1、1第六章 基因克隆的技術路線2基因工程基因工程（上游）（上游）大體步驟大體步驟獲取目的基因獲取目的基因目的基因與載體連接目的基因與載體連接連接產物導入細胞連接產物導入細胞目的基因表達目的基因表達逆轉錄逆轉錄PCR法法PCR法法直接調用法直接調用法各種質粒各種質粒各種病毒各種病毒皆經改造皆經改造原核細胞原核細胞真核細胞真核細胞哺乳動物細胞哺乳動物細胞植物細胞植物細胞3第一節(jié)獲得目的基因41. 直接分離目的直接分離目的DNA 經限制酶切割，電泳、分離經限制酶切割，電泳、分離DNA片段。片段。 適用于獲得細菌、質粒、病毒等低等生物適用于獲得細菌、質粒、病毒等低等生物的基因片段。的基因片段。 真核生物

2、的染色體真核生物的染色體DNA中含有內含子中含有內含子序列，不適合于基因工程的需要。序列，不適合于基因工程的需要。52. cDNA文庫 以以mRNA為模板，逆轉錄合成的互補為模板，逆轉錄合成的互補DNA。以此得到的某種細胞內所有。以此得到的某種細胞內所有mRNA的的cDNA，稱為，稱為cDNA文庫。文庫。63 3. RT-PCR基本原理：基本原理：將細胞中將細胞中mRNA逆轉錄為逆轉錄為cDNA，以，以cDNA為模板，進行為模板，進行PCR反應。反應。mRNAcDNAPCR產物產物 不論用哪種方法，目的是得到不含內不論用哪種方法，目的是得到不含內含子的含子的DNA序列。序列。78第二節(jié)第二節(jié)

3、重組重組DNA分子的構建分子的構建9 Link of cohesive end粘末端連接一一.目的基因與載體的連接10Link of blunt end平末端連接11平末端連接平末端連接Recombinant DNAT4 DNA ligasevector1 連接反應的實際反應溫度為連接反應的實際反應溫度為4160C。160C時，需時，需4小時，若小時，若40C時，需過夜。時，需過夜。 平末端連接反應效率低。為提高反應平末端連接反應效率低。為提高反應效率，可采用平末端加尾巴的辦法，將平效率，可采用平末端加尾巴的辦法，將平末端改造成粘末端。末端改造成粘末端。1213平末端連接的缺點*more di

4、fficult ligation 連接困難*2-direction insertion 雙向插入*self-reconnection 自身環(huán)化*no easy way of retrieving the insert 重新篩選插入的片斷困難14vector12vector12AABAB 平齊末端連接時，插入的方向是隨機的，稱為雙向插入。會給后續(xù)的工作造成很多麻煩。15EcoRIEcoRI單酶切粘末端連接單酶切粘末端連接1617單酶切粘末端連接的特點優(yōu)點*Using the same one enzyme to cut 用同一種酶切 *Ligated easily and coveniently

5、 連接容易方便缺點*Self-reconnection of vector 載體自身環(huán)化 *Inserted in two directions 雙向插入雙向插入18單酶切粘末端的雙向插入GCTTAAAATTC GAATTC GGCTTAAGCTTAAAATTC GGCTTAAAATTC G19AATTCxxxxxxA GxxxxxxTTCGAG AGCTTCTTAA AGAATTCxxxxxxAAGCTTCTTAAGxxxxxxTTCGAAligase雙雙酶酶切切粘粘末末端端連連接接EcoRI HindIIIEcoRI HindIII20雙酶切粘末端連接的特點 *Using the same

6、 two enzymes to cut *Ligated easily and conveniently *no self-reconnection of vector *Inserted in one direction 定向插入 缺點 操作比較麻煩。如果兩種酶要求的條件不同，需要進行兩個階段的反應。21幾種實驗方法 利用相應的技術方法，使實驗順利進行。22Link of homopolymeric tails 添加同聚尾避免質粒的自身環(huán)化末端轉移酶23添加接頭，引入限制酶的切割添加接頭，引入限制酶的切割位點，然后用相應的酶切割。位點，然后用相應的酶切割。24野生型細菌具有針對外源野生型細菌

