1、病毒宏基因組學(xué)概述及其應(yīng)用研究背景宏基因組學(xué)簡(jiǎn)介病毒宏基因組學(xué)研究策略與技術(shù)路線研究成果與前景展望Here We Go！第1頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16一大難題virus Avirus Bvirus CBACTERIAvirus D在人類生產(chǎn)生活中，致病的微生物眾多，其中病毒性疾病占據(jù)大多數(shù)，而現(xiàn)有的診斷方法不可能囊括所有的病毒。因此，從宏觀上把握致病性病毒的潛在數(shù)量種類以及致病機(jī)理變得尤為重要。第2頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16案例1：Electron micrographs of the human fecal sample. (a) Rod-shaped particles neg

2、atively stained with potassium phosphotungstate in 2003. (b) Icosahedral (open arrows)and short rod-shaped particles (filled arrow) recently stained with ammonium molybdate, from the second fraction of the sucrose gradient. Scale bars = 50 nm.2013年6月巴西圣保羅阿道夫魯茨研究所的西爾瓦娜等人利用病毒宏基因組學(xué)對(duì)人面部潛在微生物進(jìn)行研究。案例2：200

3、2年Breitbart應(yīng)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法（shotgun sequencing）首次對(duì)美國(guó)加州海岸的2處海洋中病毒群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個(gè)潛在的新病毒。遺憾的是無(wú)法對(duì)其進(jìn)行歸類。兩個(gè)案例第3頁(yè)/共24頁(yè)病毒宏基因組學(xué)何以橫空出世四大瓶頸很多病毒缺乏特異的細(xì)胞系或者生長(zhǎng)過(guò)程中觀察不到細(xì)胞病變(CPE)。用電鏡來(lái)觀察病毒其靈敏性相對(duì)較低。血清學(xué)反應(yīng)，高效的特異性抗體很難獲得，有的出現(xiàn)交叉反應(yīng)而影響結(jié)果。PCR法必須基于基因序列，對(duì)于未知序列的病 毒和變異性大的病毒此法難以實(shí)施。第4頁(yè)/共24頁(yè)宏基因組學(xué) 宏基因組學(xué)研究的對(duì)象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和，它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微

4、生物的基因總和。研究熱點(diǎn)：細(xì)菌和病毒宏基因組學(xué)。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體, 自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。宏基因組學(xué)(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個(gè)整體, 自上而下地研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關(guān)系。第5頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16病毒宏基因組學(xué)病毒宏基因組學(xué)：宏基因組學(xué)的一分支，指研究特定環(huán)境中的病毒群落一門(mén)學(xué)科。應(yīng)用解釋未知病因挖掘新的活性物質(zhì)分析特定環(huán)境中的病毒群落發(fā)掘潛在的新的病毒性疾病第6頁(yè)/共24頁(yè)病毒宏基因組學(xué) 2005年,Edwards首次提到病毒宏基因組學(xué)這

5、一概念，其描述的是環(huán)境中的病毒群落噬菌體。 2007 年, Delwart 再次提到病毒宏基因組學(xué)這一概念,并對(duì)宏基因組學(xué)挖掘新病毒的方法進(jìn)行了闡述； 該文側(cè)重于人和動(dòng)物機(jī)體中的真核病毒群落。 最早應(yīng)用宏基因組學(xué)理論分析病毒群落的科學(xué)家是Breitbart教授，他于2002年應(yīng)用鳥(niǎo)槍測(cè)序法（shotgun sequencing）首次對(duì)美國(guó)加州海岸的2處海洋中病毒群體進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)374-7114個(gè)潛在的新病毒。 2006年，Zhang等應(yīng)用宏基因組學(xué)在人的糞便中發(fā)現(xiàn)了大量的植物病毒。 2010 年，Li 等分析了蝙蝠糞便中的病毒群落。該研究發(fā)現(xiàn)了大量新的哺乳動(dòng)物病毒和昆蟲(chóng)病毒。第7頁(yè)/共24頁(yè)

6、2021-11-16研究策略與技術(shù)路線樣品的處理遺傳物質(zhì)的分離與富集構(gòu)建文庫(kù)宏基因組學(xué)文庫(kù)的篩選序列分析第8頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線解凍稀釋離心過(guò)濾消化樣品的處理VIS:Very Important Step第9頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線PCR 產(chǎn)物的純化PCR 擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄 雙鏈 cDNA 合成DNARNA遺傳物質(zhì)的分離與富集第10頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)基因組cDNA文庫(kù)：cDNA文庫(kù)中的外源DNA片段，是互補(bǔ)DNA。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反

7、轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈cDNA ?；蚪MDNA文庫(kù)：將生物體的全部基因組用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度的DNA片段，與合適載體體外轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞所獲得的陽(yáng)性菌落?；蛭膸?kù)：某個(gè)生物的基因組DNA或cDNA片段與適當(dāng)?shù)妮d體在體外通過(guò)重組后，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞，并通過(guò)一定的選擇機(jī)制篩選后得到大量的陽(yáng)性菌落(或噬菌體),所有的菌落或噬菌體的集合。第11頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16基因組文庫(kù)和部分基因文庫(kù)的關(guān)系文庫(kù)的構(gòu)建第12頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)宏基因組學(xué)文庫(kù)篩選方法和研究目的的不同，構(gòu)建宏基因組學(xué)文庫(kù)的載體和方法也各有不同。構(gòu)建的宏基因組學(xué)文庫(kù)分為載體克

