密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 黃瓜營養(yǎng)器官苦味和葉色 突變性狀的遺傳分析及分子標(biāo)記研究 .) 碩士研究生: 池秀蓉 指導(dǎo)教師: 顧興芳 研究員 申請學(xué)位類別: 農(nóng)學(xué)碩士 專 業(yè): 蔬菜學(xué) 研究方向: 黃瓜遺傳育種 培養(yǎng)單位: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 提交日期 2006年6月 .) u 006 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 要 黃瓜 (是葫蘆科重要的一年生作物，我國是世界上黃瓜栽培面積最廣、總產(chǎn)量最高的國家。品質(zhì)性狀是影響黃瓜經(jīng)濟(jì)效益的重要方面，深入研究黃瓜苦味等品質(zhì)性狀的遺傳規(guī)律，利用分子標(biāo)記技術(shù)篩選含有利于加快我國無苦味黃瓜品種的育種進(jìn)程；研究葉色突變性狀的遺傳規(guī)律，采用分子標(biāo)記技術(shù)，可將其作為指示性標(biāo)記用于種子純度檢測等育種實(shí)際工作。本試驗(yàn)以含有營養(yǎng)器官不苦基因色突變基因色葉片基因行營養(yǎng)器官苦味性狀、葉色突變性狀的遺傳規(guī)律及分子標(biāo)記方面的研究，結(jié)果如下： 1、通過對田間栽培的親本、2及實(shí)苦味等性狀的詳細(xì)調(diào)查，計(jì)算分析后發(fā)現(xiàn)，回交后代為1:1，合狀態(tài)2、分析親本、2及1均為中間色，離比例接近1:1；離比例接近1:1。間色及黃色，分離比例接近1:2:1，經(jīng)適合性測驗(yàn)差異不顯著，表明葉色突變性狀為細(xì)胞核遺傳，由隱性基因控制，并且綠色對黃色為不完全顯性。 3、兩對基因在、u、代獨(dú)立分離。 4、采用次獲得一個(gè)與黃瓜營養(yǎng)器官無苦味成功地將其轉(zhuǎn)化為148株重組自交系單株驗(yàn)證，兩個(gè)標(biāo)記的檢測準(zhǔn)確率分別達(dá)到91% 5、通過實(shí)驗(yàn)首次獲得一個(gè)與葉色突變性狀緊密連鎖的過148株重組自交系單株驗(yàn)證，91株葉色正常的單株中，該標(biāo)記可作為一種指示性標(biāo)記，與雜種鑒定等實(shí)際育種工作結(jié)合。 關(guān)鍵詞：黃瓜(.),營養(yǎng)器官苦味,葉色突變,遺傳分析,分子標(biāo)記 .) is an to is of in is of In to of as a to 1we to of of to bi In 110GT 3828 as on in as By 1, i bi a :1, a :1, bi is i bi By 1, is by of is to By no bi , u , D, Tu 56 to NA NA NA a 150 bp in G+NA of 2be in .0 to G/to a to of 2a 7bp in a of a to in 48 SA to to to -1 G/48 0 -1 is a to 1 .), 錄第一章 文獻(xiàn)綜述 味研究概況. 1 味素的化學(xué)組成、分布與鑒定. 1 瓜營養(yǎng)器官苦味基因的遺傳研究. 2 養(yǎng)器官苦味性狀與病蟲害. 2 養(yǎng)器官苦味基因在連鎖圖中的定位及與其他性狀的連鎖關(guān)系. 3 色突變性狀的研究概況. 3 色突變的遺傳及分子機(jī)制. 3 瓜葉色突變性狀的研究進(jìn)展. 4 子標(biāo)記技術(shù). 5 . 5 . 7 離群體混合分析法. 8 . 8 傳作圖. 8 因定位. 9 子輔助育種. 