,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,ContributionstoNewDevelopmentsinMedicalDiagnosisandMicrobiology德國Partec公司中國服務中心張向陽,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞儀的原理流式細胞儀使用一般方法及技巧,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞術,流式細胞分析，又稱流式細胞術（flowcytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術。他綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等各門學科。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞術,流式細胞分析，又稱流式細胞術（flowcytometry，F(xiàn)CM），是以高能量激光照射高速流動狀態(tài)下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度，從而對細胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態(tài)等進行定性或定量檢測的一種現(xiàn)代細胞分析技術。他綜合了激光技術、計算機技術、半導體技術、流體力學、細胞化學等各門學科。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,特點：（1）單細胞分析。（2）快速分析。（3）多參數(shù)相關測量。（4）定性或定量分析細胞。（5）統(tǒng)計學意義明顯。（6）分選。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,熒光,有些物質(zhì)，當用光照射時，它吸收了該種波長的光后還會發(fā)射出各種顏色和不同強度的光，而當光停止照射后，這種發(fā)射的光也隨之消失，這種發(fā)射的光稱為熒光(fluorescence)。熒光的波長比吸收光線的波長要長些。由于物質(zhì)的分子結構不同，所吸收的光和所發(fā)射的熒光波長也不同。被這些物質(zhì)吸收的光稱為激發(fā)光，產(chǎn)生的發(fā)射光即熒光。熒光的顏色多為紅、藍、綠或黃等。物質(zhì)的熒光有兩種，一種是自發(fā)性熒光，即組織在短波長光照射下自行發(fā)射出的熒光。如，組織中的蛋白質(zhì)和脂類在紫外線照射下能發(fā)射出微弱的淡藍色熒光。另一種熒光是誘發(fā)熒光，即細胞與熒光色素結合后，經(jīng)一定波長的光線照射后發(fā)出的熒光。常用的是誘發(fā)熒光，能產(chǎn)生熒光的生物染色劑稱為熒光染料(或稱熒光色素)。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,熒光激發(fā)與發(fā)射原理,能量級,能量損失,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,免疫熒光技術,免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗原或抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測細胞表面或細胞內(nèi)的相應抗原(或抗體)。從而使形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用流式細胞儀檢測標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(如，黃、綠色或紅色等)，通過確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位來推斷細胞的信息，以及利用定量技術測定含量。,常用方法：單抗直接標記,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,嵌入性染料,如DAPI、赫斯特、PI等，直接與細胞內(nèi)的DNA雙螺旋結構中的A-T堿基對結合，從而使細胞在激發(fā)光的照射下發(fā)特定波長的光，通過判斷發(fā)射光的強弱來推算A-T堿基對的多少，從而得知DNA的倍性關系。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,細胞膜電位、離子、脂類探針,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出來了各種細胞膜電位、各類離子、pH值、脂類探針，運用這些探針在流式細胞儀上可輕易檢測各種細胞功能，可實現(xiàn)一些意想不到的效果。詳細信息，見細胞探針公司網(wǎng)站：www.molecularP,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,與流式細胞儀相關的熒光術語,MESF（Moleculesofequivalentsolublefluorochrome）等量可溶性熒光分子：國際標準單位，用來衡量熒光強度自發(fā)熒光：細胞或顆粒在激發(fā)照射下會發(fā)出各種波長的熒光。