1、飼料中粗蛋白的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^飼料樣品中粗蛋白的測(cè)定，掌握飼料粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法。二、適用范圍本方法適用于配合飼料、濃縮飼料和單一飼料。三、實(shí)驗(yàn)原理凱氏法測(cè)定試樣中的含氮量，即在催化劑作用下，用濃硫酸破壞有機(jī)物，使含氮物轉(zhuǎn)化成硫酸銨。加入強(qiáng)堿進(jìn)行蒸餾使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，測(cè)出氮含量，將結(jié)果乘以換算系數(shù)6.25，計(jì)算出粗蛋白含量。四、試劑（1）硫酸：化學(xué)純，含量為98%，無氮。（2）混合催化劑：0.4g硫酸銅，5個(gè)結(jié)晶水；6g硫酸鉀或硫酸鈉，均為化學(xué)純，磨碎混勻。（3）氫氧化鈉：化學(xué)純，40%水溶液（m/V）。（4）硼酸：化學(xué)純，2%水溶液（m/V）。（5）混合指標(biāo)劑：甲基

2、紅0.1%乙醇溶液，溴甲酚綠0.5%乙醇溶液，兩溶液等體積混合，在陰涼處保存期為3個(gè)月。（6）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：基準(zhǔn)無水碳酸鈉法標(biāo)定； 0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 8.3mL鹽酸注入1000ml蒸餾水中。 0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液： 1.67mL鹽酸注入1000ml蒸餾水中。（7）蔗糖：分析純。（8）硫酸銨：分析純，干燥。（9）硼酸吸收液：1%硼酸水溶液1000mL，加入0.1%溴甲酚綠乙醇溶液10mL，0.1%甲基紅乙醇溶液7mL，4%氫氧化鈉水溶液0.5mL，混合，置陰涼處保存期為1個(gè)月（全自動(dòng)程序用）。五、儀器設(shè)備（1）實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或研缽。（2）分樣篩：孔徑0.45mm（40

3、目）。（3）分析天平：感量0.0001g。（4）消煮爐或電爐。（5）滴定管：酸式，10、25mL。（6）凱氏燒瓶：250mL。（7）凱氏蒸餾裝置：常量直接蒸餾式或半微量水蒸汽蒸餾式。（8）錐形瓶：150、250mL。（9）容量瓶：100mL。（10）消煮管：250mL。（11）定氮儀：以凱氏原理制造的各類型半自動(dòng)、全自動(dòng)蛋白質(zhì)測(cè)定儀。六、分析步驟試樣的選取和制備: 選取具有代表性的試樣用四分法縮減至200g，粉碎后全部通過40目篩，裝于密封容器中，防止試樣成分的變化。（1）仲裁法試樣的消煮稱取試樣0.51g（含氮量580mg）準(zhǔn)確至0.0002g，放入凱氏燒瓶中，加入6.4g混合催化劑，與試樣

4、混合均勻，再加入12mL硫酸和2粒玻璃珠，將凱氏燒瓶置于電爐上加熱，開始小火，待樣品焦化，泡沫消失后，再加強(qiáng)火力（360410）直至呈透明的藍(lán)綠色，然后再繼續(xù)加熱，至少2h。氨的蒸餾A. 常量蒸餾法將試樣消煮液冷卻，加入60100ml蒸餾水，搖勻，冷卻。將蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有25mL硼酸吸收液和2滴混合指示劑的錐形瓶?jī)?nèi)。然后小心地向凱氏燒瓶中加入50mL氫氧化鈉溶液，輕輕搖動(dòng)凱氏燒瓶，使溶液混勻后再加熱蒸餾，直至流出液體體積為100mL。降下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續(xù)蒸餾12min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐形瓶?jī)?nèi)，然后停止蒸餾。B. 半微量蒸餾法將試樣消煮液冷卻

5、，加入20mL蒸餾水，轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，做為試樣分解液。將半微量蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有20mL硼酸吸收液和2滴混合指示劑的錐形瓶?jī)?nèi)。蒸汽發(fā)生器的水中應(yīng)加入甲基紅指示劑數(shù)滴，硫酸數(shù)滴，在蒸餾過程中保持此液為橙紅色，否則需補(bǔ)加硫酸。準(zhǔn)確移取試樣分解液1020mL注入蒸餾裝置的反應(yīng)室中，用少量蒸餾水沖洗進(jìn)樣入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應(yīng)室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水密封，防止漏氣。蒸餾4min降下錐形瓶使冷管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶?jī)?nèi)，然后停止蒸餾。注：上述兩種蒸

6、餾法測(cè)定結(jié)果相近，可任選一種。C. 蒸餾步驟的檢驗(yàn)精確稱取0.2g硫酸銨，代替試樣，分別按上述兩種步驟進(jìn)行操作，測(cè)得硫酸銨含量為21.190.2%，否則應(yīng)檢查加堿、蒸餾和滴定各步驟是否正確。滴定蒸餾后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。（2）推薦法試樣的消煮稱取0.51g試樣（含氮量580mg）準(zhǔn)確至0.0002g，放入消化管中，加2片消化片（儀器自備）或6.4g混合催化劑，12mL硫酸，于420下的消煮爐上消化1h。取出放涼后加入30mL蒸餾水。氨的蒸餾采用全自動(dòng)定氮儀時(shí)，按儀器本身常量程序進(jìn)行測(cè)定。采用半自動(dòng)定氮儀時(shí)，將帶消化液