7、具有針對外源DNA的限制和的限制和修飾系統(tǒng)，會切割外源修飾系統(tǒng)，會切割外源DNA分子。因此用于分子。因此用于基因工程的受體菌，需經篩選和人工改造。基因工程的受體菌，需經篩選和人工改造。第三節(jié)第三節(jié) 重組子導入細胞重組子導入細胞25 外源外源DNA轉入細胞的過程叫做轉化。轉入細胞的過程叫做轉化。 但但不包括由病毒介導的不包括由病毒介導的DNA轉入轉入 。常用的。常用的方法有如下：方法有如下：26The first is a chemical method utilizing CaCl2 and heat shock to promote DNA entry into cells. 氯化鈣法氯化鈣

8、法 ：利用氯化鈣和熱休克使受體菌：利用氯化鈣和熱休克使受體菌成為感受態(tài)細胞，促進外源成為感受態(tài)細胞，促進外源 DNA的進入。的進入。 27 宿主細胞與重組宿主細胞與重組DNA在在00C的低滲氯化鈣的低滲氯化鈣溶液中孵育，快速轉入溶液中孵育，快速轉入420C造成熱休克。經造成熱休克。經此處理后的細胞此處理后的細胞“容易容易”接受外源的接受外源的DNA，一般叫做感受態(tài)細胞。一般叫做感受態(tài)細胞。28處理宿主細胞處理宿主細胞1. 低滲溶液熱休克低滲溶液熱休克 E.coli + 0.1M CaCl2 competent cells (E.coli) 被轉化的宿主細胞被轉化的宿主細胞Low-osmosis

9、 makes cell expanding0-4Recombinant DNA + 42 Heat makes cell more expanding and membrane more permeable29 處于感受態(tài)的細菌表面正電荷增加，處于感受態(tài)的細菌表面正電荷增加，細胞膜的結構有改變，細胞膜的結構有改變， 通透性增強，轉通透性增強，轉化子易于進入細胞?；右子谶M入細胞。30其他處理受體細胞的方法 利用二甲基亞砜（利用二甲基亞砜（DMSO）處理細胞）處理細胞 二巰基蘇糖醇（二巰基蘇糖醇（DTT）處理細胞。）處理細胞。 利用聚乙二醇（利用聚乙二醇（PEG）處理細胞。）處理細胞。31Whe

10、n competent cells are mixed with DNA， some cells (actually, very few) become transformed: they acquire recombinant vector DNA. Pseudo-positivepositive32 第四節(jié) 重組子的篩選與鑒定33After transformation，only a few cells take up the plasmid DNA，and there only has one recombinant molecule in one recipient cell(受受體細

11、胞體細胞)，so a method is needed for selecting those 轉化步驟后，轉進重組質粒的細胞是較轉化步驟后，轉進重組質粒的細胞是較少的。因此需要挑選出含有重組子的細胞。少的。因此需要挑選出含有重組子的細胞。341. Direct selection 直接篩選直接篩選Antibotic resistance 抗菌素抗性抗菌素抗性Marker rescue selection 借助顏色篩選借助顏色篩選In situ hybridization 原位雜交原位雜交2. Immunology selection 免疫篩選免疫篩選Immunochemistry metho

12、d 免疫化學免疫化學Enzyme immunodetection assay 酶免疫分析酶免疫分析35 質粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，質粒載體帶有氨芐青霉素抗性基因，在宿主細胞內該抗性基因表達出可水解氨在宿主細胞內該抗性基因表達出可水解氨芐青霉素的酶，因而宿主細胞可在含氨芐芐青霉素的酶，因而宿主細胞可在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上生長。青霉素的瓊脂糖平板上生長。利用抗生素抗性篩選利用抗生素抗性篩選36復制起點氨芐青霉素抗性基因3738392.利用顏色篩選 插入失活現象X-gal ：5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-B-D-半乳糖苷半乳糖苷40多克隆位點半乳糖苷酶的基因內有多克隆位點，酶切插入外

13、源DNA后，該基因無法表達.4142 完整的LacZ基因內，經過改造加入了多克隆位點，但并不影響LacZ基因的表達。 當質粒轉化細胞后，完整的LacZ基因表達產物與細菌的有關基因表達產物共同組成有功能的半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，該酶把無色的X-gal切割成半乳糖和藍色的5溴4氯靛藍，使得菌落呈現藍色。43表示外源基因插入編碼半乳糖苷酶的基因區(qū)段44Target gene4546藍色菌落藍色菌落無插入序列無插入序列白色菌落含插入序列轉化菌具有氨芐青霉素抗性，可在 加有氨芐青霉素的平板上生長。47 使用含Amp+X-Gal的瓊脂糖平板篩選克隆，可能出現三種情況。 1 . 載體自身環(huán)化，產生藍色菌落；

