密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)與功能的研究 博士研究生：胡 濤 指 導(dǎo) 教 師：才 學(xué) 鵬 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類(lèi)別：農(nóng)學(xué)博士 專(zhuān) 業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 研 究 方 向：病原分子生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：研究生院 蘭州獸醫(yī)研究所 提交日期 2006 年 06 月 u 2006 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 論文評(píng)閱人、答辯委員名單 論文題目 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 構(gòu)與功能的研究 論文作者 胡濤 指導(dǎo)教師 才學(xué)鵬 培養(yǎng)單位 蘭州獸醫(yī)研究所 姓名 職稱職務(wù) 導(dǎo)師類(lèi)別 單位 專(zhuān)業(yè) 評(píng) 閱 人 答辯 主席 吳潤(rùn) 教授 博導(dǎo) 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 黃有德 教授 博導(dǎo) 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 胡永浩 教授 博導(dǎo) 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 殷宏 研究員 博導(dǎo) 蘭州獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 邱昌慶 研究員 博導(dǎo) 蘭州獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 劉湘濤 研究員 博導(dǎo) 蘭州獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 劉在新 研究員 博導(dǎo) 蘭州獸醫(yī)研究所 預(yù)防獸醫(yī)學(xué) 答 辯 委 員 答辯時(shí)間與地址 2006 年 06 月 16 日于蘭州獸醫(yī)研究所 記錄人員 魯炳義 摘 要 豬繁殖與呼吸綜合癥是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒( 起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病。毒,其基因組大小為 15右。因組包含 9 個(gè)開(kāi)放開(kāi)放閱讀框，分別編碼病毒的復(fù)制酶( 1b)，4 個(gè)膜相關(guān)的糖蛋白(a 至 5)，2 個(gè)非糖基化的膜蛋白(和 N 蛋白(復(fù)制酶被至少 3 個(gè)由病毒自身編碼的蛋白酶酶解。通過(guò)氨基酸序列的比對(duì)分析，非結(jié)構(gòu)蛋白 C 樣絲氨酸蛋白酶活性，并使用 為催化三聯(lián)體。 此外， 推測(cè) 底物結(jié)合區(qū)包括 氨基酸殘基。這兩個(gè)氨基酸殘基在 3C 樣半胱氨酸蛋白酶中也是保守的，并負(fù)責(zé)酶對(duì)底物切點(diǎn)(特異性。 為了研究 生化特性和結(jié)構(gòu)特征，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了野生型 變體 變體 變體 變體及 末端截短型經(jīng)鎳離子親和層析柱(純化獲得了高純度的重組表達(dá)蛋白。對(duì)純化的重組表達(dá)蛋白進(jìn)行 析，結(jié)果表明這些重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中獲得正確的表達(dá)。利用合成的多肽底物 S（反相高效液相色譜技術(shù)，建立了定性檢測(cè)活性的方法。利用該方法我們檢測(cè)了 生型、突變型、末端截短型等重組表達(dá)蛋白的酶活性。野生型 在體外酶解多肽底物 S，酶切產(chǎn)物經(jīng) 譜測(cè)定其分子量，結(jié)果表明底物多肽 S 中的 鍵被切斷，從而得到了預(yù)期的產(chǎn)物。說(shuō)明野生型 C 樣絲氨酸蛋白酶活性。而4個(gè) 變體和 2 個(gè)末端截短型 不表現(xiàn)出 3C 樣絲氨酸蛋白酶活性，說(shuō)明 3 等氨基酸殘基是 C 樣絲氨酸蛋白酶活性所必須的。從而證實(shí)了關(guān)于 成 C 樣絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體以及 物結(jié)合位點(diǎn)的推測(cè)。