1、第 36 講 基因工程(包括 PCF 技術(shù))A 組基礎(chǔ)題組考點一基因工程1. (2014 海南單科，31,15 分)下圖是將某細菌的基因 A 導(dǎo)入大腸桿菌內(nèi)，制備“工程菌”的示意圖。*- I) )據(jù)圖回答：(1) 獲得 A 有兩條途徑：一是以 A 的 mRNA 為模板,在_酶的催化下,合成互補的單鏈 DNA 然后在_的作用下合成雙鏈 DNA 從而獲得所需基因；二是根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的 _ 序列,推測出相應(yīng)的 mRNA 序列,然后按照堿基互補配對原則，推測其 DNA 的_序列,再通過化學(xué)方法合成所需基因。(2) 利用 PCR 技術(shù)擴增 DNA 時,需要在反應(yīng)體系中添加的有機物質(zhì)有 _、_ 、4 種脫

2、氧核糖核苷三磷酸和耐熱性的DNA 聚合酶，擴增過程可以在 PCR 擴增儀中完成。由 A 和載體 B 拼接形成的 C 通常稱為 _。在基因工程中，常用 CaT 處理 D,其目的是 _。2. (2014 山東理綜,36,12 分)人組織纖溶酶原激活物(htPA)是一種重要的藥用蛋白，可在轉(zhuǎn) htPA 基因母 羊的羊乳中獲得。流程如下：(1) htPA 基因與載體用_ 切割后，通過 DNA 連接酶連接，以構(gòu)建重組表達載體。檢測目的基因是否已插入受體細胞DNA,可采用_ 技術(shù)。(2) 為獲取更多的卵(母)細胞,要對供體母羊注射促性腺激素，使其_ 。采集的精子需要經(jīng)過_ ,才具備受精能力。(3) 將重組

3、表達載體導(dǎo)入受精卵常用的方法是 _。為了獲得母羊，移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行_。利用胚胎分割和胚胎移植技術(shù)可獲得多個轉(zhuǎn)基因個體，這體現(xiàn)了早期胚胎細胞的_ 。若在轉(zhuǎn) htPA 基因母羊的羊乳中檢測到 _,說明目的基因成功表達。3.(2015 四川理綜，9,11 分)將蘇云金桿菌 Bt 蛋白的基因?qū)朊藁毎?可獲得抗棉鈴蟲的轉(zhuǎn)基因棉其過程如圖所示(注：農(nóng)桿菌中 Ti 質(zhì)粒上只有 T-DNA 片段能轉(zhuǎn)移到植物細胞中)。質(zhì)粒中“ Bt”代表“ Bt 基因”，“Km”代表“卡那霉素抗性基因(1) 過程需用同種 _酶對含 Bt 基因的 DNA 和 Ti 質(zhì)粒進行酶切。為將過程獲得的含重組質(zhì)

4、粒的農(nóng)桿菌篩選出來，應(yīng)使用_培養(yǎng)基。(2) 過程中將棉花細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng),旨在讓_進入棉花細胞；除盡農(nóng)桿菌后，還須轉(zhuǎn)接到含卡那霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),目的是_。(3) 若過程僅獲得大量的根，則應(yīng)在培養(yǎng)基中增加 _以獲得芽；部分接種在無激素培養(yǎng)基上的芽也能長根，原因是_ 。(4) 檢驗轉(zhuǎn)基因棉的抗蟲性狀，常用方法是 _ 。種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉能減少 _的使用，以減輕環(huán)境污染?？键c二蛋白質(zhì)工程4.(2015 海南單科,31,15 分)在體內(nèi)，人胰島素基因表達可合成出一條稱為前胰島素原的肽鏈，此肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)酶甲切割掉氨基端一段短肽后成為胰島素原，進入高爾基體的胰島素原經(jīng)酶乙切割去除中間片段

