1、光合細(xì)菌的分離與特性研究摘 要：從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)水田土壤中經(jīng)過(guò)富集培養(yǎng)和分離篩選，得到 4 株光合細(xì)菌,編號(hào)為 B1B4。 采用不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株進(jìn)行了菌株生長(zhǎng)和色素合成情況的觀察檢測(cè)，結(jié)果表明，以 3 000 lx 為最優(yōu)生長(zhǎng)光照強(qiáng)度，以厭氧+光照為促進(jìn)光合色素合成的最佳組合條件。 通過(guò)對(duì)菌株 B2 的菌落形態(tài)、 培養(yǎng)特征、 菌體形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性測(cè)定， 初步鑒定其為膠狀紅長(zhǎng)命菌（Rubrivivax gelatinosus），該菌株發(fā)酵液對(duì)茄子、辣椒的促生作用已初有效果。關(guān)鍵詞:光合細(xì)菌； 分離； 色素合成； 生理生化特性Isolation and characteristics st

2、udy on photosynthetic bacteriasAbstract： Four strains of photosynthetic bacteria numbered from B1 to B4 were isolated from the paddy soil of South ChinaAgricultural University through enrichment culture， isolation and screening。 Condition of the growth and pigment synthesis was observed,which showed

3、 3000 lx was the optimum light intensity for growth and anaerobic condition with light had greatest impact on pigmentsynthesis. By enrichment and purification， colonial morphology, culture characteristic and thallus morphology and the determination ofphysiological and biochemical characteristics， st

4、rain B2 was identified to be Rubrivivax gelatinosus。 Contrast with compound fertilizer，there was an early effect in promoting the growth of eggplant and chili by fertilizing fermentation liquor of strain B2。Key words： photosynthetic bacteria； isolation; pigment synthesis； physiological and biochemic

5、al characteristics光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria,PSB）是地球上最早出現(xiàn)、自然界中普遍存在、具有原始光能合成體系的原核生物1，包括產(chǎn)氧光合細(xì)菌（藍(lán)細(xì)菌等)和不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(紅螺菌等)， 是一類具有相同功能光合作用的混合菌群。不同自然環(huán)境下,光合細(xì)菌具有固氮、脫氮、固碳、硫化物氧化等多種功能2，每一種功能都使光合細(xì)菌的研究既具理論意義，又具實(shí)用價(jià)值. 已有研究表明，光合細(xì)菌發(fā)酵液中含有多種生理活性物質(zhì)，如葉綠素 a、b,類胡蘿卜素,維生素(尤其是 B 族維生素)，植物激素（如 IAA、GA3、ABA、乙烯、細(xì)胞分裂素)和核酸、水楊酸、氨基酸以及單細(xì)胞

6、蛋白質(zhì)、輔酶 Q 和抗病毒因子等3。 由于菌體本身無(wú)毒,又含有這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)， 使其具有調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡、促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)、增加產(chǎn)量和提高質(zhì)量等獨(dú)特的生理功能，光合細(xì)菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面有很好的應(yīng)用價(jià)值4。本試驗(yàn)從水田土壤中分離4 株光合細(xì)菌進(jìn)行生長(zhǎng)影響因素檢測(cè)， 并對(duì)其中能在瓊脂平板上快速生長(zhǎng)的兼性需氧株B2 進(jìn)行了基本特性的鑒定，研究此菌株發(fā)酵液對(duì)農(nóng)作物的促生作用，以進(jìn)一步研制光合菌肥制劑.1 材料與方法1.1 培養(yǎng)條件分離培養(yǎng)基每1 000 mL 水中加入 KH2PO40.5 g，K2HPO40。6 g, （NH4）2SO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g,Na

7、Cl 0。2 g,CaCl2·2H2O 0.075 g，乙酸鈉 1。5 g，酵母膏 0。1 g，微量元素液 1。0 mL(H3BO30。28 g、NaMoO40。075 g、CuSO40.004 g、MnSO40.21 g、ZnSO40.024 g、水 1 000 mL）,pH 為 7.2（±0。2)5。 富集培養(yǎng)液設(shè)置為分離培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)成分的3 倍。 培養(yǎng)溫度選擇 286.1。2 光合細(xì)菌的富集與分離篩選分離源為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)的水田土壤. 稱取水田土壤10 g，加無(wú)菌水 50 mL 充分振蕩打散,制成懸濁液，與富集營(yíng)養(yǎng)液按 15 比例裝人三角瓶中，并覆蓋一層無(wú)菌

