1、生物藥物分析生物藥物分析第三章第三章 免疫分析法免疫分析法一、一、概述概述二、二、抗原抗原三、三、抗體與免疫反應(yīng)抗體與免疫反應(yīng)四、四、免疫分析方法及應(yīng)用免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容一、一、概述概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容 免疫學(xué)是研究免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，了解其在免疫應(yīng)答反應(yīng)中對(duì)機(jī)體有益的防衛(wèi)功能和有害的病理?yè)p傷的機(jī)制，研究有效的免疫措施，實(shí)現(xiàn)以防病，治病為目的的一門(mén)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)學(xué)科。一、概述一、概述 什么叫免疫分析？什么叫免疫分析？ 基于抗原和抗體的特異性反應(yīng)基于抗原和抗體的特異性反

2、應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)的一種技術(shù)手段?？乖贵w反應(yīng)是指抗原與相應(yīng)的抗體之間發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。它既可以發(fā)生在體內(nèi)，也可以發(fā)生在體外。 在體內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)為體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)作用。體外的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)主要用于抗原或抗體的檢測(cè)，用于免疫學(xué)診斷。(1) 在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中在實(shí)驗(yàn)藥物動(dòng)力學(xué)和臨床藥物學(xué)中，測(cè)定生物利用度和藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)等生物藥劑學(xué)中的重要數(shù)據(jù)，以便了解藥物在體內(nèi)的吸收、分解、代謝和排泄情況；(2) 在藥物的臨床檢測(cè)中在藥物的臨床檢測(cè)中，對(duì)治療指數(shù)小、超過(guò)安全劑量易發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)或最佳治療濃度和毒性反應(yīng)濃度有交叉的藥物血液濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)；(3) 在藥物生產(chǎn)中在藥物生產(chǎn)中，從

3、發(fā)酵液或細(xì)胞培養(yǎng)液中快速測(cè)定有效組分的含量，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生產(chǎn)過(guò)程的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)；(4) 對(duì)藥品中是否存在特定的微量有害雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。在藥物分析中，免疫分析法的在藥物分析中，免疫分析法的應(yīng)用主要集中在以下幾方面：應(yīng)用主要集中在以下幾方面：免疫分析免疫分析： 利用抗原與抗體的特異性結(jié)合作用，來(lái)選擇性識(shí)別和測(cè)定，可以作為抗體或抗原的待測(cè)物.免疫分析方法免疫分析方法非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化非標(biāo)記免疫分析（抗原抗體結(jié)合理化性質(zhì)發(fā)生變化）標(biāo)記免疫分析標(biāo)記免疫分析標(biāo)記物標(biāo)記物有無(wú)有無(wú)非放射免疫分析非放射免疫分析放射免疫分析（放射污染）放射免疫分析（放射污染）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析熒光免疫分析熒

4、光免疫分析電化學(xué)免疫分析電化學(xué)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析免疫分析免疫分析免疫分析檢測(cè)的發(fā)展免疫分析檢測(cè)的發(fā)展放射免疫檢測(cè)放射免疫檢測(cè)（興起于（興起于2020世紀(jì)世紀(jì)7070年代年代) )酶聯(lián)免疫檢測(cè)酶聯(lián)免疫檢測(cè)（興起于（興起于2020世紀(jì)世紀(jì)8080年代，年代，各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；各臨床機(jī)構(gòu)普遍使用）；以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免以化學(xué)發(fā)光為代表的光生物學(xué)標(biāo)記及免疫檢測(cè)技術(shù)疫檢測(cè)技術(shù)（2020世紀(jì)世紀(jì)9090年代開(kāi)始推廣使年代開(kāi)始推廣使用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。用，產(chǎn)品步入成長(zhǎng)期）三個(gè)階段。 特點(diǎn)特點(diǎn)可逆性可逆性比例性比例性反應(yīng)階段性反應(yīng)階段性特異性特異性免疫分析法的

5、特點(diǎn)免疫分析法的特點(diǎn)特異性特異性特異性特異性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性：抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專(zhuān)一性分子基礎(chǔ)分子基礎(chǔ): :抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間抗原表位與抗體分子高變區(qū)之間空間構(gòu)型的互補(bǔ)性空間構(gòu)型的互補(bǔ)性可逆性可逆性可逆性：可逆性：抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離抗原與抗體，件下又可解離為游離抗原與抗體，解離后的抗原或抗解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。影響因素：影響因素： 抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越抗體對(duì)相應(yīng)抗原的親合力親合力越高，結(jié)合越牢固，越不易解離牢固，越不易解離 環(huán)