5、 C 后,產(chǎn)生 A、B 兩條肽鏈，再經(jīng)酶丙作用生成由 51 個氨基酸殘基組成的胰島素。目前，利用基因工程技術(shù)可大量生產(chǎn)胰島素?；卮鹣铝袉栴}：(1) 人體內(nèi)合成前胰島素原的細胞是 _ ,合成胰高血糖素的細胞是 _。(2) 可根據(jù)胰島素原的氨基酸序列，設(shè)計并合成編碼胰島素原的 _序列,用該序列與質(zhì)粒表達載體構(gòu)建胰島素原基因重組表達載體，再經(jīng)過細菌轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定，即可建立能穩(wěn)定合成_ 的基因工程菌。(3) 用胰島素原抗體檢測該工程菌的培養(yǎng)物時，培養(yǎng)液無抗原抗體反應(yīng)，菌體有抗原抗體反應(yīng)，則用該工程菌進行工業(yè)發(fā)酵時，應(yīng)從_ 中分離、純化胰島素原。胰島素原經(jīng)酶處理便可轉(zhuǎn)變?yōu)橐葝u素。B 組提升題組非選擇題

6、1.(2017 云南昆明摸底調(diào)研,40)科學(xué)家將擬南芥的抗寒基因(CBFI),轉(zhuǎn)入香蕉以獲得抗寒的香蕉品種。下圖是某質(zhì)粒載體上的 Sacl、Xbal、EcoRI、Hind 川四種限制酶的切割位點示意圖。據(jù)圖回答問題：（1）在該實驗中為構(gòu)建基因表達載體，用 Sacl、XbaI切下 CBFI 基因后，對質(zhì)粒載體進行切割的限制酶是_,理由是_。連接 CBFI 基因到該質(zhì)粒載體后，作為基因表達載體的組成還必須有 _ 。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入香蕉細胞最常用的方法是 _ 。為了鑒別受體細胞中是否含有CBFI 基因,可用含_ 的培養(yǎng)基進行篩選?？茖W(xué)家將生長健壯、苗齡一致的轉(zhuǎn)基因香蕉（實驗組）與非轉(zhuǎn)基因香蕉（對照組）

7、進行_處理，鑒定兩組之間的抗寒性差異，如果_,則說明獲得了抗寒的香蕉優(yōu)質(zhì)品種。2. （2017 重慶八中第一次適應(yīng)性考試，40）科學(xué)家利用基因工程（DNA 重組技術(shù)）成功培育出一種能夠表達人類乳汁中常見蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻，使大米及其制品具有一定的抗菌作用。請回答下列相關(guān)問題：（1）在基因工程中，常用到的工具酶是 _ 。利用水稻的成熟葉片為材料 ,同時構(gòu)建 cDNA 文庫和基因組文庫，兩個文庫相比,cDNA 文庫中含有的基 因數(shù)目比基因組文庫中的少，其原因是 _ 。（3）在基因表達載體中，啟動子是 _ 識別并結(jié)合的部位，導(dǎo)入該水稻中的基因表達載體除啟動子和目的基因外，還應(yīng)含有 _ 等。若采用原核生

8、物作為基因表達載體的受體細胞，常用的原核生物是_。將目的基因通過基因槍法導(dǎo)入植物細胞時，常用的攜帶目的基因的金屬顆粒有 _ 和_ 粒子。由轉(zhuǎn)基因水稻生產(chǎn)的相關(guān)大米制品有一定的抗菌作用，是因為制品中含有_ 。3. （2016 課標(biāo)全國I,40,15 分）某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源 DNAS入到 Amp 或 Tet中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Amp 表示氨芐青霉素抗性基因,Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。 有人將此質(zhì)粒載體用 BamH酶切后，與 用 BamH酶切獲得的目的基因混合，加入 DNA 連接酶進行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌。 結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有

9、三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題(1)_質(zhì)粒載體作為基因工程的工具,應(yīng)具備的基本條件有_表達載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動子和終止子。(2)如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞是不能區(qū)分的,其原因是 _；并且_和_的細胞也是不能區(qū)分的,其原因是 _ 。在上述篩選的基礎(chǔ)上若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落,還需使用含有_ 的固體培養(yǎng)基。基因工程中,某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體,其 DNA 復(fù)制所需的原料來自于 _ 。4.(2016 江蘇單科,

10、33,9 分)下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點,圖 1、圖 2 中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復(fù)標(biāo)注。請回答下列冋題：限制酶BamHtBelISau3AIHi nd 川識別序列G_ ATCAGATC及ATC CGCT T切割位點GGCTAGC CTAA CTAT TCG/find (答出兩點即可),而作為基因圖 1Ji /1_i口的題訊圖 2用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用_兩種限制酶切割，酶切后的載體和目的基因片段,通過_酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了擴增重組質(zhì)粒,需將其轉(zhuǎn)入處于_ 態(tài)的大腸桿菌。(2) 為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌,應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中