8、液體石蠟(高約 2 cm），封口，靜置于光照培養(yǎng)箱，28培養(yǎng)714 d，待瓶壁上長(zhǎng)出黃、綠、紅、紫紅等多種不同顏色的菌株，取此菌懸液 1 mL 繼續(xù)富集培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)至第 3 代。采用梯度平板涂布法和梯度傾注厭氧法對(duì)光合細(xì)菌進(jìn)行初步篩選，選取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落作進(jìn)一步平板劃線，直至菌株得以分離純化。1.3 光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響將光合細(xì)菌分離株的菌懸液等量接種于規(guī)格統(tǒng)一的富集培養(yǎng)液試管中，使初始OD600約為0.2，分別于 1 000、3 000 和 5 000 lx 光照下靜置培養(yǎng) ，溫度 28；每隔 24 h取樣測(cè)定OD600，繪制生長(zhǎng)曲線。1.4 光照與氧氣對(duì)光合細(xì)菌合成色素的影響將分

9、離株接種于富集培養(yǎng)液，在 3 000 lx 光照強(qiáng)度培收稿日期：2012-02-23基金項(xiàng)目：國(guó)家“973”基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2010CB126502）;教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持項(xiàng)目(NCET07-0315）；高校博士點(diǎn)專項(xiàng)基金項(xiàng)目（20094404110006）;廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B060200017,2010B090400450）作者簡(jiǎn)介:張茜（1986-)，女，在讀碩士生，E-mail:zhangqianfsl通訊作者：彭桂香（1968-），女,博士，副教授,E-mail：gxpengscau。edu。cn廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)2012 年第 9 期112（下轉(zhuǎn)第128 頁(yè))表1 不

10、同光照、氧氣組合下光合細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程顏色變化培養(yǎng)條件厭氧光照好氧光照好氧黑暗厭氧黑暗B1澄清淡黃黃綠澄清淺黃淺綠澄清黃白澄清B2澄清紅深粉紅澄清淡紅紅澄清紅澄清淡紅B3澄清淺褐褐澄清淺黃黃褐澄清黃白澄清B4澄清紅紅褐澄清黃紅澄清淺黃淺黃澄清分離菌株顏色變化養(yǎng)箱和遮光培養(yǎng)箱中分別靜置和搖床培養(yǎng)，溫度28。 于接種后1、3、7 d 觀察菌體及培養(yǎng)物顏色變化。1。5 菌株 B2 的鑒定和基本特性研究參照文獻(xiàn)7-8，對(duì)菌落的形態(tài) 、細(xì)胞形狀進(jìn)行觀察 ，以鑒定分離株；利用本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的Bio-BIQA 碳源利用板對(duì)碳源利用進(jìn)行測(cè)定9-10；利用本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的Bio-BIQB板對(duì)抗生素、NaCl 及 pH

11、的耐受性測(cè)定10；吲哚試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)與生長(zhǎng)素分泌定性試驗(yàn)參照文獻(xiàn)11-12.1.6 菌株 B2 發(fā)酵液促生效果研究以普通復(fù)合肥為對(duì)照，菌株 B2 發(fā)酵液為處理，施用在茄子及辣椒作物上，考察菌株 B2 發(fā)酵液對(duì)作物的促生長(zhǎng)作用。2 結(jié)果與分析2.1 光合細(xì)菌菌株的篩選選擇10410-6 稀釋度的平板篩選菌株。 傾注厭氧法平板中的菌株種類多,色澤鮮明,但不易挑?。黄桨逋坎挤ㄆ桨逯芯浞N類較少，顏色較淡，其中具有不同菌落特征的4 株菌得以分離純化， 保存并分別命名為 B1 (淡綠，點(diǎn)狀）、B2（淺紅,點(diǎn)狀）、B3(淺褐，點(diǎn)狀)、B4（紅色，餅狀）。2。2 光照強(qiáng)度對(duì)光合細(xì)菌生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示

12、（圖 1）,菌株 B1 在 3 種光照強(qiáng)度下均生長(zhǎng)欠佳；菌株 B2、B3 則均表現(xiàn)出較高的生長(zhǎng)速率，且弱光條件下B2 也能達(dá)到較高水平；B4 長(zhǎng)勢(shì)稍差， 且不喜強(qiáng)光。表明光合細(xì)菌在不同光照強(qiáng)度下， 生長(zhǎng)活性有較大差異，且適宜光合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的光照強(qiáng)度為3 000 lx, 在該光照強(qiáng)度下,菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，細(xì)胞增殖達(dá)到較高數(shù)值。2。3 光照和氧氣對(duì)光合細(xì)菌合成色素的影響由2.1 可知，傾注法厭氧光照培養(yǎng),菌落具有色澤,說(shuō)明光照、厭氧是光合細(xì)菌合成色素的要素，因此，本試驗(yàn)繼續(xù)探討了形成色素的優(yōu)化培養(yǎng)條件，結(jié)果見(jiàn)表1。表1 顯示，光合細(xì)菌在黑暗條件下培養(yǎng)，不形成色素物質(zhì)，且無(wú)氧黑暗條件下長(zhǎng)勢(shì)更差；