同樣，N 末端和 C 末端氨基酸殘基也都是 分子篩層析和 體外的溶液中存在著大量的聚體，即使在濃度（低的條件下也有大量的二聚體生成，且有少量的三聚體。隨著蛋白濃度的升高（2mg/聚體顯著增多。推測(cè)二聚體是 C 樣絲氨酸蛋白酶的主要活性形式。體外主要以三聚體形式存在，即使在低濃度（件下也是如此。體外主要以單體形式存在，即使在高濃度（2mg/件下也是如此。這個(gè)結(jié)果表明 C 末端對(duì)于 體的二聚化是必須的，它在酶單體二聚化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。猜測(cè) 聚體起穩(wěn)定作用，防止 使用圓二色光譜儀對(duì) 生型、突變型、末端截短型等重組表達(dá)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。結(jié)果表明 折疊為主要的結(jié)構(gòu)特征，點(diǎn)突變 64V、133L 都對(duì)構(gòu)有不同程度的影響。N 末端或 C 末端截短對(duì) 二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)成產(chǎn)生了顯著的影響，使這表明持正常構(gòu)象所必須的。 I 以馬動(dòng)脈炎病毒 3D 結(jié)構(gòu)為模板，同源模建了 3D 模型。并對(duì)該 3D 模型進(jìn)行了結(jié)構(gòu)合理性評(píng)估。 3D 模型由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，具有典型的雙折疊桶狀結(jié)構(gòu)。分析了其活性中心和底物結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了 成催化三聯(lián)體以及 物結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)論。最后，使用分子對(duì)接技術(shù)，將底物多肽（接到了 活性中心。的氨基酸殘基 ）處于 物分子（合在活性中心負(fù)電荷的區(qū)域。 通過(guò)以上研究，我們獲得了對(duì) C 樣絲氨酸蛋白酶生化特性和結(jié)構(gòu)特征的了解，增進(jìn)了我們對(duì) 原分子生物學(xué)的認(rèn)識(shí)。 關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合癥病毒，非結(jié)構(gòu)蛋白 構(gòu)，功能 is by in in of in is a a NA of 5 b), a ), ( an is by at (is a 3to to in On hr is in (In to to 133L), a a to of to （ . of S. at lu ly by 4 It a in by a in at at 2mg/ to be in at as in mg/is II or of D. on to of a of D to D a is is at in of by E） at 1 of in of It is , V 目 錄 第一章 緒論 .繁殖與呼吸綜合癥病原學(xué)研究進(jìn)展. . . 病毒起源之說(shuō) . 病毒的分類(lèi)地位 . 病毒的形態(tài)與發(fā)生 . 病毒的培養(yǎng)與細(xì)胞受體 . 致病機(jī)理 . . 因組 . 豬體內(nèi)的分布 .狀病毒 3C 樣蛋白酶研究進(jìn)展. 命名 . 同源性分析 . 活性中心 . 底物酶切位點(diǎn)的特異性 . 巢狀病毒主要蛋白酶的 3D 結(jié)構(gòu) .究目的與意義. .二章 結(jié)構(gòu)蛋白 其突變體的克隆與表達(dá) .言. .料與試劑. . 病毒. . 載體、引物與菌株 . 工具酶與試劑 . 主要溶液與培養(yǎng)基配制 .法. . 病毒 . 病毒 提取 . . 斷的回收 . 限制性酶切消化 . 斷和載體的連接 . 冷氯化鈣法制備新鮮感受態(tài)細(xì)胞 . 高效感受態(tài)細(xì)胞制備方法 . 常規(guī)轉(zhuǎn)化法 . 落 定 .1 質(zhì)粒 小量制備 .2 質(zhì)粒的酶切鑒定 .3 基因測(cè)序 .4 細(xì)菌的培養(yǎng)及菌種保存 .5 重疊延伸法定點(diǎn)誘變 因 .6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) .7 菌體的收獲和破碎 .8 重組表達(dá)蛋白的純化 .9 重組表達(dá)蛋白的 析 .果. . 因的 增 . 重疊延伸法定點(diǎn)誘變 因 . 菌落 定 . 