1、OGDCE2和BCOADAE2的二聯(lián)體檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義    【摘要】nbsp;nbsp;目的nbsp;通過(guò)重組表達(dá)抗原OGDCE2和BCOADCE2的二聯(lián)體融合蛋白(B0)，并用于檢測(cè)自身抗體及臨床意義。方法nbsp;重組表達(dá)的融合     作者：陳燕，婁加陶，姚定康，周曄，吳傳勇，錢(qián)琤，蔣天舒，陳 波，仲人前，鄧安梅    作者單位：上海長(zhǎng)征醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，全軍臨床免疫中心，上海 200003 【摘要】  目的 通過(guò)重組表達(dá)抗原OGDCE2和B

2、COADCE2的二聯(lián)體融合蛋白(B0)，并用于檢測(cè)自身抗體及臨床意義。方法 重組表達(dá)的融合蛋白(B0)，通過(guò)NiNTA親和柱純化，經(jīng)過(guò)免疫印跡法(IBT)和酶鏈免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)56份PBC患者血清，以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清為對(duì)照組。結(jié)果 56例確診的PBC患者中，42例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為750%。而健康體檢者和疾病對(duì)照組血清中的M2抗體均為陰性。結(jié)論 通過(guò)用重組表達(dá)的二連體B0檢測(cè)PBC患者血清中的M2抗體，具有一定的特異性及敏感性，為臨床進(jìn)一步研究PBC，輔助診斷提供一些輔助參考。 【關(guān)鍵詞】  BCOADAE2OGDCE2二聯(lián)體(B0)

3、；免疫印跡；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；原發(fā)性膽汁性肝硬化     原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是以進(jìn)行性膽汁淤積伴有肝損傷為特點(diǎn)，并逐漸形成肝硬化及其并發(fā)癥。其肝組織病變特征是以淋巴細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝內(nèi)小葉間膽管的慢性非化膿性破壞性膽管炎，最終發(fā)展為肝硬化甚至肝功能不全。血清線粒體抗體M2(AMAM2)診斷PBC的敏感性和特異性均超過(guò)90%95%，為本病最突出的免疫學(xué)指標(biāo)異常，也是重要的診斷手段1。M2抗體的靶抗原主要為線粒體上的2氧酸脫氫酶復(fù)合體(2OADC)的其中一些組分：側(cè)鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合體E2(BC

4、OADCE2)、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2(PDCE2)、2氧戊二酸脫氫酶(OGDC)23。我們通過(guò)采用重組抗原(BCOADCE2)和2氧戊二酸脫氫酶(OGDC)的復(fù)合體BO來(lái)檢測(cè)M2抗體，以利于PBC的早期診斷。 1  材料和方法 11  標(biāo)本來(lái)源  PBC患者組56例，為本院2004年8月2006年6月間，經(jīng)住院檢查確診的PBC患者。其中女54例，男3例，男女比例為1：18。年齡3265歲。并且PBC的診斷符合2000年美國(guó)肝臟病學(xué)會(huì)(AASLD)推薦的診斷指南：排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能異常，有膽汁淤積的生化改變(主要是堿性磷酸酶、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶升

5、高)且無(wú)其他原因解釋?zhuān)谎蹇咕€粒體抗體或M2抗體陽(yáng)性， 同時(shí)AMA1：404。 患者并行穿刺病理檢查，匯管區(qū)有大量淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞聚集，光鏡下可見(jiàn)小葉結(jié)構(gòu)完整，實(shí)質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)凋亡小體形成及散在點(diǎn)狀壞死，均符合PBC早期病理學(xué)特征。70例正常對(duì)照均為本院的健康體檢者，50例其他肝病患者和自身免疫病患者48例(類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎15例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡20例，強(qiáng)直性脊柱炎3例，自身免疫性膽管炎10例)為疾病對(duì)照組，均為本院住院患者。 12  純化重組抗原  將特異性擴(kuò)增OGDCE2和BCOADCE2的二聯(lián)體BO cDNA定向插入高效表達(dá)載體PET28a(+)，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌大腸埃希菌(

6、Ecoli)BL21，經(jīng)異丙基硫代D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后表達(dá)，在變性條件下用帶6個(gè)組氨酸的NiNTA瓊脂糖純化，獲得高純度的重組BO，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)5。 13  利用重組融合抗原IBT檢測(cè)M2抗體  將重組蛋白BO經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜，封閉后依次加入血清、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG，顯色劑33二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽底物和H2O2，觀察反應(yīng)條帶。同時(shí)用正常人血清作陰性對(duì)照。 14  ELISA法檢測(cè)M2抗體  ELISA方法檢測(cè)PBC患者，健康體檢者和疾病對(duì)照組血清中的M2抗體。純化后的