14、 2 帶有正確插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未轉化的細胞，不能生長。483. In situ hybridization 原位雜交原位雜交 生長在瓊脂糖平板上的菌落，可定點轉移到生長在瓊脂糖平板上的菌落，可定點轉移到硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有硝酸纖維素膜上，加入放射性的探針（即帶有 放放射性的與目的片斷互補的核酸片斷），與菌落雜射性的與目的片斷互補的核酸片斷），與菌落雜交。經洗滌后的膜與交。經洗滌后的膜與X光膠片作用，挑選出陽光膠片作用，挑選出陽性克隆。性克隆。4950DNA hybridization 515253545556免疫法篩選 外源基因在細胞內表達出的蛋白質

15、，可與特異性的抗體結合。57利用抗體篩選利用抗體篩選原理原理 目的基因編碼的蛋白質作為抗原，用特異目的基因編碼的蛋白質作為抗原，用特異性抗體與之反應，再根據顏色等變化，篩選出菌性抗體與之反應，再根據顏色等變化，篩選出菌落。落。方法方法 在瓊脂平板上的菌落，轉移到尼龍濾膜上，在瓊脂平板上的菌落，轉移到尼龍濾膜上，若某菌落帶有目的基因，并可表達該目的基因所若某菌落帶有目的基因，并可表達該目的基因所編碼的蛋白質，則加入該蛋白質的特異抗體，可編碼的蛋白質，則加入該蛋白質的特異抗體，可與該菌落結合，附著在濾膜上，不會被洗掉。該與該菌落結合，附著在濾膜上，不會被洗掉。該抗體可攜帶酶或熒光，易于檢測?？贵w可

16、攜帶酶或熒光，易于檢測。58Screening with antibodies is used when cloned gene is expressed and antibodies recognizing the encoded protein are available. 59第五節(jié) 基因表達產物的鑒定60基因表達基因表達 基因表達指某基因在細胞中基因表達指某基因在細胞中轉錄為轉錄為mRNA繼而翻譯成蛋白質的過程。繼而翻譯成蛋白質的過程。DNARNAProtein轉錄轉錄翻譯翻譯61研究基因表達的手段研究基因表達的手段1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA

17、) 3、Western blot (蛋白質）蛋白質） 4、免疫組化、免疫組化 （蛋白質）（蛋白質）621、RT-PCR基本原理：基本原理：將細胞中將細胞中mRNA逆轉錄為逆轉錄為cDNA，以，以cDNA為模板，進行為模板，進行PCR反應。根據反應。根據PCR產物的產物的量，判斷基因表達的強度。量，判斷基因表達的強度。mRNAcDNAPCR產物產物632、Northern blot標記探針與膜固相標記探針與膜固相RNA雜交。雜交。根據雜交信號強弱判斷表達量，根據雜交信號強弱判斷表達量，根據雜交信號位置判斷分子長度。根據雜交信號位置判斷分子長度。雜交信號雜交信號64實驗操作：實驗操作：1）RNA提

18、取提取2）RNA電泳（分離不同長度電泳（分離不同長度RNA)3）轉膜）轉膜 (形成固相形成固相RNA)4）探針標記（同位素）探針標記（同位素/非同位素）非同位素）5）雜交）雜交6）洗膜）洗膜7）顯影（放射性）顯影（放射性/酶促反應）酶促反應）65Northern blot 特點：特點：因為沒有擴增過程，因為沒有擴增過程，Northern blot 的的結果可靠性高。可以確定未知基因的結果可靠性高。可以確定未知基因的轉錄產物（轉錄產物（mRNA）長度。）長度。優(yōu)點：優(yōu)點：缺點：缺點：1、操作煩瑣、操作煩瑣2、使用同位素可能污染環(huán)境、使用同位素可能污染環(huán)境3、靈敏度低、靈敏度低4、對、對RNA質量要求高質量要求高663、Western blot標記抗體與固定在膜上的蛋白作用。標記抗體與固定在膜上的蛋白作用。根據信號強弱判斷蛋白表達強度。根據信號強弱判斷蛋白表達強度。根據信號位置判斷蛋白分子量。根據信號位置判斷蛋白分