密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 來源于青霉 因 克隆、表達(dá)與性質(zhì)研究 of 博 士 研 究 生：密士軍 指 導(dǎo) 教 師：姚 斌 研究員 申請(qǐng)學(xué)位類別：理學(xué)博士 專 業(yè) ：生物化學(xué)與分子生物學(xué) 研 究 方 向：酶的分子生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：研究生院 飼料研究所 提交日期 2006 年6 月 of 006 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文評(píng)閱人、答辯委員會(huì)名單表 論文題目 來源于青霉因克隆、表達(dá)與性質(zhì)研究 論文作者 密士軍 專 業(yè) 生化與分子生物學(xué) 研究方向 酶的分子生物學(xué) 指導(dǎo)教師 姚斌 培養(yǎng)單位 （研究所、 中心） 飼料所 姓名 職稱 碩（博）單 位 專 業(yè) 簽 名 王 璋 教授級(jí)高工 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 酶工程 文華安 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物學(xué) 評(píng) 閱 人 伍寧豐 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo)中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所微生物學(xué) 答辯 主席 范云六 研究員 院士 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 分子生物學(xué) 吳乃虎 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 分子生物學(xué) 錢世鈞 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 酶分子生物學(xué) 宋 未 教授 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 首都師范大學(xué)生物學(xué)院 分子生物學(xué) 莫湘筠 教授級(jí)高工 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 酶工程 張志芳 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 分子生物學(xué) 伍寧豐 研究員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 中國(guó)農(nóng)科院生物技術(shù)研究所 微生物學(xué) 答 辯 委 員 碩導(dǎo) 博導(dǎo) 會(huì)議記錄（秘書） 袁鐵錚 論文答辯時(shí)間地點(diǎn) 午 9:00 農(nóng)科院飼料所 301# 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時(shí)間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、 使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和 磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段 保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體 上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 （保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議） 論文作者簽名： 時(shí)間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時(shí)間： 年 月 日 中文摘要 催化 泛的分布于植物、動(dòng)物和微生物體內(nèi)。它不但可以催化 可以催化含 酶在飼料、食品、造紙和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而目前 量較低，成本較高，從而限制了 此利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和手段，克隆- 半乳糖苷酶基因，構(gòu)建高效表達(dá)和分泌的基因工程菌株來提高- 半乳糖苷酶產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本是解決隨這一問題的有效途徑。 本研究利用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析、分子篩層析和電泳技術(shù)從青霉 分離純化到一種- 半乳糖苷酶 酶的分子量為 330 基分子量為 82 蛋白是由相同亞基組成的一種四聚體。經(jīng)過 定和 S 測(cè)序分析，該蛋白為一種新的 用所測(cè)的兩段內(nèi)肽的氨基酸序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以青霉基因組 模板 據(jù)克隆到的 過反向 術(shù)得到了該基因的 5上游和 3下游序列。根據(jù)該 計(jì)恰當(dāng)?shù)囊?，以青?絲體總 模板，通過 隆到該 全長(zhǎng)序列。通過測(cè)序證明該 為 2205 推定為該基因的起始密碼子，編碼一個(gè)含有 734個(gè)氨基酸的酶蛋白，N 端 21 個(gè)氨基酸為該 測(cè)該酶的理論分子量為 78.5 論 成熟蛋白的氨基酸序列中，有 7 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。