白細胞自發(fā)熒光強度為6501150MESF，血小板及其他顆粒自發(fā)熒光更低流式細胞儀精度：分析白細胞要求精度在600MESF以內(nèi)，分析其他細胞或顆粒需要更高的精度：200MESF以內(nèi),Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,常見熒光染料列表,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,常見熒光染料列表,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,常用熒光染料種類,488nm藍色激光激發(fā)：FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPE-Cy5（PE的衍生物）：紅色665nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：紅色675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm637nm紅色激光激發(fā)：APC(別藻蘭蛋白）：紅色665nmAPC-Cy5(別藻蘭蛋白的衍生物）：深紅色710nm365nm紫外光激發(fā)：DAPI（4，6-咪基-2聯(lián)苯吲哚）：藍色455nm532nm綠色激光激發(fā)：PE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPE-Dy647（PE的衍生物）：紅色647nmPE-Cy5（PE的衍生物）：紅色665nm,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞儀的原理概述,流式細胞儀（FlowCytometer簡稱FCM）是一種自動分析細胞的高端技術設備，其原理是懸浮在液體中的細胞一個個地依次通過測量區(qū)，當每個細胞通過測量區(qū)并被激發(fā)光照射時產(chǎn)生光信號，然后被光電倍增管（PMT）轉(zhuǎn)化成電信號，這些信號可以代表熒光、普通光散射、光吸收或細胞的阻抗等。這些信號可以被測量、存貯、顯示，于是細胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地測定。上述特征可以是細胞的大小、活性，核酸的數(shù)量、酶、抗原等等。儀器還可以根據(jù)所規(guī)定的參量把指定的細胞亞群從整個群體中分選出來。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞儀的原理工作原理,待測細胞被制備成單個細胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進入流動室。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的約束下，細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，成為細胞液柱。液柱與入射的激光束垂直相交，相交點稱為測量區(qū)。通過測量區(qū)的細胞被激發(fā)產(chǎn)生熒光。在與入射光束和液柱垂直的方向放置光學系統(tǒng)（透鏡、光闌，濾片和檢測器等）用以收集熒光信號。光電倍增管將收集的光信號轉(zhuǎn)化為電信號再傳輸至計算機，計算機通過相應的軟件將電信號模擬成圖像。,流動室(FlowCuvette或FlowCell)是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。流動室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央開一個孔徑為350250um的長方形孔，供細胞單個流過，檢測區(qū)在該孔的中心，這種流動室的光學特性良好，流速較慢,因而細胞受照時間長，可收集的細胞信號光通量大，配上廣角收集透鏡，可獲得很高的檢測靈敏度和測量精度。流動室內(nèi)充滿了鞘液,鞘液的作用是將樣品流環(huán)包。鞘液流是一種穩(wěn)定流動的液體，操作人員無法隨意改變其流動的速度,樣品流在鞘流的環(huán)包下形成流體動力學聚焦，使樣品流不會脫離液流的軸線方向，結合樣品噴嘴的特殊結構，從而保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而得到準確的細胞信息（散射光和熒光）。,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,激光，如：488nm,FL2PE,SSC,FSC,液路,電子元件部分,計算機,FL3PerCP,Cy5,FL1FITC,光學接收器,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞儀的構造,流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)激光光源及光束形成系統(tǒng)光學系統(tǒng)（濾光片組）信號檢測與存儲系統(tǒng)顯示、分析系統(tǒng),Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,激光,提供單波長、高強度及穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源，這是因為由于細胞的快速流動，每個細胞經(jīng)過光照區(qū)的時間僅為微秒左右，每個細胞所攜帶熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光信號強弱，與被照射的時間和激發(fā)光的強度有關，因此要求細胞必須達到足夠的光照強度。激光光束在到達流動室前，先經(jīng)過透鏡，將其聚焦，形成幾何尺寸約即短軸稍大于細胞的直徑的光斑。這種橢園形光斑激光能量分布屬正態(tài)分布;為保證樣品中細胞是一個一個分別受到光照并且受照強度十分一致,須將樣本流與激光束正交且相交于激光能量分布峰值處,臺式機FCM的光路調(diào)節(jié)對用戶是封閉的，即安裝時由工程師調(diào)試完畢后,無需用戶作任何調(diào)節(jié),所以用戶操作十分方便。