6、境因素對(duì)復(fù)合物的影響環(huán)境因素對(duì)復(fù)合物的影響pH、離子強(qiáng)度、離子強(qiáng)度 比例性和比例性和反應(yīng)階段性反應(yīng)階段性比例性：比例性：抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)需遵循一定的量比關(guān)系量比關(guān)系前帶前帶(prezone)：抗體過(guò)量：抗體過(guò)量后帶后帶(postzone)：抗原過(guò)量：抗原過(guò)量等價(jià)帶等價(jià)帶(equivalence zone)：抗原抗體比例合適：抗原抗體比例合適 一、概述一、概述二、二、抗原抗原三、抗體與免疫反應(yīng)三、抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容2.1 定義定義 抗原（抗原（antigen）：）：指在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)的物

7、質(zhì)。 免疫原性（immunogenicity）：被注射入動(dòng)物體內(nèi)后，使其產(chǎn)生循環(huán)抗體或改變免疫細(xì)胞產(chǎn)生循環(huán)抗體或改變免疫細(xì)胞的反應(yīng)性 抗原特異性（antigenic specificity）：具有能與特異與特異抗體作用抗體作用的性質(zhì) 全抗原（complete antigen） 半抗原（hapten）：只能與特異抗體作用，但不引起機(jī)體免疫應(yīng)答的分子2.2 藥物分子的抗原性藥物分子的抗原性 1、藥物分子的免疫原性、藥物分子的免疫原性 大多數(shù)的藥物分子通常都是半抗原； 一些蛋白類(lèi)藥物、多肽類(lèi)藥物、激素類(lèi)藥物也是完全抗原。 2、藥物分子的抗原特異性、藥物分子的抗原特異性 藥物分子和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后，抗

8、原特異性可能會(huì)發(fā)生改變。 3、藥物分析中，為了得到高效價(jià)的抗血清，通常會(huì)與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原與蛋白質(zhì)載體合成人工抗原進(jìn)行試驗(yàn)。 常用載體：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破傷風(fēng)類(lèi)毒素（TT）、鑰孔蛋白（KLH）等。（1）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)）半抗原和載體結(jié)合的化學(xué)反應(yīng) 多肽類(lèi)激素多肽類(lèi)激素：活化蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基形成肽鍵；與蛋白質(zhì)或多肽的游離羧基縮合形成肽鍵 甾體甾體：通過(guò)含游離羧基的甾體衍生物與載體蛋白相連 抗生素抗生素：-內(nèi)酰胺環(huán)在偏堿性條件下可以與蛋白質(zhì)的自由氨基以酰胺鍵的形式共價(jià)結(jié)合；氨基糖苷類(lèi)抗生素用碳化二亞胺為連接劑實(shí)現(xiàn)藥物和載體蛋白的連接（2）半抗原和載

9、體的選擇原則）半抗原和載體的選擇原則 半抗原半抗原：最好含有芳香結(jié)構(gòu)；應(yīng)考慮抗原抗體反應(yīng)的微環(huán)境；合理利用分子類(lèi)似物之間的交叉反應(yīng)。 載體載體：載體對(duì)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的影響；載體效應(yīng)在免疫過(guò)程中的影響。（3）合成抗原的測(cè)定 定性測(cè)定方法定性測(cè)定方法：光譜分析、熱力學(xué)分析 定量測(cè)定方法定量測(cè)定方法：相對(duì)含量測(cè)定；絕對(duì)含量測(cè)定。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、三、抗體與免疫反應(yīng)抗體與免疫反應(yīng)四、免疫分析方法及應(yīng)用四、免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容免疫分析實(shí)際上是一種特殊的試劑分析，特點(diǎn)是抗體成為分析試劑抗體成為分析試劑。 1、抗體的結(jié)構(gòu)與功能抗體泛指與待測(cè)分子特異性結(jié)合的蛋泛指與待測(cè)分子特異性結(jié)合

10、的蛋白質(zhì)分子白質(zhì)分子，包括免疫球蛋白（immunoglobulin）, 受體（receptor）和其他結(jié)合蛋白質(zhì)，主要是免疫球蛋白，常用的是IgG分子 . 免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu) IgG分子基本結(jié)構(gòu)是由四個(gè)肽鏈組成的，二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈?zhǔn)怯啥蜴I連接形成，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。 抗體的基本結(jié)構(gòu) IgG分子由四條多肽鏈四條多肽鏈構(gòu)成，以二硫鍵相連以二硫鍵相連，有三個(gè)功能區(qū)。 抗體在Fab區(qū)結(jié)合抗原分子，同時(shí)通過(guò)hi區(qū)的轉(zhuǎn)動(dòng)以適應(yīng)不同距離的抗原決定簇。 與抗原結(jié)合后，IgG分子構(gòu)象改變，暴露出Fc上的活性位點(diǎn)，從而表現(xiàn)出固定和激活補(bǔ)體以及粘結(jié)單核細(xì)胞等親細(xì)胞反應(yīng)