8、隆文庫(kù)和基于新一代測(cè)序技術(shù)的加接頭的文庫(kù)。常用構(gòu)建文庫(kù)的載體為：大片段插入載體細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC）和粘粒（coamid）載體、表達(dá)載體(pBluescript SK+)、穿梭載體(Cosmid pOS700)及普通克隆T載體。第13頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線 載體的制備。 高純度大分子量基因組 DNA的提取。 高質(zhì)量大相對(duì)分子質(zhì)量 DNA 的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離。 載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。 重組克隆的挑取和保存。 基因組 DNA 文庫(kù)的構(gòu)建程序：連接轉(zhuǎn)化篩選陽(yáng)性克隆第14頁(yè)/共2

9、4頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線連接目的基因載體載體的種類 可裝載的外源DNA質(zhì)粒（plasmid） 10kb噬菌體（ phage） 0-23kb粘粒載體（cosmid） 45kb細(xì)菌人工染色體BAC 100kb酵母人工染色體YAC 300kb-1.2Mb 雖然載體種類眾多，但基于研究的目的基因大小以及相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，質(zhì)粒載體和BAC的選用較為頻繁。第15頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線宿主選擇-常用的宿主主要有大腸埃希菌以及鏈霉菌屬或假單胞菌屬。轉(zhuǎn)化宿主DH5 E. Coli陽(yáng)性克隆的篩選涂布氨芐抗性平板37倒置培養(yǎng)菌液PCRAGE測(cè)序與序列分析：選取大小不等的片

10、段測(cè)序，分析測(cè)序的結(jié)果質(zhì)量，將測(cè)序波峰良好的序列進(jìn)行載體和引物的去除及拼接。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，應(yīng)用blastn和blastx工具，分別進(jìn)行核苷酸序列和6框架閱讀翻譯的氨基酸序列比對(duì)。第16頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線基因組cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建： 第一，細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；第二，第一鏈cDNA 合成；第三，第二鏈cDNA 合成；第四，雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體，并導(dǎo)入宿主中增殖。第17頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16總RNA Oligo(dt)纖維素柱或磁珠分離5AAAAOligo(dt)+reverse transcriptasemRNA5AAAA

11、DNA3TTTTRNase H5AAAADNA ploymeraseDAN ligase3TTTTTdT加尾5AAAA33TTTT55AAAACCCCCCCC5第一步：mRNA的分離。第二步：第一條cDNA鏈的合成。第三步：第二條cDNA鏈的合成。第四步：克隆雙鏈cDNA至載體并導(dǎo)入E.coli第18頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究策略與技術(shù)路線篩選宏基因組學(xué)文庫(kù)的技術(shù)功能性篩選法底物誘導(dǎo)基因表達(dá)法穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法熒光原位雜交技術(shù)法能有效的篩選到具有活性的物質(zhì)和新型抗生素。受限于表達(dá)型的宿主菌株、工作量大及效率低。直接測(cè)序法序列拼接-拼接的contigs或者單序列通過(guò)不同的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行

12、核苷酸和氨基酸的比對(duì)-篩選有用的目的信息。羅氏公司454焦磷酸測(cè)序技術(shù)和Illumina公司推出的Solexa測(cè)序技術(shù)高通量測(cè)序第19頁(yè)/共24頁(yè)2021-11-16研究成果與前景展望在我國(guó)腹瀉兒童糞便中首次發(fā)現(xiàn)HBoV2、HPeV、Aichi virus、Klassevirus/salivirus和Human cosavirus 等新發(fā)病毒（單同領(lǐng)，2011）。在美國(guó)豬群中發(fā)現(xiàn)了kubovirus,sapovirus,sapelvirus,豬腸道病毒9和豬腸道病毒10，星狀病毒，Teschovirus，PBoV3,環(huán)病毒，新的微小核酸RNA病毒等。其中星狀病毒和 PBoV3為新的種；環(huán)病毒、

13、Rosavirus1 和Rosavirus1 可能為的新的病毒屬或者新的病毒科（單同領(lǐng)，2011）。對(duì)患有腸道病毒性腸炎的火雞群，進(jìn)行病毒宏基因組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了大量的呼腸孤病毒、小病毒、星狀病毒等，系統(tǒng)描述了多種病毒共同感染火雞，導(dǎo)致火雞生產(chǎn)性能降低的可能性（Day，2010）。對(duì)采集北美的蝙蝠糞便進(jìn)行病毒組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蝙蝠體內(nèi)攜帶的病毒種類十分豐富，不僅含有大量的動(dòng)物病毒，而且還有植物和昆蟲(chóng)病毒（Li，Donaldson，2010）。應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析我國(guó)腹瀉仔豬糞便內(nèi)的病毒群落，初步鑒定出此次腹瀉的主要病因?yàn)樽儺怭EDV；分離和鑒定1 株變異PEDV（JS-2013），其可作為研發(fā)疫苗的候選毒株（單同領(lǐng)，童光志，2013）。第20頁(yè)/共24頁(yè)前景展望前景展望面臨的挑戰(zhàn) 運(yùn)用病毒宏基因組學(xué)，已經(jīng)成功地從多種環(huán)境樣品中鑒定出多種病毒，使人們了解到不同環(huán)境的病毒構(gòu)成，從而更科學(xué)地防制病毒的侵染。 描繪出一些中間宿主的病毒攜帶情況，這不僅豐富了病毒庫(kù)，而且增加了對(duì)病毒多樣性和分布的了解。 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)一些致病性病毒和潛在致病性病