密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 水稻葉形控制基因的克隆及其功能研究 士研究生：張光恒 指 導(dǎo) 教 師：錢 前 申請學(xué)位類別：理學(xué)博士 專 業(yè)：生物化學(xué)與分子 研 究 方 向：水稻分子遺傳學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：中國農(nóng)科院研究生院 中國水稻研究所 提交日期 2007 年 6 月 of 2007 研本究得到 973 計(jì)劃 發(fā) 調(diào)：株型育的基因控 （2005863 計(jì)劃 與 研：水稻卷葉控制基因的克隆功能究（20060110資助 973) (o. G 2005863) (o. 20060110) 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 摘 要 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，葉片形態(tài)研究一直備受關(guān)注。葉片是植物體進(jìn)行光合作用的最基本營養(yǎng)器官，大部分葉片形態(tài)改變都會影響到植物體的光合作用、蒸騰作用和抗逆性等生理功能，從而極大的影響到植株的生長和發(fā)育。 為了研究水稻葉形態(tài)建成的控制機(jī)制和植物葉片結(jié)構(gòu)組成的分子機(jī)理，我們從學(xué)誘變粳稻日本晴種子的 77、 樣，我們從60射線誘變的秈稻品種雙科早處理的 份卷葉突變體材料 研究對這些卷葉突變體進(jìn)行了等位性檢測、葉片細(xì)胞形態(tài)學(xué)切片觀察，突變性狀遺傳分析，卷葉控制基因的圖位克隆及功能初步研究，主要結(jié)果如下： 一、水稻卷葉突變體 鑒定、遺傳分析及基因精細(xì)定位 1、等位性檢測：對 4 份卷葉突變體進(jìn)行正反交，并對 株進(jìn)行表型鑒定。結(jié)果表明 個卷葉突變體等位。暫時把這些卷葉突變類型稱統(tǒng)為蔥卷突變( 分別命名為 2、從葉片細(xì)胞形態(tài)學(xué)切片觀察和生理生化測定結(jié)果顯示，因的突變造成葉片維管束遠(yuǎn)軸面厚壁細(xì)胞的缺失，葉片葉綠素含量增加和纖維素含量的下降。 3、遺傳分析： 3 個正常平展葉秈稻品種廣四和粳稻品種日本晴作父本分別進(jìn)行正反交，并對所有的雜交組合的果表明，在所有組合的2代分離群體中的葉片正常株與突變株的分離比符合 3:1。由此我們認(rèn)為突變體的表型受隱性單基因控制。 4、利用卷葉性狀能穩(wěn)定遺傳的 變體（粳稻）與秈稻品種南京 6 號（雜交構(gòu)建定位群體，運(yùn)用 記，最終將 因精細(xì)定位在第 9 染色體長臂上物理距離為 區(qū)間內(nèi)，共包含 3 個開放閱讀框，預(yù)測分別編碼一個合成蛋白、類似 白。 二、水稻卷葉控制基因 克隆和初步功能研究 1、測序結(jié)果表明突變體 因組序列都發(fā)生了單堿基的替換（G 到 A） 。根據(jù) 平檢測發(fā)現(xiàn) 突變事件分別發(fā)生在同一基因內(nèi)部兩個不同的剪接位點(diǎn)上，導(dǎo)致 能正常剪接。 2、明 確 因位于 隆 103061位置，其 度為5455長為 1134編碼 377 個氨基酸。共包含 6 個外顯子（和 5 個內(nèi)含子（。 3、從 結(jié)果表明， 因在整個植株個器官中都有不同程度的表達(dá)。其中，葉、花和穎殼中的表達(dá)量最高，其次是根、最弱的是莖稈和葉鞘部分。 I 4、我們通過構(gòu)建植物表達(dá)載體 化水稻，在 基因植株的整個生長發(fā)育階段，所有部位都能檢測到 性，但在各組織器官表達(dá)范圍存在一定差異。在葉片泡狀細(xì)胞中沒有表達(dá)，而在維管束、氣孔、導(dǎo)管等疏導(dǎo)組織中都有較強(qiáng)表達(dá)。在種子幼芽、葉片（包括葉鞘）、莖稈和種子穎殼中表達(dá)范圍較廣，主要在脈絡(luò)系統(tǒng)中有較強(qiáng)的表達(dá)；而在根中只有中柱鞘、籽粒中只用疏導(dǎo)組織和花中只有雄蕊能檢測到藍(lán)色。 