11、添加 _,平板上長出的菌落,常用 PCF 鑒定,所用的引物組成為圖 2 中_ 。(3) 若 BamHI 酶切的 DNA 末端與 BelI酶切的 DNA 末端連接,連接部位的 6 個堿基對序列為 _ ,對于該部位,這兩種酶 _ (填“都能”、“都不能”或“只有一種能”)切開。若用 Sau3AI切圖 1 質(zhì)粒最多可能獲得 _ 種大小不同的 DNA 片段。目的是篩選出含有目的基因的棉花細胞。（3）培養(yǎng)基中生長素用量與細胞分裂素用量比值高時，利于根的答案全解全析A 組基礎(chǔ)題組考點一基因工程1. I 答案逆轉(zhuǎn)錄 DNA 聚合酶氨基酸脫氧核苷酸引物 模板 DNA （3）重組 DNA提高受體細胞的轉(zhuǎn)化率C

12、解析（1）利用逆轉(zhuǎn)錄法合成目的基因的過程是：以 mRNA 為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下合成單鏈DNA,然后在 DNA 聚合酶作用下,合成雙鏈 DNA 分子；根據(jù)蛋白質(zhì)工程合成目的基因的過程是：根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測相應(yīng)的 mRNA 序列，然后按照堿基互補配對原則，推測 DNA 中脫氧核苷酸的排列順 序,通過化學(xué)方法合成 DNA （2）PCR 過程中需要酶、底物、模板、引物和能量等條件。（3） 目的基因和運載體結(jié)合，形成重組 DNA 基因表達載體）。（4）在利用大腸桿菌做受體細胞時，需要先用 Ca2+處理,使之成為感受態(tài)細胞，有利于其吸收重組 DNA 分子。2. 答案（1）同種限制性

13、核酸內(nèi)切酶（或同種限制酶）DNA 分子雜交（或核酸探針）超數(shù)排卵獲能（處理）（3）顯微注射法性別鑒定全能性（4）htPA（或人組織纖溶酶原激活物）I 解析（1）目的基因和載體先用同種限制酶切割后，再用 DNA 連接酶連接，以構(gòu)建基因表達載體；判斷目的基因是否插入受體細胞的DNA 可采用 DNA 分子雜交技術(shù)。（2）利用促性腺激素處理供體母羊可使其產(chǎn)生更多的卵（母）細胞；精子必須獲能后才具備受精能力。（3）將重組表達載體導(dǎo)入動物受精卵常用的方法是顯微注射法。為了獲得母羊，移植前需對已成功轉(zhuǎn)入目的基因的胚胎進行性別鑒定。（4）若在轉(zhuǎn) htPA基因母羊的羊乳中檢測到人組織纖溶酶原激活物，說明目的基因

14、成功表達。3. 答案（1）限制性核酸內(nèi)切選擇（2）T-DNA 篩選獲得 T-DNA 片段的植物細胞（3）細胞分裂素濃度芽頂端合成的生長素向基部運輸，促進根的分化（4）投放棉鈴蟲農(nóng)藥C 解析本題考查基因工程與植物細胞工程的相關(guān)知識。（1）同種限制酶切割質(zhì)粒和含目的基因的 DNA,可獲得相同的黏性末端，以構(gòu)建基因表達載體。重組質(zhì)粒含完整的卡那霉素抗性基因，故應(yīng)使用含卡那霉素的選擇培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。（2）實驗過程中將棉花細胞與農(nóng)桿菌混合后共同培養(yǎng),其目的是利用含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌將 T-DNA 導(dǎo)入棉花細胞中。除去農(nóng)桿菌后在含卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),其完整,氨芐青霉素抗性基因結(jié)構(gòu)被破壞，在

15、篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素可以篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的分化,抑制芽的形成，反之，有利于芽的分化，抑制根的形成。因芽頂端可合成生長素，故接種在無激素的培養(yǎng)基上的芽也能長根。（4）可用投放棉鈴蟲的方法檢測抗蟲棉的抗蟲效果。轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種植可減 少農(nóng)藥使用量，從而減輕環(huán)境污染?？键c二蛋白質(zhì)工程4. 答案（1）胰島 B 細胞 胰島 A 細胞（2）DNA 胰島素原菌體I 解析（1）人體合成前胰島素原的細胞是胰島B 細胞，合成胰高血糖素的細胞是胰島A 細胞。（2）蛋白質(zhì)工程生產(chǎn)胰島素時，需根據(jù)胰島素原的氨基酸序列，設(shè)計并合成編碼胰島素原的脫氧核苷酸序列（目的基因），然后再構(gòu)建胰島素原基因重組表達載體，導(dǎo)入