9 傳多樣性及分類進(jìn)化學(xué)研究. 10 瓜分子生物學(xué)研究現(xiàn)狀. 10 質(zhì)資源方面的研究. 10 速尋找與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記. 11 子標(biāo)記輔助育種. 11 傳作圖. 11 瓜基因工程研究進(jìn)展. 12 實(shí)驗(yàn)的研究目的、意義及主要內(nèi)容. 13 第二章 遺傳規(guī)律分析 料. 14 傳分析方法. 14 養(yǎng)器官苦味性狀的遺傳規(guī)律分析. 15 色突變性狀的遺傳規(guī)律分析. 15 料中各性狀之間的遺傳規(guī)律分析. 16 結(jié). 18 第三章 黃瓜營養(yǎng)器官無苦味V 料和方法. 19 . 19 . 19 子標(biāo)記的篩選及檢測. 21 化及測序. 21 . 22 果與分析. 23 因組. 23 記的初步篩選. 24 記的獲得. 25 味標(biāo)記化. 25 隆. 26 組質(zhì)粒的. 27 . 28 . 28 . 28 結(jié). 29 第四章 與葉色突變基因料與方法. 30 果與分析. 30 記的初步篩選. 30 記的驗(yàn)證. 31 葉色突變性狀連鎖的. 32 結(jié). 32 第五章 討論與結(jié)論 論. 33 論. 34 參考文獻(xiàn) 35 附錄 42 致謝 51 作者簡歷 52 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 第一章 文獻(xiàn)綜述 黃瓜(.)是葫蘆科黃瓜屬一年生攀緣性草本植物，別名王瓜、胡瓜，起源于喜馬拉雅山南麓的印度北部和錫金等地。我國黃河流域早在二千年前就開始栽培黃瓜(周長久等，1996)。黃瓜供應(yīng)期長，類型和品種十分豐富，在我國蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)上占有重要的地位。我國是世界上黃瓜生產(chǎn)面積最大、總產(chǎn)量最高的國家。據(jù)統(tǒng)計(jì)2004年，全國蔬菜面積的10左右，其中45左右為設(shè)施栽培。主要的種植地區(qū)為山東、河南、河北、遼寧、甘肅、江蘇、廣東、廣西等省。 自20世紀(jì)30年代，斷有新的黃瓜基因被發(fā)現(xiàn)或鑒定。在九十年代之前，主要是形態(tài)學(xué)基因的研究，研究者對其特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，并將部分基因定位在不同的連鎖組中(990)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，大量的基因通過分子標(biāo)記技術(shù)鑒定，其中包括數(shù)量性狀座位(新的基因或基因位點(diǎn)之間以及它們與形態(tài)學(xué)基因之間的連鎖關(guān)系的研究有很大進(jìn)展。對黃瓜苦味性狀的研究表明含有純合前未見關(guān)于色突變性狀作為一種指示性標(biāo)記在遺傳育種中具有重要的利用價(jià)值，而黃瓜葉色突變性狀的研究主要集中在生理學(xué)、遺傳學(xué)方面。 味研究概況 味素的化學(xué)組成、分布與鑒定 瓜類植物的苦味是由一類稱為苦味素或葫蘆素(物質(zhì)引起，這類物質(zhì)是緊密相關(guān)的四輪列三萜類化合物，多以配糖體或葡萄糖甙的形式存在于植物體內(nèi)，依分子式的不同，分為苦味素A、B、C、959；981)。黃瓜植株中的苦味素主要為的分子式為為瓜幼苗根中含苦味素B，未展開的子葉中含全展開的子葉及植株中只有苦味素C。 苦味素的含量隨著植株的生長而增加，葉片葉位越高苦味素含量越多?？嗯c不苦的葉片中氮含量不同，苦味葉片的含氮量和氨基酸中的氮含量要高于不苦的葉片，硝酸鹽的含量要低于不苦的葉片。