5、通過互補(bǔ)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入 因的卷葉突變體 片表型恢復(fù)正常。 三、水稻卷葉突變體 遺傳分析及基因精細(xì)定位 1、等位性檢測結(jié)果表明，卷葉突變體 位。由于其卷曲程度沒有 重，為區(qū)別起見，我們將 27 突變體( 別命名為 2、從葉片細(xì)胞形態(tài)學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)， 因功能的喪失造成了維管束兩側(cè)、靠近葉片近軸面的泡狀薄壁細(xì)胞的增加，其維管束細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。 3、 過連續(xù)多代自交種植，確認(rèn)突變性狀能穩(wěn)定遺傳。對 個組合的確變性狀受 1 對隱性基因控制。 4、通過構(gòu)建 位群體，在,200 多株卷葉表型個體，通過設(shè)計(jì)子標(biāo)記，最終將因精細(xì)定位在第 2 染色體端粒附近物理距離為 914 個開放閱讀框（。 關(guān)鍵詞 水稻 ( .)，葉形，因， 因，圖位克隆，功能分析 is of in in is a an in to In in to of .) O. 77 28, We 27 92 O. 0We of be as of 、 of of 1by as 2、we of to of of in of in 3、we on of 121of to :1 of by 4、 a O. J6 as a on of , to be a n/to . of is a in of or G ). of at of to 2. 03061of AC of 455 of of 134 a 377 3. to in of in at at 4. to US in in in to no in US in of at at be 5. of of 、27 92 a of by to we 92、 2、of of of in 3、on of of PB、N1 by 4. ,200 in 21 Kb on , to RF .), V 目 錄 英文縮略表 .一章 緒論 .引言 .水稻葉片發(fā)育、結(jié)構(gòu) . 植物葉片的發(fā)育過程 . 水稻葉片的構(gòu)造及其特點(diǎn) . 禾本科 4 植物葉片構(gòu)造 .植物葉片形態(tài)建成分子機(jī)制 . 葉片細(xì)胞的極性分化 . 葉形態(tài)決定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)理論 . 葉片形態(tài)建成的分子機(jī)制 .稻葉片形態(tài)與理想株型的關(guān)系 . 10 稻卷葉性狀類型的分類 . 10 稻葉形態(tài)因子判斷標(biāo)準(zhǔn) . 12 已定位和發(fā)現(xiàn)的水稻卷葉基因 . 12 卷葉性狀的生理生態(tài)效應(yīng)的研究 . 13 水稻突變體庫的構(gòu)建及功能基因克隆方法 . 14 稻突變體庫的構(gòu)建 . 15 物基因的克隆 . 16 因的圖位克隆 . 20 位克隆技術(shù)在水稻中的應(yīng)用 . 24 本研究的目的和意義 . 27 第二章 水稻卷葉突變體 鑒定、遺傳分析及基因精細(xì)定位 .實(shí)驗(yàn)材料 . 28 葉突變體的來源 . 28 V 稻卷葉突變體群體組合的配制 . 28 位群體 . 28 用分子生物學(xué)試劑 . 29 2. 2 實(shí)驗(yàn)方法 . 29 基黃酸乙脂(化學(xué)誘變 . 29 射誘變處理 . 29 描電鏡 . 30 態(tài)解剖學(xué)觀察 . 30 臘切片植物組織觀察 . 31 . 31 綠素含量測定 . 32 合速率測定 . 32 稻 取 . 32 應(yīng)體系 . 33 泳檢測 . 34 定位的 記 . 34 過新發(fā)展的 記精細(xì)定位 因 . 34 結(jié)果與分析 . 35 稻卷葉突變體的等位性測定 . 35 稻卷葉突變體遺傳分析 . 35 稻卷葉突變體形態(tài)特征 . 36 綠素含量測定 . 39 光合速率的測定 . 40 因的定位 . 