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,光學系統(tǒng),流式細胞儀的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。在流式細胞儀的光學系統(tǒng)中主要光學原件是濾光片，主要分為三類：,長通濾片LP短通濾片SP帶通濾片BP,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,長通濾片,長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500nm以上的光通過，而500nm以下的光吸收或返回。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,短通濾片,與長通濾片相反，特定波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,帶通濾片,帶通濾片可允許相當窄的一波長范圍內(nèi)光通過，一般濾片上有兩個數(shù)，一個為允許通過波長的中心值，另一為允許通過光波段的范圍。如BP500/50表示其允許通過波長范圍為475nm525nm。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,信號檢測與分析,當細胞攜帶熒光素標記物，通過激光照射區(qū)時，受激光激發(fā)，產(chǎn)生代表細胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長的熒光信號，這些信號以細胞為中心，向空間360度立體角發(fā)射，產(chǎn)生散射光和熒光信號,下圖是以激發(fā)光光源波長488nm為例的示意圖：,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,1.散射光信號：散射光分為前向角散射(FSC，F(xiàn)orwardScatter)和側向角散射(SSC，SideScatter)，散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術(如染色)，因此被稱為細胞的物理參數(shù)（或稱固有參數(shù)）。(1)前向角散射：代表細胞體積大小，前向角散射與被測細胞的大小有關，確切說與細胞直徑的平方密切相關，通常在FCM應用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。(2)側向角散射：代表細胞內(nèi)容物多少（或稱為密度），側向角散射是指與激光束正交900方向的散射光信號，側向散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內(nèi)精細結構和顆粒性質(zhì)的信息。,2.熒光信號：當激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下發(fā)出微弱的熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特異熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析就能了解所研究細胞參數(shù)的存在與定量。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,光電倍增管如何產(chǎn)生電壓脈沖信號,電壓脈沖,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,高度、寬度和面積,時間(s),電壓,脈沖面積(A),脈沖高度(H),脈沖寬度(W),40,0,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,脈沖信號的寬度和面積通常用來辨別雙粘體細胞,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,閾值,閾值用來定義能夠被光電倍增管識別的最小或最大信號強度，低于閾值下限或高于閾值上限的信號將不被光電倍增管識別，也不在圖形中顯示。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,熒光信號的線性測量和對數(shù)測量,線性放大：即放大器的輸出與輸入是線性關系，細胞DNA含量、RNA含量、總蛋白質(zhì)含量等的測量一般選用線性放大測量。對數(shù)放大：即放大器的輸出成10倍關系，如果原來輸出是1，當輸入增大到原來10倍時，輸出為2；當輸入增大到原來100倍時輸出是3等等。在免疫學樣品中，細胞膜表面抗原的分布有時要差幾十倍甚至幾萬倍。如果用線性放大將無法在一張圖上清晰地將細胞陽性群、陰性群同時顯示出來。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,流式細胞儀數(shù)據(jù)格式,FCS：幀校驗序列（FCS）字段，通常為16位（2個字節(jié)長），也可以為4個字節(jié)。軟件執(zhí)行中可以通過預先協(xié)議采用32位FCS來提高差錯檢測效果。FCS1.0研發(fā)于1984年FCS2.0研發(fā)于1990年，兼容1.0格式FCS3.0研發(fā)于1997年，兼容前兩者支持UNICODE文本處理單個數(shù)據(jù)文件大于100MB,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,FCS文件結構,存儲于3或4個片段中文件頭信息：用于鑒別FCS文件，包含鑒別文本文件片段的數(shù)值。