11、的功能。Fab：抗原結(jié)合片段：抗原結(jié)合片段Fc：可結(jié)晶片段：可結(jié)晶片段胃蛋白酶（pepsin）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（C端） 裂解片段，F(xiàn)（ab）2，無(wú)Fc片段 與抗原結(jié)合可發(fā)生凝集反應(yīng) 木瓜蛋白酶（papain）水解片段 裂解部位，鉸鏈區(qū)H鏈間二硫鍵（N端） 裂解片段，2個(gè)Fab（54KD），一個(gè)Fc（50KD）,Fab與抗原結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)。 2抗體作為分析試劑的評(píng)價(jià)抗體作為分析試劑的評(píng)價(jià) 抗體的特異性抗體的特異性是無(wú)與倫比的，不需或只需要簡(jiǎn)單的預(yù)處理。有較高的穩(wěn)定性較高的穩(wěn)定性。 這兩點(diǎn)奠定了分析免疫高度靈敏和高度專(zhuān)一的基礎(chǔ)。 此外，抗體還有一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì)：每個(gè)抗體分

12、子有兩個(gè)抗原的結(jié)合點(diǎn)，即多價(jià)性。然而抗體缺乏高靈敏試劑應(yīng)具備的分析信號(hào)反差。 3、抗體的制備、抗體的制備 （1）常規(guī)抗血清（多克隆抗體多克隆抗體）：指人工被動(dòng)免疫后制成的多克隆抗體，是免疫分析中的重要工具。 免疫原的制備、動(dòng)物免疫、放血、抗血清分離及抗血清的分析鑒定。免疫原的制備免疫原的制備 免疫原由質(zhì)量好的抗原與佐劑制成。通常有免疫原水劑、福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。 水劑由無(wú)菌生理鹽水將抗原制成一定濃度的免疫原。 弗氏佐劑是由一定量的羊毛脂和石蠟油，以及一定濃度的分支桿菌混合而成，經(jīng)研磨達(dá)到油包水的程度。 不完全福氏佐劑即不含有分支桿菌。動(dòng)物免疫動(dòng)物免疫 通常的免疫動(dòng)物為家兔和羊。 免疫

13、的部位多采用腳掌、腹股溝淋巴結(jié)、大腿肌肉、皮下多點(diǎn)、靜脈。 免疫抗原量通常為110mg或50100mg。試血及效價(jià)測(cè)定試血及效價(jià)測(cè)定 家兔的試血通常可由耳緣靜脈取血，取血量0.5ml。 不同稀釋度的抗血清和1%的血細(xì)胞懸液按1:1混合，37保溫2h后觀測(cè)血細(xì)胞的凝聚情況，即可測(cè)得免疫血清的效價(jià)。（2）單克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體是建立在經(jīng)細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤細(xì)胞基礎(chǔ)上的。所獲得的抗體具有均一的特異性。 高度均質(zhì)性的特異性抗體，由一個(gè)識(shí)別單一抗原表位的B細(xì)胞克隆所分泌。一般來(lái)自雜交瘤細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng)法 & 接種動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法制備步驟制備步驟2、抗體的純化 利用化學(xué)方法提純或濃縮某一類(lèi)

14、的免疫球蛋白。 利用免疫吸附劑和親和色譜得到免疫學(xué)上專(zhuān)一性的抗體。3、特異性抗體的篩選與效價(jià)測(cè)定、特異性抗體的篩選與效價(jià)測(cè)定 抗體的效價(jià)抗體的效價(jià)又稱(chēng)滴度，指某一物質(zhì)與一定容量的另一物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)所需要的量。 免疫分析中，免疫血清中抗體的效價(jià)指將血清稀釋?zhuān)瑴y(cè)定與一定的抗原能發(fā)生反應(yīng)的最大稀釋度，此最大稀釋度即為血清的效價(jià)。 常用的效價(jià)測(cè)定方法有免疫擴(kuò)散法、間接血凝法和ELISA法等。一、概述一、概述二、抗原二、抗原三、抗體與免疫反應(yīng)三、抗體與免疫反應(yīng)四、四、免疫分析方法及應(yīng)用免疫分析方法及應(yīng)用主要內(nèi)容主要內(nèi)容四、免疫分析方法及其應(yīng)用四、免疫分析方法及其應(yīng)用 放射免疫分析法（放射免疫分析法（RIA

15、） 熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（FIA） 克隆酶給予體免疫分析法（克隆酶給予體免疫分析法（CEDIA） 酶聯(lián)免疫吸附分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）放射免疫分析法（放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA） 1968年年Miles和和Hales建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作建立了免疫放射分析方法，利用標(biāo)記抗體作示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過(guò)量的抗體，故其靈敏度比放射免疫示蹤劑，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過(guò)量的抗體，故其靈敏度比放射免疫分析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)量范圍也明顯擴(kuò)大。分析法明顯提高，而且標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)量范圍也明顯擴(kuò)大。 由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析