40 討論 . 43 葉與光合作用之間的關(guān)系 . 43 胞結(jié)構(gòu)變化 . 44 位材料（穗部）表型差異、互補(bǔ)機(jī)制 . 44 葉性狀利用 . 45 第三章 水稻卷葉控制基因 克隆和初步功能研究 .實(shí)驗(yàn)材料 . 46 實(shí)驗(yàn)方法 . 46 變基因測序 . 46 物組織總 取 . 46 . 47 粒的提取 . 47 能互補(bǔ)試驗(yàn) . 48 構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 . 49 維素含量測定 . 50 結(jié)果與分析 . 50 變位點(diǎn)的確定 . 50 長基因的獲得與功能的預(yù)測 . 52 基因表達(dá) . 53 基因及互補(bǔ)表型觀察 . 55 討論 . 56 第四章 水稻卷葉突變體 遺傳分析及基因精細(xì)定位 .實(shí)驗(yàn)材料 . 58 位性檢測 . 58 間雜交及. 58 用分子生物學(xué)試劑 . 58 實(shí)驗(yàn)方法 . 58 結(jié)果與分析 . 59 27 卷葉突變體的等位性檢測 . 59 稻卷葉突變體 遺傳分析 . 59 葉突變 的形態(tài)特征 . 59 稻卷葉 因的精細(xì)定位 . 61 論 . 63 第五章 全文結(jié)論 .考文獻(xiàn) . 謝 . 者 簡 歷 .英文縮略表 英文縮寫 英 文 全 稱 中 文 名 稱 菌人工染色體 1粒人工染色體 母人工染色體 類人工染色體 氧核糖核酸 補(bǔ) 因組 糖核酸 核糖核酸 氧核糖核苷三磷酸 霉酸 尖分生組織 放閱讀框 基磺酸乙酯 化乙錠 化十六烷三甲基銨 :1:18 福爾馬林: 冰醋酸: 酒精=1:1:18 二胺四乙酸 部排列搜索工具 續(xù)上表： 英文縮寫 英 文 全 稱 中 文 名 稱 bp 基對 kb 堿基對 摩 單序列重復(fù)（微衛(wèi)星） 列標(biāo)記位點(diǎn) 達(dá)序列標(biāo)簽 割擴(kuò)增長度多態(tài)性 制性片段長度多態(tài)性 增片段長度多態(tài)性 單片段長度多態(tài)性 稻基因組計(jì)劃 株型 量性狀定位 倍單倍體 等基因系 組自交系 合酶鏈反應(yīng) 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) CR 異顯示技術(shù) 表性差異分析 制性扣除雜交 互差減 別顯示技術(shù)因表達(dá)指紋法 纖維熒光原位雜交 X 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒 論 第一章 緒論 引言 葉片是植物進(jìn)行光合作用和呼吸作用的主要器官，綠色植物通過葉片進(jìn)行光合作用，把光能轉(zhuǎn)變成化學(xué)能，是最普遍也是最廉價的能量轉(zhuǎn)化過程，它是地球上一切動物( 包括大多數(shù)微生物) 的生命源泉，同時也是人類社會的主要物質(zhì)和能量的來源。綠色植物產(chǎn)量，包括根、莖、葉、種子等，其中只有 5%物質(zhì)來自根部吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，而 90%物質(zhì)則來自作物葉片的光合作用的產(chǎn)物（朱雄濤等， 2003）。葉片千姿百態(tài), 不同植物既有相似相近, 又有貌象迥異的葉形 , 而且同一植物在不同生長時期或不同生長條件下具有不同的葉片形態(tài)（李林川等， 2006）。葉的極性建立直接決定了葉形的發(fā)育。葉的卷曲形態(tài)對一些作物來說是一種非常重要的農(nóng)藝性狀。大部分葉片極性改變都會影響到植物體的光合作用、蒸騰作用和抗逆性等生理功能。了解水稻葉極性建成和葉卷曲發(fā)生的遺傳規(guī)律，對于遺傳上控制植株形態(tài)，發(fā)展葉發(fā)育的重要理論，改良葉平展度或卷曲度等遺傳性狀，提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)有重要的理論意義和實(shí)用價值（余琳，2005 ）。 