植株上部的葉片比下部的苦，果實(shí)和葉片苦味的程度取決于總的含氮量及氨基酸中的含氮量。在苦果果皮中氨態(tài)研究指出子葉中苦味素的含量至葉片完全展開是穩(wěn)定增長的。mg/981)，苦味素在果實(shí)中的含量則隨著幼果的成熟而逐漸減少(997)。 黃瓜苦味素的感官鑒定有子葉期檢測法 (959)，化學(xué)鑒定方法包括：色層和廣譜層析法、薄層色譜層析法(高壓液相色譜法(981；981)等，這些方法都有其局限性。人類的味覺對苦味很敏感，當(dāng)苦味素含量低于10僅需鑒定是否有苦味，植株數(shù)量又不多，并有足夠的品嘗者，采用感官品嘗的方法效率較高。因此，感官品嘗一直是育種家用來判斷苦味素存在與否的主要方法，需注意的是幼苗稍大時(shí)進(jìn)行檢測最好，可確保準(zhǔn)確性。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 2 瓜營養(yǎng)器官苦味基因的遺傳研究 已報(bào)道的控制黃瓜營養(yǎng)器官的苦味基因有Bi/現(xiàn)無苦味黃瓜突變體之前的所有黃瓜材料都含苦味素，為尋找完全無苦味的黃瓜材料，美國改良長綠品種中發(fā)現(xiàn)黃瓜無苦味突變體，將該突變體與植株含苦味素的品系雜交、自交，其雜交一代子葉均有苦味，證明該突變體是由一對隱性基因控制的，將該基因定名為該基因控制的黃瓜植株不含苦味素，果實(shí)在任何條件下都不苦。該基因的發(fā)現(xiàn)使得苗期篩選無苦味植株成為可能；此后發(fā)現(xiàn)另一無苦味品系制無苦味的基因與美國改良長綠品種一致。使葉片無苦味并阻止果實(shí)在逆境條件下變苦，用來抵抗環(huán)境誘導(dǎo)的苦味(981等)。 純合交，又發(fā)現(xiàn)控制黃瓜植株無苦味的另一基因。2代苦與不苦的比例為9:7，回交一代的比例為1:1；用交、自交，無苦味的遺傳符合單隱性基因模式。因而他們推論代表現(xiàn)符合兩隱性基因控制的上位作用模式。兩隱性基因都抑制苦味，但彼此獨(dú)立。只要植株中含有兩隱性基因中的任何一對，苦味素的合成將被抑制。他們將998)。 國內(nèi)以三種不同苦味類型(營養(yǎng)器官與果實(shí)均苦營養(yǎng)器官苦純合黃瓜自交系為試材，通過對其后代2、為控制黃瓜植株?duì)I養(yǎng)器官苦與不苦的基因受控制果實(shí)苦味基因合基因型為雜合狀態(tài)使控制果實(shí)苦味的基因?qū)嵰矔?huì)出現(xiàn)苦味，但苦的程度較含現(xiàn)苦味瓜的比例也低(顧興芳等，2004)。 目前控制黃瓜果實(shí)苦味的基因有Bt/于Bt、苦7，首次報(bào)道當(dāng)Bt、并未做詳細(xì)報(bào)道(998)。但且處于第一連鎖群。 養(yǎng)器官苦味性狀與病蟲害 國外的報(bào)道大多認(rèn)為苦味素是黃瓜甲蟲進(jìn)食的引誘劑。早在1971年Da 過對黃瓜色條葉甲(黃瓜條葉甲(這3種甲蟲對苦味素的反應(yīng)相似(Da 971)。1991年黃瓜十一星瓜葉甲蟲幼蟲，苦味素是該黃瓜甲蟲的引誘劑(991)。 Da 發(fā)現(xiàn)無苦味品系較苦味品系抗細(xì)菌性萎焉病(Da 971)。通過研究黃瓜甲蟲蟲口密度與黃瓜細(xì)菌性萎焉病發(fā)病率之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間存在高度線性正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)黃瓜甲蟲是黃瓜細(xì)菌性萎焉病的主要傳播媒介(996)。 關(guān)于苦味素與紅蜘蛛（間的研究結(jié)果不盡相同。有報(bào)道認(rèn)為含971；973；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 3 978)。