1、生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文 精品論文 改良多重實時熒光PCR技術(shù)定量檢測DNA甲基化關(guān)鍵詞：遺傳性疾病 基因甲基化 基因檢測 PCR技術(shù)摘要：DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對照的CpG

2、島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74(54/6

3、4)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能精確定量至

4、0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。正文內(nèi)容 DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

5、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

6、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

7、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

8、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

9、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

10、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

11、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

12、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

13、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

14、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

15、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

16、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

17、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

18、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

19、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

20、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

21、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

22、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

23、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

24、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

25、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

26、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

27、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

28、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對

29、照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81(5/64)、15.63(10/64)、29.69(19/64)、65.63(42/64)、54.69(35/64)，特異性分別為100.00(64/64)、98.44(63/64)、96.88(62/64)、90.62(58/64)、83.74

30、(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統(tǒng)的基于MethyLight發(fā)展起來的技術(shù)相比，HANDs-qMSP技術(shù)具有以下幾個優(yōu)點：(1) HANDs-qMSP技術(shù)設(shè)置了一份98質(zhì)控管，該質(zhì)控管不僅可以作為100陽性對照，還可作為亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率為98的指標，用于指示標本亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率的高低，從而有效避免由亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率太低所導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。(2)HANDs-qMSP技術(shù)采用了同源加尾(HAND)系統(tǒng)，HAND系統(tǒng)能有效地抑制引物二聚體的產(chǎn)生，減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異，提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應(yīng)，且能

31、精確定量至0.01。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系，在同一反應(yīng)管中可同時檢測分析多個基因，不僅節(jié)約了試劑和標本用量，而且使操作更加簡便，減少勞動量。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的一種，在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預(yù)后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術(shù)是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術(shù)的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性，提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(shù)(HANDs-qMSP)，并利用該技術(shù)檢測64份大腸癌標本及其正常對照的CpG島甲基化表型(CIMP)，包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50，利用HANDs-qMSP技術(shù)對64份大腸癌組織及64份與之對應(yīng)正常對照進行臨床評估，結(jié)果顯示，CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94(55/64)，其中RUNX3. A