16、，使本法得到了更快的由于特異性單克隆抗體用于免疫放射分析，使本法得到了更快的發(fā)展。近年來(lái)，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放發(fā)展。近年來(lái)，基因工程抗體和抗原應(yīng)用于本技術(shù)，使得免疫放射分析法更加完善。射分析法更加完善。 放射免疫分析（放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是體外放射分析技術(shù)）是體外放射分析技術(shù)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類(lèi)中建立最早、應(yīng)用最廣的一類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)性體外放射分析技術(shù).基本原理基本原理 基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗基本原理：放射性標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原（包括標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原）與有限量的特異性抗體發(fā)生可逆性競(jìng)爭(zhēng)原或待

17、測(cè)抗原）與有限量的特異性抗體發(fā)生可逆性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合結(jié)合 , ,這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來(lái)表示：這種競(jìng)爭(zhēng)可用以下反應(yīng)式來(lái)表示： Ag + Ab AgAb + Ag+* Ag*Ag + *AgAb抗原抗原 抗體抗體常用的標(biāo)記物：常用的標(biāo)記物：125 I和氚標(biāo)記物和氚標(biāo)記物放射性活度（貝克，放射性活度（貝克，Bp）1Bp：每秒一次核衰變：每秒一次核衰變比活度（比活度（Bp/g）：）：每單位質(zhì)量所含的放射性比活度每單位質(zhì)量所含的放射性比活度游離狀態(tài)游離狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)結(jié)合狀態(tài)具體步驟具體步驟 抗原抗體反應(yīng)結(jié)合的和游離的放射性物質(zhì)的分離放射性活度的測(cè)定柱色譜法柱色譜法吸附法吸附法沉淀法沉淀法抗抗體發(fā)抗抗體發(fā)微孔濾

18、膜法微孔濾膜法固相法固相法求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（劑量反應(yīng)曲線(xiàn)）求出結(jié)合率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（劑量反應(yīng)曲線(xiàn)）熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）免疫熒光技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性和 敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)以熒光素作為標(biāo)記物，與已知的抗體或抗原結(jié)合、但不影響其免疫學(xué)特性。然后將熒光素標(biāo)記的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定未知的抗原熒光免疫分析法（熒光免疫分析法（Fluorescence immunoassay, FIA）在熒光顯微鏡下，可以直接觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在的部位在實(shí)際工作中，由于熒光素標(biāo)記抗體

19、檢查抗原的方法較為常用，所以一般通稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法分類(lèi) 直接法 間接法 補(bǔ)體法 其他直接法直接法 將熒光標(biāo)記的特異性抗體（抗原）直接加在抗原（抗體）上，經(jīng)一定的溫度和時(shí)間染色，水洗-干燥-封片-鏡檢 操作簡(jiǎn)便、特異性高、非特異性染色少 敏感性低抗原標(biāo)記抗體熒光間接法間接法 先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗）與抗原反應(yīng)，再用標(biāo)記的抗體（二抗）與其反應(yīng)，形成抗原-抗體-抗體復(fù)合物，水洗-干燥-封鏡-鏡檢未知抗原未知抗原未標(biāo)記未標(biāo)記抗體抗體標(biāo)記抗標(biāo)記抗體體熒光熒光補(bǔ)體法 利用補(bǔ)體反應(yīng)，通過(guò)形成抗原-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物發(fā)射熒光補(bǔ)體補(bǔ)體標(biāo)記抗標(biāo)記抗補(bǔ)體抗補(bǔ)體抗體體時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定 利用具有雙

20、功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，將鑭系元素標(biāo)記到抗體（或抗原）上，經(jīng)免疫反應(yīng)形成復(fù)合物，由于鑭系元素能發(fā)出熒光，故分離除去未結(jié)合的成分后，利用時(shí)間分辨熒光儀即可測(cè)定熒光強(qiáng)度，從而推測(cè)待測(cè)物含量?；驹砘驹?它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物待測(cè)物與酶連接與酶連接，然后通過(guò)，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。用于定量測(cè)定。 測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。測(cè)定的對(duì)象可以是抗體也可以是抗原。在這種測(cè)定方法中有在這種測(cè)定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑： 固相的抗原或抗體（免疫吸附劑固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物） 酶作用的底物（顯色劑酶作用的底物（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附分析法（酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）雙抗體夾心法，屬于非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定非競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。 它是檢測(cè)抗原最常用ELISA，適用于檢測(cè)分子中具有至少兩個(gè)抗原決定簇的多價(jià)抗原。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體固相抗