文本信息：描述樣品信息和狀態(tài)的某些數(shù)值。數(shù)據(jù)：在文本信息中存儲的數(shù)值的特殊格式。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,文件頭信息：文本信息：,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,參數(shù)FSC/SSC/熒光：,第一個細胞,第二個細胞,最后一個細胞,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,數(shù)據(jù)顯示的種類,直方圖散點圖三維圖,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,直方圖（用于單參數(shù)分析）,橫坐標，X軸表示光強度，強度高的光信號靠右側顯示?？v坐標，Y軸表示數(shù)量累計，相同強度的光信號在同一橫坐標點（通道）內(nèi)向Y軸方向累計。,FL1-FITC,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,散點圖（用于雙參數(shù)分析）,橫坐標，X軸表示光強度，強度高的光信號靠右側顯示?？v坐標，Y軸表示光強度，強度高的光信號靠上側顯示。與X軸/Y軸平面900垂直相交，Z軸表示數(shù)量累計，相同強度的光信號在同一橫/縱坐標點（X/Y軸通道）內(nèi)向Z軸方向累計。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,什么是Region？,用戶在顯示的圖形中限定一個區(qū)域或范圍作為靶區(qū)域或范圍叫做Region。在同一張圖中可以設置多個Region。,使感興趣的簇獨立。對Region使用顏色可更好地描述該范圍或區(qū)域。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,什么是Gate？,1.使用布爾數(shù)學體系的操作方法（邏輯學）定義一個或?qū)⒍鄠€Region進行聯(lián)合叫做Gate。2.被定義的子集數(shù)據(jù)將被顯示。3.被選定的子集將被計算機計算數(shù)據(jù)和顯示狀態(tài)。4.解除噪音信號并可以最終被存儲在硬盤上。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,什么是Mean？,1.算術定義的平均值。2.幾何定義的平均值。,假設樣品為V，數(shù)量為n，則：,算術定義的平均值=（V1+V2+V3+Vn)/n幾何定義的平均值=,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,如何取平均值？,線性放大對數(shù)放大對數(shù)放大算術平均值算術平均值幾何平均值,（4*64+6*128+2*192+1*256）/13（4*10+6*100+2*1000+1*10000）/13=128=972.3=100,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,光譜交叉重疊與補償？,當一種激光束激發(fā)兩種熒光染料而發(fā)射出兩種不同波長的熒光時，這兩種發(fā)射光會出現(xiàn)光譜部分重疊的現(xiàn)象，從而造成檢測的準確性下降，必須使用適當?shù)臑V片或進行電子補償來盡量減少光重疊對實驗的影響。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,未做補償R4/R1=41%R3/R1=24.21%R2/R1=34.3%做補償后R4/R1=41.04%R3/R1=24.75%R2/R1=34.22%,補償，我們通常按照細胞聚集區(qū)的中心點來計算，但實際的原理是按細胞團的位置來定的，也就是純粹按照計算得出的，比如上圖的R4細胞團，它在X軸上的位置是0.3到1之間，在Y軸的位置是2到6之間，這團細胞平均值在FL1,FL2中的分部坐標為0.68,3.9;因此斜率為0.68/3.9=17.43，因此FL1的補償后平均值為FL1-17.43%FL2=0.68-17.43%*3.9=0.0023，它的右側區(qū)域應該在1-17.43%*3.9=0.32，左側區(qū)域應該在0.3-17.43%*3.9=-3.79，因為是負數(shù)，就自動歸為0.1了，如果是完全按照計算來做補償，圖形將很大一部分跑出了雙參數(shù)圖，也就是說無法得到我們滿意的圖形，但由于我們勾選了“RandomBias”，所有的圖形將重新被分配，就像上圖的Q1門中的顯示一樣。，我們通常按照細胞聚集區(qū)的中心點來計算，但實際的原理是按細胞團的平均值來計算。,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,FL1-未染色,FL2-未染色,FL1-染色,FL2-未染色,FL1-FITCCD3,補償后,平均值=2.0,FL1-染色,FL2-未染色,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,上機檢測,樣本染色及溶血過程處理完后應立即上機檢測打開流式細胞儀(選擇進行質(zhì)控程序）打開應用軟件并選擇相應的方案或新建方案加載或重新調(diào)節(jié)各參數(shù)上樣檢測,流式細胞儀使用一般方法及技巧,Partec-ExcellenceinFlowCytometry,超過41年的研發(fā)經(jīng)驗,技巧一：定位目標細胞群體,尋找細胞群：如標本為外周血白細胞，在FSC/SSC散點圖中信號最強的為粒細胞，依次為單