苦味基因的改良長綠品系及近等位無苦味突變系的研究表明，黃瓜對紅蜘蛛的抗性與植株中是否含苦味素?zé)o絕對關(guān)系，黃瓜對紅蜘蛛的抗性是由多基因控制的，他認(rèn)為控制苦味的基因與抗紅蜘蛛的基因之間可能存在一定的連鎖關(guān)系(978；979；980)。1992)。最新的研究結(jié)果通過品嘗子葉，發(fā)現(xiàn)苦味與抗紅蜘蛛之間有完全的連鎖。用于試驗(yàn)的不苦雙單倍體群體材料均是高感病，苦的群體均顯示抗病(003)。 現(xiàn)從根結(jié)指數(shù)和植株活力來看，根結(jié)線蟲對植株的危害程度與植株中是否含苦味素關(guān)系不大，但無苦味植株根際產(chǎn)生顯著多的蟲卵，因此他們推論苦味素對根結(jié)線蟲有排斥性(976)。 、侵染，其原理是苦味素阻止介入感染過程和真菌毒性漆酶的形成(990)。 養(yǎng)器官苦味基因在連鎖圖中的定位及與其他性狀的連鎖關(guān)系 根據(jù)標(biāo)記對表型的影響，將黃瓜已發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記分為七大類，六個(gè)連鎖群( 990)。連鎖群含有12個(gè)基因，998)，色一致)、皮有刺瘤)、D(暗色果皮)及嫩果皮)連鎖，與處于第一連鎖群的限生長)有微弱連鎖，表明第一與第四連鎖群可能有連鎖關(guān)系(990，001)?；騞、u、ss、983；992；顧興芳等，2005)。葉柄)以11998)。 色突變性狀的研究概況 葉色突變是自然界比較普遍的突變現(xiàn)象，一般在苗期表達(dá)，生育后期發(fā)生的較少。引發(fā)突變的基因通常直接或間接地影響葉綠素的合成、降解、改變?nèi)~綠素含量。葉色突變體的來源廣泛，包括自發(fā)突變、人工誘發(fā)突變、插入突變和基因沉默突變。 葉色發(fā)生變異會(huì)影響植株的光合效率，造成作物減產(chǎn)，甚至導(dǎo)致植株死亡，過去常認(rèn)為是無意義突變。近年來，葉色突變體的利用價(jià)值備受關(guān)注。育種工作中，葉色變異作為標(biāo)記性狀用于簡化良種繁育和雜交種生產(chǎn)；某些葉色突變體具有特殊的優(yōu)良性狀，為作物遺傳育種提供了優(yōu)秀的種質(zhì)資源(995)。在基礎(chǔ)研究中，此類突變體是研究光合作用(，2004)、光形態(tài)建成(991)、激素生理(001)以及抗病機(jī)制(，2000)等一系列生理代謝過程的理想材料；還可分析鑒定基因功能(，1999)，了解基因間互作(，1998)。 色突變的遺傳及分子機(jī)制 不同葉色突變體的遺傳規(guī)律相差很大，可能是數(shù)量性狀，也可能是質(zhì)量性狀；會(huì)是細(xì)胞核遺傳，也會(huì)因細(xì)胞質(zhì)遺傳引起。例如，芽黃突變體大多受單一隱性核基因控制，少數(shù)受兩對核基因中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 4 控制(肖松華等，1995)，在胡蘿卜一個(gè)栽培種群中發(fā)現(xiàn)的黃色葉突變體，其外型表現(xiàn)是由單一隱性核基因控制(003)。與細(xì)胞核遺傳的葉色突變體相比，細(xì)胞質(zhì)突變體較少，僅在小麥(王保莉等，1996)、大豆(馬國榮等，1994)、煙草(，2000)等作物中有少量報(bào)道。這與植物細(xì)胞中含有多個(gè)細(xì)胞器(葉綠體、線粒體)有關(guān)。 葉色突變的分子機(jī)制較為復(fù)雜，多種途徑中的基因突變會(huì)引發(fā)變異。目前，對突變發(fā)生機(jī)制的推測主要有以下幾種觀點(diǎn)： 1、葉綠素生物合成途徑中的基因突變。目前，被子植物葉綠素合成途徑中所有的關(guān)鍵酶都已被鑒定，該途徑中任何基因發(fā)生突變都可能阻礙葉綠素形成、改變各種色素的比例，引起葉色變異。