7、的管子插在蒸餾裝置上，以25mL硼酸為吸收液，加入2滴混合指示劑，蒸餾裝置的冷凝管末端要浸入裝有吸收液的錐形瓶?jī)?nèi)，然后向消煮管中加入50mL氫氧化鈉溶液進(jìn)行蒸餾。蒸餾時(shí)間以吸收液體積達(dá)到100mL時(shí)為宜。降下錐形瓶，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均需流入錐瓶?jī)?nèi)。滴定用0.1mol/L的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定吸收液，溶液由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。7空白測(cè)定 稱取蔗糖0.5g，代替試樣，進(jìn)行空白測(cè)定，消耗0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積不得超過0.2mL。消耗0.02mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積不得超過0.3mL。八、分析結(jié)果的表述計(jì)算見下式：式中：V2滴定試樣時(shí)所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL； V1滴定空白時(shí)

8、所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積，mL； c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L； m試樣質(zhì)量，g； V試樣分解液總體積，mL； V試樣分解液蒸餾用體積，mL； 0.0140與1.00mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液c（HCI）=1.0000mol/L相當(dāng)?shù)?、以克表示的氮的質(zhì)量。 6.25氮換算成蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。九、重復(fù)性每個(gè)試樣取兩個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定，以其算術(shù)平均值為結(jié)果。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在25%以上時(shí)，允許相對(duì)偏差為1%。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%25%之間時(shí)，允許相對(duì)偏差為2%。當(dāng)粗蛋白質(zhì)含量在10%以下時(shí)，允許相對(duì)偏差為3%。十、注意事項(xiàng)（1）每次測(cè)定樣本時(shí)必須作試劑空白試驗(yàn)。（2）凱氏蒸餾在排廢液和沖洗反應(yīng)室時(shí)，切斷氣源的時(shí)間

9、不要太長(zhǎng)，否則，會(huì)造成蒸汽發(fā)生器中壓力過大，產(chǎn)生不良的后果。（3）在使用蒸餾器時(shí)必須進(jìn)行檢查。檢查的方法是：吸取5 mL 0.005mol/L的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，放入到反應(yīng)室中，加飽和氫氧化鈉溶液，然后進(jìn)行蒸餾，過程和樣本消化相同。滴定硫酸銨蒸餾液所需0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)量減去空白樣消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的量是5mL，這個(gè)蒸餾裝置才合標(biāo)準(zhǔn)。（4）消化時(shí)如果有黑炭粒不能全部消失，燒瓶冷卻后加少量的濃硫酸繼續(xù)加熱，直到溶液澄清為止。十一、其他說明其原因是稱取樣本量不多，耗用試劑量較少，用于樣本消化和蒸餾的時(shí)間較短。凱氏大量定氮法亦在某些情況下被采用，其原理與凱氏半微量定氮法相同。前法備有凱氏蒸餾架，凱

10、氏燒瓶（常用250 mL或500 mL）中樣本消化完畢后，即可加入200 mL蒸餾水，直接裝置在凱氏蒸餾架上全部蒸餾，不須將凱氏燒瓶中消化液轉(zhuǎn)移入容量瓶?jī)?nèi)，而后再吸取部分稀釋液進(jìn)行蒸餾等手續(xù)，這是凱氏大量定氮法的優(yōu)越性。這個(gè)方法適用于測(cè)定鮮肉、鮮糞與羊毛中粗蛋白質(zhì)。說明2：在凱氏定氮法中Meeker和Wagner兩氏（Ind.Eng.Chen.,Anal.Ed.5:396,1933）用1%硼酸液10 mL替代10 mL0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液。量取1%硼酸可用普通量筒，因?yàn)榕鹚崤c氨的作用僅是一個(gè)簡(jiǎn)單的結(jié)合，消化液蒸餾后即可直接用0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定蒸餾物。說明3：各種飼料的粗蛋白質(zhì)中氮的含量，

11、差異很大，變異范圍約在14.7-19.5%之間，平均為16%。凡飼料的粗蛋白質(zhì)中實(shí)際含氮量尚未確定的，可用6.25平均系數(shù)乘以含氮量換算成粗蛋白質(zhì)含量。凡飼料粗蛋白質(zhì)中實(shí)際含氮量已經(jīng)確定的，可用它們的實(shí)際系數(shù)來換算。例如蕎麥、玉米系數(shù)6.00，箭舌豌豆、大豆、蠶豆、燕麥、小麥、黑麥用系數(shù)5.70，牛奶用系數(shù)6.38。說明4：CH3CHNH2COOH為-氨基丙酸，代表飼料粗蛋白質(zhì)分解后的一種簡(jiǎn)單氨基酸，是飼料中有機(jī)態(tài)氮物質(zhì)的來源之一。說明5：現(xiàn)在分析飼料的粗蛋白質(zhì)一般多用凱氏半微量定氮法。由于飼料的粗蛋白質(zhì)含量差異較大，最多的可達(dá)80%，最少的僅有1%左右。因此，稱取供消化的風(fēng)干或半干樣本重量、稀釋消化液的容量及吸取供蒸餾的稀釋消化液的容量，均須根據(jù)樣本粗蛋白質(zhì)含量的多少而調(diào)整，使最后滴定的0.01N標(biāo)準(zhǔn)鹽酸液消耗量在5 mL之內(nèi),便于使用微量滴定管而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。在飼養(yǎng)試驗(yàn)中測(cè)定鮮肉、整個(gè)雞體或羊毛的粗蛋白質(zhì)含量時(shí)，為保證采樣的代表性，可稱取10 g鮮畜體樣本，用濾紙包裹后放入250 mL凱氏燒瓶中，再加0.5 g硫酸銅，810g無水硫酸鈉和30 mL濃硫酸，加熱消化34小時(shí)。消化液稀釋至250 mL，再吸取5 mL消化液蒸餾，這樣約耗用30 mL0.02N標(biāo)準(zhǔn)HCL液。測(cè)定家畜糞樣粗蛋白質(zhì)含量時(shí)，可取2.5 g干樣或510 g濕樣，加入0.5 g硫酸銅，8-1