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定 . 重組表達(dá)質(zhì)粒的 列測(cè)定 . 誘導(dǎo)表達(dá)和純化 . 重組表達(dá)蛋白的 定 .論. .三章 結(jié)構(gòu)蛋白 化特性的研究 .言. .料與方法. . 試劑 . 儲(chǔ)備液、實(shí)驗(yàn)溶液 . 儀器設(shè)備 . 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 . 底物多肽的酶切 . 酶切產(chǎn)物的 析 . 酶切產(chǎn)物的質(zhì)譜分析 . 重組表達(dá)蛋白的的分子篩層析分析 .果. . 底物多肽酶切產(chǎn)物的 析 . 質(zhì)譜分析 . 重組表達(dá)蛋白的的分子篩層析分析 .論. .四章 結(jié)構(gòu)蛋白 構(gòu)的研究 .I 言. .料與方法. . 圓二色光譜的測(cè)定 . 基酸序列 . 維結(jié)構(gòu)的同源模建 . D 模型結(jié)構(gòu)合理性的評(píng)估 . D 模型結(jié)構(gòu)相似性搜索 . D 模型與馬動(dòng)脈炎病毒 D 結(jié)構(gòu)的疊合 . D 模型與底物多肽的分子對(duì)接 .果. . 二色光譜的測(cè)定 . 基酸序列的 . 3D 模型 . D 模型結(jié)構(gòu)合理性的評(píng)估 . D 模型結(jié)構(gòu)相似性搜索 . D 模型與 D 結(jié)構(gòu)的疊合 . D 模型與底物多肽的分子對(duì)接 .論. .五章 研究總結(jié) .考文獻(xiàn) .謝 .文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱 中文名稱 3C 樣蛋白酶 3C 樣絲氨酸蛋白酶 aa 基酸 bp 基對(duì) 血清白蛋白 二色 炭酸二乙酯 硫蘇糖醇 動(dòng)脈炎病毒 二胺四乙酸 壓液相色譜 際病毒分類(lèi)委員會(huì) 丙基DV 乳酸脫氫酶增高癥病毒 非結(jié)構(gòu)蛋白 放閱讀框架 泡巨噬細(xì)胞 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) 繁殖與呼吸綜合癥病毒 二烷基璜酸鈉 氟乙酸 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 第一章 緒 論 繁殖與呼吸綜合癥病原學(xué)研究進(jìn)展 豬繁殖與呼吸綜合癥( 2 0世紀(jì)80 年代末出現(xiàn)的一種新病，其癥狀主要表現(xiàn)為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎及仔豬感染后的成活率下降,成年豬的呼吸道癥狀(et 1992； et 1999；et 1998)。同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致免疫抑制而繼發(fā)多種其它疾病。目前，該病在全世界幾乎所有養(yǎng)豬地區(qū)都有流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。 1987 年該病首次在美國(guó)的北卡羅納、衣阿華等州暴發(fā)，并在全美迅速蔓延(989)。最初,人們不能確定其病因,故此病一度被稱為“神秘病”(也有人根據(jù)其臨床特征將其稱為“豬不孕流產(chǎn)綜合癥”( “豬不孕與呼吸道綜合癥”(及“藍(lán)耳病”(。 1991 年荷蘭科學(xué)家 士用豬肺巨嗜細(xì)胞(離到致病因子萊立斯塔病毒( (et 1991), 后，和報(bào)道了他們分離的病毒，即 洲型代表株 ，通過(guò)對(duì)該病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、基因組組成和免疫學(xué)特性的研究,確定其為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒(et 1992；et 1992)。隨后,加拿大、日本、德國(guó)、荷蘭等一些國(guó)家也先后報(bào)道了該病的發(fā)生。1991年歐洲爆發(fā)了毀滅性流行,造成了近百萬(wàn)頭豬死亡。1992 年在美國(guó)的米尼蘇達(dá)州圣堡羅舉行的關(guān)于本病的專(zhuān)題討論會(huì)上，正式命名為“豬繁殖與呼吸綜合征( ，并得到國(guó)際獸疫組織（承認(rèn)，將其定為 B 類(lèi)傳染病。同年，歐共體將該病統(tǒng)一命名為“豬繁殖與呼吸綜合癥( 。 我國(guó) 1991 年在臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生此病，國(guó)內(nèi)陳博文等于 1996 年從國(guó)外進(jìn)口豬中檢出 清抗體陽(yáng)性（陳博文等，1996） 。