醫(yī)學(xué)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)（三）免疫標(biāo)記技術(shù),張蓓,檢測(cè)Ag-Ab的體外實(shí)驗(yàn),1,2,3,凝集反應(yīng),沉淀反應(yīng),免疫標(biāo)記技術(shù),標(biāo)記免疫技術(shù)=,靈敏性,特異性,免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù),常用的免疫標(biāo)記物質(zhì),類(lèi)別標(biāo)記物用途熒光素FITC、RB200、TRITC免疫組化鑭系元素螯合物免疫分析測(cè)定放射性核素3H、14C、32P、57Gr免疫分析測(cè)定125I、131I酶HRP、AP免疫組化免疫分析測(cè)定化學(xué)發(fā)光物L(fēng)uminol、lucigenin免疫分析測(cè)定金屬顆粒膠體金、鐵蛋白免疫組化免疫分析測(cè)定,分類(lèi),主要試劑:酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：免疫學(xué)活性酶對(duì)底物的催化活性,抗原抗體反應(yīng)的特異性,+,酶高效催化反應(yīng)的專(zhuān)一性,ELISA原理及特點(diǎn),特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。,原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析,原理及特點(diǎn),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）雙抗體夾心法（雙位點(diǎn)一步法）測(cè)甲胎蛋白（AFP）,【臨床意義】significanceinclinicalpractise,1、原發(fā)性肝癌的大規(guī)模普查,2、可以用作檢測(cè)胎兒畸形和畸胎瘤,一、ELISA雙抗體夾心法測(cè)AFP原理,用抗AFP抗體包被固相載體，加入待檢標(biāo)本，標(biāo)本中的AFP與固相載體上的抗體結(jié)合，再加入酶標(biāo)記的抗AFP抗體，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加底物顯色，顏色的深淺與相應(yīng)AFP的量呈正相關(guān)。雙位點(diǎn)一步法：包被抗體和酶標(biāo)抗體分別是抗AFP不同位點(diǎn)的McAb,ELISA原理圖,【實(shí)驗(yàn)原理】Experimentsmechanism,principle,抗AFPMcAb抗體,抗AFPMcAb抗體,AFP,雙位點(diǎn)一步法：抗AFP不同位點(diǎn)的McAb,二、試劑材料,1、AFP檢測(cè)試劑盒2、AFP參考標(biāo)準(zhǔn)液（0、25、50、100、200、400ng/ml）。3、DW4、終止液（2MH2SO4）。5、酶標(biāo)測(cè)定儀、37溫箱。6、微量加樣器、滴管、吸水紙等。,三、method,（一）quantitytest1、addsample取包被好的酶標(biāo)孔7孔，進(jìn)行標(biāo)記，第16孔分別加入AFP參考標(biāo)準(zhǔn)夜（0、25、50、100、200、400ng/ml）各100ul。第7孔加入樣品100ul。3720分鐘2、wash：在各孔中加入洗液2滴,輕輕搖動(dòng)幾下,棄之,然后用蒸餾水或自來(lái)水加滿(mǎn)各孔,甩掉,反復(fù)5次,最后在吸水紙上拍干.3、每孔加酶結(jié)合物2滴，3715分鐘。4、wash5、顯色每孔加底物和顯色液各1滴，輕輕振搖，室溫避光反應(yīng)5分鐘，加入2滴終止液終止反應(yīng)。5、酶標(biāo)儀450nm比色，計(jì)算結(jié)果。,（二）qualitytest1Addsample取包被好的酶標(biāo)板3各孔，分別加入陰性對(duì)照（25ng/ml）、陽(yáng)性對(duì)照（400ng/ml）和待檢標(biāo)本各100ul3720分鐘。2、wash：在各孔中加入洗液2滴,輕輕搖動(dòng)幾下,棄之,然后用蒸餾水或自來(lái)水加滿(mǎn)各孔,甩掉,反復(fù)5次,最后在吸水紙上拍干.3、每孔加酶結(jié)合物2滴，3715分鐘。4、wash5、顯色每孔加底物和顯色液各1滴，輕輕振搖，室溫避光反應(yīng)5分鐘，加入2滴終止液終止反應(yīng)。,四、result,1Quantitytest用酶標(biāo)儀進(jìn)行比色，以0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)孔為空白孔，在波長(zhǎng)450nm處分別讀取各標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔OD值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，AFP含量為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以測(cè)定孔的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出相應(yīng)標(biāo)本的AFP含量。2Qualitytest在白色背景上直接肉眼觀察結(jié)果。陰性對(duì)照孔應(yīng)基本無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔呈深藍(lán)色。若待檢樣品孔色澤深于陽(yáng)性對(duì)照孔則AFP400ng/ml，陽(yáng)性；若待檢樣品孔色澤深于陰性對(duì)照孔而淺于陽(yáng)性對(duì)照孔則20ng/mlAFP400ng/ml，弱陽(yáng)性；待檢樣品孔色澤淺于陰性對(duì)照孔則AFP20ng/ml，陰性。參考范圍：正常成人AFP含量20ng/ml。,【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】Experimentsresults,若待檢孔顯色淺于或等于陰性對(duì)照判定為若待檢孔顯色深于或等于陽(yáng)