術(shù)和 術(shù)為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，其代表性技術(shù)有 ; 第三類是以 列分析為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，其代表性技術(shù)為 列分析。 以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記 是利用限制性內(nèi)切酶消化不同生物體的 子，電泳后用特異探針進(jìn)行分子雜交，通過(guò)放射性自顯影或非放射性同位素顯色技術(shù)來(lái)揭示中最具代表性的是發(fā)現(xiàn)最早和迄今應(yīng)用最廣泛的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(記。 失、重組或突變，利用限 制性內(nèi)切酶消化基因組 產(chǎn)生大小不同的泳后通過(guò) 這些大小不同的 后同特異的探針進(jìn)行雜交，最后通過(guò)放射性自顯影或其他顯色技術(shù)顯示雜交結(jié)果，從而揭示出 et 1989； et 1987）。 標(biāo)記是以重復(fù)序列為探針進(jìn)行分子雜交，由于不同基因型中的重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生多態(tài)性的分子標(biāo)記。微衛(wèi)星 (數(shù)為 2 4個(gè)）為單位多次串聯(lián)重復(fù)的用某個(gè)微衛(wèi)星 端的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，擴(kuò)增這個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星列，經(jīng)聚丙烯酰胺電泳即可顯示不同基因型個(gè)體在這個(gè) 誼等，2001）。小衛(wèi)星（ 個(gè) 11 60個(gè)核苷酸的基本序列單位重復(fù)排列而成， 其重復(fù)數(shù)從 10到 10000不等，分散或成簇分布。多態(tài)性的產(chǎn)生是由于重復(fù)單位之間的不平衡交換，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 從而產(chǎn)生不同的等位基因。（吳敏生等， 1998；危文亮等， 2000）。 以 電泳技術(shù)和 便、快速和高效等特點(diǎn)迅速成為分子生物學(xué)研究的有力工具。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 (記通常以 10堿基的寡核苷酸序列為引物，對(duì)基因組 而得到多態(tài)性圖譜作為遺傳標(biāo)記的方法(et 1990)。 是通過(guò)對(duì)多態(tài)性計(jì)一對(duì)新的引物特異地?cái)U(kuò)增一個(gè)在特定位點(diǎn)的 般在原與 5端延長(zhǎng) 14個(gè)堿基，利用兩端各 24個(gè)堿基的引物進(jìn)行特異擴(kuò)增（李志英， 2004）。擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性 (標(biāo)記系統(tǒng)是基于 原理為基因組 限制性內(nèi)切酶消化，然后連上一個(gè)接頭 (，利用兩個(gè)選擇性引物進(jìn)行 引物含有接頭和酶切位點(diǎn)序列，并且其 3端加上了 2 3 個(gè)隨機(jī)核苷酸，即：引物 = 接頭序列 + 酶切位點(diǎn)序列 + 2 3 個(gè)隨機(jī)核苷酸（ 翁躍進(jìn)， 1996）。 隨著 序技術(shù)的發(fā)展，在植物病害研究中常以核糖體 的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ 基因間隔