郭寶清等于同年在建立豬生殖一呼吸綜合癥病毒(性杭體間接免疫熒光檢測(cè)技術(shù)和病毒分離方法的基礎(chǔ)上，對(duì)國(guó)內(nèi)有本病癥狀的豬群作了血清學(xué)調(diào)查和病原分離，先后在 10 個(gè)地區(qū)的 10 個(gè)豬場(chǎng)采集了 151 份血清樣品，其中 4 個(gè)豬場(chǎng) 99 份血清樣品中檢出 8份，陽(yáng)性率為 58/99)，在 58份陽(yáng)性血清中有 23 個(gè)樣品來(lái)自 測(cè)結(jié)果 100%陽(yáng)性(郭寶清等，1996)。采用豬肺巨噬細(xì)胞和 胞培養(yǎng)，對(duì)國(guó)內(nèi)疑似暴發(fā)流行 某地豬場(chǎng)進(jìn)行了病毒分離，從流產(chǎn)死胎中分離到 4 株。這 4 株毒均可在豬肺巨噬細(xì)胞和 胞上生長(zhǎng)，并產(chǎn)生特征性化。用 國(guó)分離毒株 血清分別對(duì) 4 株 株感染細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果表明這 4 個(gè) 株近似于美洲型 寶清等，1996)。從血清學(xué)和病原學(xué)角度，首次證實(shí)在我國(guó)的豬群中存在 個(gè)陽(yáng)性豬場(chǎng)分布于東北、華北、華中和華南 4 個(gè)大區(qū)。表明本病在我國(guó)廣泛存在。 1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 毒起源之說(shuō) 起源仍很神秘，在北美和歐洲，該病是由 兩種基因型引起，它們的基因組大約有 40%的差異（見(jiàn)圖 1。歐洲和北美 別以 簡(jiǎn)稱 、稱代表株。為解釋兩種不同的 因型的起源和進(jìn)化，G 于 2003 年提出了由鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(異 進(jìn)化而來(lái)，且以野豬為中介宿主的假說(shuō)（G，2003） 。 圖 1與 氨基酸序列比較的示意圖(et 1999) of V 酸、 氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果表明所有的 離株與 切相關(guān)。 在比對(duì)了 放閱讀框5（酸序列而繪制的種系發(fā)生樹(shù)上，分枝位于 、連線上可看出 兩者有近似相同程度的相關(guān)性（見(jiàn)圖1。同時(shí)，也可通過(guò)在所有病毒蛋白中找到一些具有同源性的氨基酸來(lái)證實(shí)這種關(guān)系（見(jiàn)圖1。傳學(xué)的穩(wěn)定性及其與 2 個(gè) 因型之間的關(guān)系，表明了 有可能起源自圖 1洲株、歐洲株與 進(jìn)化樹(shù)（003） 32 5 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 圖 1、與 蛋白氨基酸序列比對(duì)（2003） of LV G 推測(cè)過(guò)傷口感染了中歐的野豬后產(chǎn)生的變異病毒，這些野豬曾作為狩獵使用被引進(jìn)美國(guó)，被引進(jìn)的野豬就作為中間宿主將病毒傳播至北卡羅來(lái)納州，感染的時(shí)間大約發(fā)生在 1912 年。這些病毒在這兩大洲內(nèi)獨(dú)立變異和進(jìn)化，大約經(jīng)過(guò)七十年左右的時(shí)間，通過(guò)家豬和野豬的接觸，病毒進(jìn)入家豬群中，形成了后來(lái)的兩大獨(dú)立的 型（即通常所說(shuō)的 2 種基因型） ：歐洲型（以 稱 美洲型（以 代表，簡(jiǎn)稱。 歐洲和北美在1991et et et et ?；仡櫺詸z測(cè)也同時(shí)發(fā)現(xiàn)美國(guó)的愛(ài)荷華州在 1985年，明尼蘇達(dá)州在 1986年，東德在 1988的豬血清中發(fā)現(xiàn)了 抗體，而在 1985 年之前愛(ài)荷華州以及德國(guó)的家豬血清內(nèi)卻并未檢測(cè)到相應(yīng)的抗體。 毒的分類(lèi)地位 在 1996 年第 10 屆國(guó)際病毒學(xué)大會(huì)上，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)(過(guò)了兩項(xiàng)提議： 1， 將馬動(dòng)脈炎病毒(鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(e 、豬繁殖與呼吸綜合征病毒( 猴出血熱病毒(于新成立的動(dòng)脈炎病毒科(2，新成立的 動(dòng)脈炎病毒科和冠狀病毒科(屬于巢狀病毒目( 這標(biāo)志著動(dòng)脈炎病