7、重組蛋白，用碳酸鹽緩沖液CBS(pH95)稀釋后分別包被酶標(biāo)板。OP為4 mg/L，4 過(guò)夜(16 h)，吐溫-20碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，加入小牛血清封閉，洗滌后依次加入待檢血清、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG、顯色劑33二氨基聯(lián)苯胺和H2O2，經(jīng)酶標(biāo)比色儀吸光度450 nm 比色，讀取吸光度值，判定值為陰性對(duì)照A值+5倍標(biāo)準(zhǔn)差。 15  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  用StlJderlts檢驗(yàn)分析均值間差異。第2期OGDCE2和BCOADAE2的二聯(lián)體檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義  陳  燕，等 2  結(jié)果 21  免疫印跡檢測(cè)結(jié)果

8、0; 用重組融合抗原BO經(jīng)IBT檢測(cè)，56例確診的PBC陽(yáng)性病人，檢測(cè)出抗BO抗體陽(yáng)性的為42例，陰性14例。正常對(duì)照和其他非膽汁性肝硬化患者抗BO抗體均為陰性。48例自身免疫病患者中，10位自身免疫性膽管炎患者中2例AMA陽(yáng)性；但其血清中抗BO抗體均為陰性。結(jié)果見(jiàn)表1。表1  抗BO抗體與AMA抗體檢測(cè)結(jié)果(略) 22  常規(guī)方法檢測(cè)  采用常規(guī)方法檢測(cè)， 自身免疫病患者和其他肝病患者、健康對(duì)照者中M2抗體均為陰性。而56例確診的PBC患者中，其M2抗體為陽(yáng)性42例，陰性14例；與我們采用的IBT法和ELISA法檢測(cè)結(jié)果完全符合。 23  ELISA法

9、檢測(cè)抗BO血清  用ELISA法檢測(cè)時(shí)，正常對(duì)照組值為(89±35)U，因此以>289 U(±5 s)為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，<289 U 為陰性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示，在56例確診的PBC患者中42例陽(yáng)性，14例陰性；其他疾病對(duì)照組和健康體檢者均為陰性。 3  討論 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的特征是血中線粒體抗體為陽(yáng)性，而高滴度的抗線粒體抗體(AMA)是PBC的重要血清學(xué)指標(biāo)。根據(jù)其靶抗原不同，AMA可分為M1M9共9個(gè)亞型，其中M2對(duì)PBC的診斷最具特異性。PBC在任何年齡段均可發(fā)病，其中90%95%為女性，大部分集中在3070歲之間，兒童少見(jiàn)6。 AM

10、A對(duì)PBC具有診斷意義。95%98%的患者AMA陽(yáng)性，因此抗體出現(xiàn)可早于臨床表現(xiàn)多年，所以具有早期診斷價(jià)值。近年來(lái)研究顯示，M2亞型對(duì)PBC具有較高的特異性和診斷價(jià)值。PBC的發(fā)病率在我國(guó)鮮見(jiàn)報(bào)道，近年來(lái)國(guó)外報(bào)道PBC也呈上升趨勢(shì)。    1987年以來(lái)鑒定出M2靶抗原為線粒體上的2氧酸脫氫酶復(fù)合體(2OADC)的一些組分：丙酮酸脫氫酶(PDC)、2氧酸脫氫酶(BCOADC)、2氧戊二酸脫氫酶(OGDC)等，BCOADC和OGDC的抗原表位位于內(nèi)酯酰區(qū)。在PBC患者血清中OGDC的陽(yáng)性率為39%88%，而B(niǎo)COADC的陽(yáng)性率為53%55%47。 

11、0;  我們采用重組表達(dá)的BCOADCE2和OGDCE2的二聯(lián)體BO，作為靶抗原來(lái)檢測(cè)PBC患者血清中的M2抗體。56例PBC患者檢查出BO抗體陽(yáng)性42例，陰性的12例，其陽(yáng)性率為750%。自身免疫病患者、其他肝病患者和健康體檢者血清中均未檢測(cè)出BO抗體。    通過(guò)早期檢測(cè)M2抗體，有助于早期確診PBC患者，對(duì)指導(dǎo)治療有一定參考價(jià)值。 【參考文獻(xiàn)】  1 王 蕓,范 紅,郭 強(qiáng). 原發(fā)性膽汁性肝硬化與抗線粒體抗體M2檢測(cè)的臨床意義J.中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志,2005,2(3):211-222.2 Van de Water J,Gersbwon M

12、 E,Leung P,et al.The autoepitope of the 74 kD motochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis corresponds to the functional site of dibydrolipoamide acetyltransferaseJ.J Exp Med,1988,167:1791-1799.3 Jophn R E,Neuberger J M.Immmuopathology of primary biliary cirrhosisJ.Enr J Gastroenterol Hepatol,1999,11:587-593.4 Nakano T,Inoue K,Hirohara J,et al.Longterm prognosis of primary biliary cirrosis(PBC)in Japan and analysis of the factors of stage progression in asymptomatic PBC(PBC)J.Hepatol Res,2002,22(2):250-260.5 夏 睛,仲人前,鄧安梅,等.胰腺癌相關(guān)自身抗原47原核表達(dá)、純化及其抗體檢測(cè)胰腺癌的價(jià)值初