與其它的到 該 現(xiàn)它們的序列一致性較低，與紫青霉和單青霉的氨基酸序列一致性分別為 這是首次從青霉屬中克隆到糖基水解酶 36 家族的 將編碼 ，電擊轉(zhuǎn)化宿主菌用 平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。從 100 個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選到了 23株表達(dá) 中 56#轉(zhuǎn)化子在 3.2 mg/11 U/為國(guó)外最高酶活力的 2 倍，是國(guó)內(nèi)構(gòu)建的 倍。 將重組 半乳糖苷酶進(jìn)行純化并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究。天然酶的最適溫度為 45，重組酶的最適 40。天然酶與重組酶的最適為 組酶與天然酶對(duì)高溫都較敏感。天然酶在 之間具有良好的定性，而重組酶在 之間具有良好的定性，它們?cè)诔刈饔?12 余酶活力都大于 88。天然酶的比活為 ，重組酶的比活為 。天然酶和重組酶都受強(qiáng)烈抑制，原始酶受抑制不顯著而重組酶受到完全抑制。它們其它的酶學(xué)性質(zhì)是相似的。重組 子糖和水蘇糖。重組 適溫度與最適近動(dòng)物腸道的生理?xiàng)l件，故重組的 關(guān)鍵詞：青霉， 離純化，性質(zhì)鑒定，基因克隆，異源表達(dá)，畢赤酵母I in as is in as is An to is to to to to of An 63, to by a 2 30 on is a of S is a on of to NA of CR to of to of A RF 205 a 34 1 as a in a as of pI of 8.5 ) be in of of of . a of 7 as . . To is of to 6 of by by to 3 in 00 of 6# 11U/mL I in a 3 L to be of as to by of 5 of 0. pH of of to pH 2 in .0 .0 2 .0 8% of of +. is g+is g+. no or on of of as of in of of is to be in 錄 中文摘要第一章 引言 料工業(yè) 品工業(yè) 造紙工業(yè)醫(yī)療領(lǐng)域 真核生物的表達(dá)系統(tǒng) 酒酵母( 達(dá)系統(tǒng)醇營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng) 多形漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在在飼料添加劑開發(fā)上的應(yīng)用 飼料用酶 激素 抗菌肽 究的目的和意義 二章 一種來源于青霉的新的 材料和方法 材料 V 菌株 試劑和儀器 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 酶活性測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度和分子量的測(cè)定 酶的分離純化 離子交換層析 凝膠過濾層析 泳 非變性 活性染色 非變性梯度凝膠電泳 純化蛋白的質(zhì)譜鑒定與內(nèi)肽序列的測(cè)定酶學(xué)性質(zhì) 不同金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對(duì) . 底物特異性的測(cè)定 結(jié)果與分析青霉 來源于青霉的 端測(cè)序 純化蛋白的內(nèi)肽序列的測(cè)定 章小結(jié)三章 材料和方法 材料 菌株和質(zhì)粒 引物合成 試劑盒、工具酶和生化試劑 法 青霉 因組 提取 段的擴(kuò)增 反向 獲得 雙酶切 泳回收 連接 感受態(tài)細(xì)胞的制備 電轉(zhuǎn)化 0 篩選重組子1 質(zhì)粒 大量提取2 列測(cè)定、序列一致性比較 結(jié)果 獲得 反向 克隆及鑒定青霉青霉 青霉 章小結(jié) 四章 材料和方法材料 菌株與質(zhì)粒 引物合成 培養(yǎng)基 試劑及儀器 方法 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建 質(zhì)粒 處理 酵母感受態(tài)的制備 酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 I 轉(zhuǎn)化子的篩選 目的基因在畢赤酵母中的表達(dá)檢測(cè) 發(fā)酵罐水平重組酵母的高細(xì)胞密度發(fā)酵 結(jié)果表達(dá)載體的構(gòu)建和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化表達(dá) 瓶水平 組子的 測(cè) 酵罐水平 章小結(jié)五章 重組與天然 材料和方法 試驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)儀器重組 粗酶液的制備 L 層析 子篩層析 蛋白含量的測(cè)定泳達(dá)產(chǎn)物的脫糖基化 結(jié)果重組 天然和重組 重組 不同化學(xué)試劑對(duì)天然和重組 天然和重組 重組 章小結(jié) 六章 討論 七章 結(jié)論 考文獻(xiàn)謝 者簡(jiǎn)介 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 第一章 引言 1 - 半乳糖苷酶及其分子生物學(xué)的研究進(jìn)展 初是從酵母底面發(fā)酵液中提取出來的，加水可以分解蜜二糖，固又稱為蜜二糖酶。后來通過對(duì)各種碳水化合物為底物研究蜜二糖酶的特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該酶的主要作用底物是具有 此又將該酶命名為 孝輝等， 2003）。 夠?qū)Ｒ恍源呋擎湻沁€原末