本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及到了水稻葉片發(fā)育、葉片形態(tài)建成、水稻基因的克隆、基因功能的研究等內(nèi)容，作者對葉片發(fā)育、構(gòu)造特點(diǎn)和形態(tài)建成的分子機(jī)制、水稻功能基因組等研究相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行綜述。 稻葉片發(fā)育、結(jié)構(gòu) 植物發(fā)育時，十分有秩序地形成了各種形態(tài)。植物體的根端與莖端，存在各種側(cè)生器官。植物中這種具軸的兩極向特征，就稱之為極性現(xiàn)象。植物形態(tài)發(fā)生中除了極性現(xiàn)象以外，還有相關(guān)現(xiàn)象和對稱現(xiàn)象等。植物體的“體軸”不是一種真正的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，而只是一種幾何學(xué)上的軸或面，由此將植物體或器官分成兩面，形成對稱。這些沿著軸或縱向面的對稱，大致可分為輻射對稱、左右對稱和腹背對稱 3 種類型。葉片是植物體進(jìn)行光合作用的基本營養(yǎng)器官，它的形態(tài)發(fā)育極大的影響到植株的生長和發(fā)育。典型的葉片結(jié)構(gòu)除了表皮細(xì)胞之外，還包括柵欄組織和海棉組織。柵欄組織是一類排列整齊致密的細(xì)胞，內(nèi)含豐富的葉綠體，主要進(jìn)行光合作用，而下表面的海綿組織則由松散不規(guī)則的細(xì)胞構(gòu)成，間或分布著用于氣體交換的氣孔，以發(fā)揮呼吸作用（et 2002 ）。雙子葉植物中，具有葉綠體的葉肉組織變化為柵欄組織和海綿組織。葉的正面（向軸一面）有由兩層圓柱狀細(xì)胞組織。但是禾本科植物的葉片中，柵欄組織和海綿組織的區(qū)分并不明顯，葉肉組織往往由具有幾個突起的復(fù)雜形狀1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒 論 的。植物不同物種的葉，具有不同的顏色、形狀和大小，但每種植物都會盡可能的伸展葉片以吸收更多的光能。 水稻是世界第二大谷類作物，是全球近一半人口的主要食物來源。同時，由于水稻的基因組較小、與其他禾本科作物具有廣泛的共線性等優(yōu)點(diǎn)，成為禾本科作物研究的模式植物。由于水稻品種及生長環(huán)境的不同，水稻葉片的大小、長度、寬窄、厚薄、彎直、葉色濃淡、葉片形態(tài)（平展度）等均不相同。但一般來說，秈稻比粳稻，早稻比晚稻的葉片長、大、彎、垂。而粳稻的葉片一般葉色濃綠?，F(xiàn)在栽培多數(shù)高產(chǎn)半矮稈品種都屬于秈稻品種，且葉片厚、硬、挺、葉色濃等特點(diǎn)。這些特征都有利于提高光能利用，成了選、育工作的重點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)，賦予了水稻葉片的結(jié)構(gòu)研究重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此現(xiàn)將水稻葉片的形成過程、構(gòu)成水稻葉片形態(tài)上下表面、葉鞘和維管束等主要結(jié)構(gòu)的特征進(jìn)行簡要的敘述。 物葉片的發(fā)育過程 總體來說，葉的發(fā)生和發(fā)育是一個復(fù)雜的過程：包括葉原基在頂端分生組織的生成和分化，葉原基極性建立后分化出葉的各個部分，如：葉柄、葉片，托葉等。最后，細(xì)胞在已分化出的葉的基本結(jié)構(gòu)框架上，進(jìn)一步分裂分化，形成具有功能的組織結(jié)構(gòu)，如表皮細(xì)胞，柵欄組織，海棉組織和葉脈系統(tǒng)等。 現(xiàn)已明確，葉和花屬于植物的側(cè)生器官。是從地上部分的頂端分生組織（ 育而來的（2000 ） 。在 中央，有一團(tuán)分裂緩慢的細(xì)胞，組成 中心區(qū)。這些細(xì)胞，有點(diǎn)象動物的干細(xì)胞，始終處于非分化的狀態(tài)。在 心區(qū)的外圍，細(xì)胞分裂的速度明顯加快，這些快速分裂的細(xì)胞，組成了 周邊區(qū)。在周邊區(qū)里，有一些成簇的細(xì)胞性質(zhì)開始發(fā)生變化，這些細(xì)胞稱之