13、而在光照條件下，長(zhǎng)勢(shì)、色澤均優(yōu)于黑暗培養(yǎng),且厭氧培養(yǎng)能使菌株更具光合細(xì)菌顏色特征。 光照和厭氧對(duì)光和色素合成的影響原因可能是：光照條件下，菌株在生長(zhǎng)初始階段先進(jìn)行好氧生長(zhǎng)并逐漸消耗基質(zhì)中的氧氣， 而后在厭氧條件合成色素物質(zhì)(葉綠素和類胡蘿卜素)13,這可從這些菌株培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)、菌液顏色越深的現(xiàn)象中證實(shí)。 菌株 B1 顯色情況差，認(rèn)為該菌株合成色素可能要求較低的氧化還原電位，只有在嚴(yán)格厭氧和光照下才能合成色素。 由此表明部分光合細(xì)菌在厭氧光照條件下由光合磷酸化得到能量， 在好氧和黑暗條件下，以有氧呼吸的有機(jī)物氧化磷酸化中取得能量，代謝途徑可隨著環(huán)境的變化而進(jìn)行轉(zhuǎn)換。2。4 菌株 B2 菌體形態(tài)及

14、特征菌株B2 為革蘭氏陰性 ,單個(gè)細(xì)胞為短桿狀(圖 2,封三)，二分分裂繁殖. 在光照厭氧、好氧，黑暗好氧及微好氧條件均能生長(zhǎng)，光照厭氧液體培養(yǎng)物由最初的淺黃色變?yōu)樯罘奂t色, 瓶底、 瓶壁及液面上形成一層深紅色隔氧膜,不隨震蕩散開(kāi)而集聚成團(tuán). 瓊脂平板上菌株也能較快生長(zhǎng),呈淺紅至深紅色點(diǎn)狀菌落，菌落表面微光滑、突起、濕潤(rùn)、有光澤、透明，菌落邊緣整齊。2。5 菌株 B2 理化性質(zhì)Bio-BIQA 96 孔板中（圖 3，封三），B2 能利用的碳源有吐溫40、吐溫 80、D-葡萄糖、D甘露糖、L-果糖、D-果糖、酮戊二酸、琥珀酸鈉和水楊酸鈉。Bio-BIQB 板結(jié)果（圖 4，封三)顯示，B2 喜堿不

15、喜酸，耐pH 410；耐 NaCl 濃度達(dá) 4。0；對(duì) 300 g/mL 的氨芐青霉素仍有耐受性；耐慶大霉素、新霉素可達(dá)50 g/mL；而對(duì)卡拉霉素、鏈霉素僅能在 5 g/mL 濃度下生長(zhǎng)；低濃度的氯霉素、四環(huán)素、紅霉素就能抑制菌株 B2 生長(zhǎng). 菌株 B2的吲哚反應(yīng)呈陽(yáng)性，且能分泌生長(zhǎng)素IAA，能液化明膠。2.6 菌株 B2 發(fā)酵液促生效果由于未至結(jié)果期，尚未開(kāi)始測(cè)量菌株B2 發(fā)酵液促生1.21.00.80。60.40.20OD600B1B2B3B40 24 48 72 96 120時(shí)間（h）1。21。00。80.60。40。20OD6001。21。00。80.60。40.20OD600B1

16、B2B3B4B1B2B3B40 24 48 72 96 120時(shí)間（h）0 24 48 72 96時(shí)間（h)A B CA：1000lx；B：3000lx；C：5000lx圖1 不同光照強(qiáng)度下 4 株菌生長(zhǎng)曲線113（上接第 113 頁(yè)）效果的具體數(shù)值。但從圖 5（封三）、圖 6（封三）均可明顯看出，右邊的處理比左邊的對(duì)照長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)越，可初步看出其促生效果。3 結(jié)論經(jīng)試驗(yàn)比較，傾注法厭氧光照培養(yǎng)，分離獲得的光合細(xì)菌種類多，菌落具有明顯的色澤；平板涂布法具有操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn), 但部分菌株在培養(yǎng)短時(shí)間內(nèi)不具有光合細(xì)菌顏色。 采用普通平板涂布法、光照培養(yǎng)，能較有效地分離兼性光合細(xì)菌. 在光照強(qiáng)度