以葉色突變體為研究對象，不僅可分離、鑒定參與葉綠素合成的基因，還可驗(yàn)證前人對葉綠素合成的種種假說。已鑒定出，1999)、，2000)、，2003)、等對葉綠素合成起決定作用的基因，還驗(yàn)證了葉綠素合酶(995)、谷氨酰 000)、原葉綠素酸酯氧化還原酶(003)等關(guān)鍵酶在葉綠素合成過程中的功能。 2、血紅素光敏色素生色團(tuán)生物途徑中基因突變。葉綠素生物合成和血紅素生物合成是四吡咯生物合成途徑的兩個(gè)分支。葉綠素合成速率受細(xì)胞內(nèi)血紅素含量影響，若血紅素光敏色素生色團(tuán)途徑受阻、細(xì)胞內(nèi)血紅素含量上升，過剩的血紅素將反饋抑制葉綠素合成，引起突變體葉色變異(999)。缺乏光敏色素生色團(tuán)的葉色突變體是研究血紅素對葉綠素合成的調(diào)節(jié)作用的理想材料，也是研究高等植物光形態(tài)建成的理想材料。 3、編碼葉綠體蛋白的基因突變。葉綠體蛋白由葉綠體和細(xì)胞核基因共同編碼，其中葉綠體基因組編碼蛋白不足100種，大量的蛋白質(zhì)由核基因編碼在細(xì)胞質(zhì)中合成，而后借助葉綠體外套(的異位子(入葉綠體(999)?，F(xiàn)已借助大量這類突變體，分離、鑒定得到大量與葉片衰老(，1995)、質(zhì)體翻譯(000)、質(zhì)體發(fā)育和分化(003)、光合功能(003) 、蛋白輸入(005)有關(guān)的位點(diǎn)。 4、與光合系統(tǒng)無直接關(guān)系的基因突變。光合系統(tǒng)以外基因的突變也會(huì)引起葉色變異，但突變機(jī)制未徹底闡明。001)認(rèn)為這可能與細(xì)胞內(nèi)核(2004)推測細(xì)胞分裂素會(huì)改變合成代謝和分解代謝之間的平衡，葉綠素含量上升和穩(wěn)定性增強(qiáng)可能是突變體新陳代謝過程變異的結(jié)果。 瓜葉色突變性狀的研究進(jìn)展 國內(nèi)外關(guān)于黃瓜葉色突變的報(bào)道不多。國外已報(bào)道的非致死黃瓜幼苗葉色突變體有8個(gè)：g、v、中著生長逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樯罹G色，雄蕊發(fā)育不良；子葉顏色轉(zhuǎn)變速度比蕊發(fā)育正常；片花斑；后轉(zhuǎn)綠；001)。 我國也發(fā)現(xiàn)了4種非致死黃瓜幼苗葉色突變體。1984年，通過 第一章 文獻(xiàn)綜述 5 誘變，王玉懷等發(fā)現(xiàn)1株黃色子葉突變體，連續(xù)3代自交，其性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，研究認(rèn)為屬細(xì)胞核遺傳，由一對隱性基因控制(王玉懷等，1990)。1994年，陳遠(yuǎn)良等從新泰密刺的后代中發(fā)現(xiàn)具有“芽黃”性狀的突變體，連續(xù)多代自交，該突變體表現(xiàn)性狀穩(wěn)定。研究表明，“芽黃”性狀為細(xì)胞核遺傳，由一對隱性基因控制。由于認(rèn)為“芽黃”性狀和前面所述的黃瓜幼苗葉色突變體表現(xiàn)型不同，將發(fā)現(xiàn)的控制“芽黃”性狀的基因命名為遠(yuǎn)良等，2000)。1990年，從中農(nóng)5號的后代中陳遠(yuǎn)良等發(fā)現(xiàn)1株黃綠色葉片的黃瓜突變體，連續(xù)多代自交，該突變體表現(xiàn)性狀穩(wěn)定。研究者認(rèn)為該性狀為細(xì)胞核遺傳，由一對隱性基因控制，這一突變體與制黃綠色葉片的基因可能就是遠(yuǎn)良等，2000)。1990年，在深綠色葉的“地串”黃瓜品種單株自交后代群體中，分離出性狀穩(wěn)定的黃綠色葉突變株系。遺傳分析結(jié)果表明，突變株系的黃綠色葉性狀受一對隱性核基因控制。該性狀在幼苗期表現(xiàn)，突變株能正常生存