16、細菌細胞內(nèi)，再經(jīng)過細菌轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定，即可建立能穩(wěn)定合成胰島素原的工程菌。（3）運用抗原一抗體檢測法檢測胰島素原時，培養(yǎng)液無抗原抗體反應(yīng)，菌體有抗原抗體反應(yīng)，故應(yīng)從菌體中分離、純化胰島素原。B 組提升題組非選擇題1. 答案（1）SacI、Xbal用相同限制酶切割來源不同的DNA 后，可產(chǎn)生相同的末端（2）啟動子和終止子農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（3）氨芐青霉素（4）低溫實驗組的抗寒能力明顯高于對照組C 解析（1）在基因工程中，用相同限制酶切割來源不同的DNA 后，可產(chǎn)生相同的末端，所以和含目的基因的 DNA 一樣，質(zhì)粒也應(yīng)使用 SacI、XbaI進行切割。（2）基因表達載體的組成包括啟動子、終止子、標(biāo)記

17、基因、目的基因等。香蕉細胞是植物細胞，將目的基因?qū)胫参锛毎Ｓ棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。（3）據(jù)圖分析，質(zhì)粒上的標(biāo)記基因是氨芐青霉素抗性基因，所以為了鑒別受體細胞中是否含有CBFI 基因，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基進行篩選。（4）根據(jù)題干信息已知目的基因是抗寒基因，所以科學(xué)家將生長健壯、苗齡一致的轉(zhuǎn)基因香蕉（實驗組）與非轉(zhuǎn)基因香蕉（對照組）進行低溫處理，鑒定兩組之間的抗寒性差異，如果實驗 組的抗寒能力明顯高于對照組，則說明獲得了抗寒的香蕉優(yōu)質(zhì)品種。2. I 答案（1）限制性核酸內(nèi)切酶DNA 連接酶（2）cDNA 文庫中只含有葉肉細胞已轉(zhuǎn)錄（或已表達）的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因（3）RNA

18、聚合酶標(biāo)記基因和終止子大腸桿菌金粉鎢粉完整,氨芐青霉素抗性基因結(jié)構(gòu)被破壞，在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素可以篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的（5）溶菌酶（或抗體）C 解析基因工程中常用到限制酶和DNA 連接酶。（2）cDNA 文庫中含有某種生物的部分基因，而基因組文庫含有某種生物的全部基因，本題中 cDNA 文庫中只含有葉肉細胞已轉(zhuǎn)錄（或已表達）的基因，而基因組文庫中含有該植物的全部基因。（3）在基因表達載體中，啟動子是 RNA 聚合酶識別和結(jié)合的部位。基因表達載體中除了啟動子和目的基因外還需要有標(biāo)記基因、終止子等。如果采用原核生物作為基因表達載體 的受體細胞,常用的原核生物是大腸桿菌。（4）將目的基因通

19、過基因槍法導(dǎo)入植物細胞時，常用的攜帶目的基因的金屬顆粒有金粉和鎢粉粒子。（5）由轉(zhuǎn)基因水稻生產(chǎn)的相關(guān)大米制品有一定的抗菌作用，是因為制品中含有抗菌的物質(zhì)溶菌酶或抗體。3. *答案（1）能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長 含有質(zhì)粒載體 含有插入了目的基因 的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì)粒）二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長 四環(huán)素 受體細胞亡解析（1）質(zhì)粒作為載體應(yīng)具備的基本條件有：能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、含有一至多個限制酶切割位點等。（2）由題意可知，未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的細胞中均不含有氨芐青霉素抗性基因，所以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上均不能生長。質(zhì)粒載體上含有氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，插入了目的基因的重組質(zhì)粒中僅含有氨芐青霉素抗性基因，所以含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細胞均能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長，但前者可以在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長而后者不能，所以可用含有四環(huán)素的培養(yǎng)基，篩選出含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落。（3）噬菌體屬于病毒，病毒增殖過程中所需的原料等均來自于受體細胞。4. *答案