17、為 3 000 lx 的條件下，光合細(xì)菌細(xì)胞對(duì)數(shù)增殖期較長(zhǎng)，并達(dá)到較高數(shù)值，為生長(zhǎng)適宜強(qiáng)度. 兼性光合細(xì)菌在有氧光照培養(yǎng)條件下，尤其是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，菌落能形成明顯的色澤；但對(duì)于大多數(shù)光合細(xì)菌而言,厭氧、光照條件的組合是形成光合色素的最佳選擇；黑暗不利于光合細(xì)菌的生長(zhǎng)和光合色素生成。綜合菌株B2 形態(tài)特征和理化性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果，參照文獻(xiàn)78，鑒定 B2 為紫色非硫細(xì)菌類，變形菌綱，伯克氏菌目，科未定，紅長(zhǎng)命菌屬，膠狀紅長(zhǎng)命菌(唯一種）；此菌株發(fā)酵液對(duì)茄子和辣椒作物的促生作用已初見(jiàn)成效,并將在下一步的應(yīng)用研究中做出詳細(xì)測(cè)定。參考文獻(xiàn)：1 林多，趙磊,陳寧,等。光合菌肥對(duì)黃瓜生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響J。北方園

18、藝，2010(3)：9-11.2 韓云哲,黃哲禹，李忠民，等.光合細(xì)菌分離鑒定及其培養(yǎng)基配方研究J.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(4）： 265-268。3 沈德龍，曹鳳明,李力,等。我國(guó)生物有機(jī)肥的發(fā)展現(xiàn)狀及展望J。中國(guó)土壤與肥料,2007(6）:1-3。4 陶思源,李娜,趙新剛,等。光合細(xì)菌 PSB-B4 的分離與培養(yǎng)條件優(yōu)化研究J.沈陽(yáng)師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版）,2010，28（1）：90-93.5 史清亮，賀躍武,馬玉珍,等。光合細(xì)菌在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究J。山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000,28（2）：59-62.6 操玉濤。光合細(xì)菌 M-01 的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究 J。 生物學(xué)雜志 ,2006

19、,23(1)：26-28.7 R E 布坎南，N E 吉本斯.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)翻譯組譯.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)M.第 8 版。北京：科學(xué)出版社，1984：1629.8 東秀珠，蔡妙英 .常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) M。北京:科學(xué)出版社,2001:942.9 譚志遠(yuǎn)，張武，彭桂香。一種細(xì)菌鑒定試劑盒及其制備方法與應(yīng)用P。中國(guó)專利:200710032119。7。10 彭桂香,張武，譚志遠(yuǎn)，等。細(xì)菌生理特性快速檢測(cè)試劑盒研制J.生態(tài)學(xué)雜志，2011,30(11）：25092515。11 趙斌，何紹江。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)M。北京:科學(xué)出版社，2004：152158.12 李振東,陳秀蓉,李鵬，等

20、.珠芽蓼內(nèi)生菌 Z5 產(chǎn) IAA 和抑菌能力測(cè)定及其鑒定J。草業(yè)學(xué)報(bào),2010,19（2）：6168.13 何劍丹，龍炳清，劉長(zhǎng)根，等.光合細(xì)菌的應(yīng)用現(xiàn)狀與前景J.廣西科學(xué)院學(xué)報(bào),1996,11(1)：1112.前提是首先挖掘出抗旱耐鹽良好的優(yōu)良基因。傳統(tǒng)發(fā)掘、鑒定抗旱耐鹽基因的方法是創(chuàng)造干旱鹽堿的脅迫條件進(jìn)行田間鑒定,此法雖然很有效,但耗時(shí)、費(fèi)力，還需要大量經(jīng)費(fèi)支持4.如果能從分子水平上先進(jìn)行抗旱耐鹽相關(guān)基因初步篩選5，再有重點(diǎn)的進(jìn)行田間試驗(yàn)鑒定則可大大縮小實(shí)驗(yàn)規(guī)模,節(jié)約實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)，并能抓住重點(diǎn)，增加優(yōu)異抗逆基因被篩選出來(lái)的概率6。以水稻、大麥、高粱中已克隆的相關(guān)基因的保守區(qū)為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物從小麥中篩選可能有類似功能的新基因的研究將為抗旱耐鹽基因功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)進(jìn)而加快小麥抗旱耐鹽育種進(jìn)程奠定良好基礎(chǔ).特異引物擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小一致， 且與資料記載相符的事實(shí)表明硬粒小麥、 斯卑爾托二個(gè)材料中具有抗旱耐鹽基因, 而節(jié)節(jié)麥中的抗旱耐鹽基因可能存在序列缺失導(dǎo)致其