1、不同組織嗜性傳染性支氣管炎病毒核衣殼基因的遺傳變異性分析周繼勇1,張德勇1,2,丁紅梅1,程麗琴1,陳吉?jiǎng)?(11浙江大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所;21浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杭州310029摘要:根據(jù)G enBank 發(fā)表的傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus ,IBV Beaudette 毒株核衣殼(nucleocap 2sid ,N 基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,利用RT -PCR 方法分別擴(kuò)增了疫苗毒株IBV -H52、嗜腺胃Z J971株、嗜腎IBV -X 和N 株的N 基因ORF ,并克隆到質(zhì)粒載體pBluescript SK (+,測(cè)序后用PCgene

2、和DNA Star 軟件分析。結(jié)果顯示:4株IBV 的N 基因均含有一個(gè)長(zhǎng)1230bp 的ORF ,編碼一由409個(gè)氨基酸殘基組成的N 蛋白。嗜腎IBV -X 和N 毒株的N 基因存在Hin d 酶切位點(diǎn)。與來(lái)自G enBank 的另外8株IBV 比較,Z J971株與它們的N蛋白的核苷酸及氨基酸序列同源性分別在8812%9816%和9112%9718%;N 株則分別為8616%8714%和9015%9115%;X 株分別為8613%8714%和9010%9115%;H52分別為9014%9813%和9210%9810%。Z J971株、N 和X 株的N 基因的突變特點(diǎn)是散在的點(diǎn)突變。嗜腺胃Z

3、 J971株核衣殼蛋白的氨基酸序列的最顯著的遺傳變異特征是H 111D 、S 117A 、V 142L 、P 171A 和E 401D ;嗜腎IBV -X 和N 株核衣殼蛋白的氨基酸序列的最顯著的遺傳變異特征是A 46S 、A 48P 、L 189R 、N 190S 、E 220D 、I 223A 、V 236Y 、S 237K 、K 240Q 、Q 286R 、T 299K 、R 301E 、E 334D 、V 335E 、V 336P 和T 351S 。關(guān)鍵詞:傳染性支氣管炎病毒;核衣殼蛋白基因;克隆;變異中圖分類號(hào):S852165916文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1000-8721(200

4、301-0059-05收稿日期:2002-01-14;修回日期:2002-03-26基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(39970030;浙江省自然科學(xué)基金(399411;浙江省重點(diǎn)科研項(xiàng)目(991102030資助作者簡(jiǎn)介:周繼勇(1963-,男,理學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)及畜禽傳染病防治的研究及教學(xué)工作。Tel :0571-*;Fax :0571-*;Email :jyzhou zju 文中報(bào)道的序列在G enBank 的注冊(cè)號(hào)為:AF352308、AF352310、AF352309、A Y043315。傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis viru

5、s ,IBV 屬冠狀病毒科冠狀病毒屬,能在雞群中引起以呼吸道、腎臟和生殖道病變?yōu)橹饕卣鞯母叨冉佑|性傳染性疾病。由于IBV 易變異,血清型眾多,且各型之間交叉保護(hù)率低1,2,給傳染性支氣管炎的防治造成新的困難。IBV 的基因組為單鏈正股RNA ,長(zhǎng)約27.6kb 3。在感染IBV 的雞胚腎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),IBV 指導(dǎo)合成6種主要的poly A 化的單股RNA 。這些RNA 包括基因組的胞內(nèi)形式(RNA F 和5類較短的RNA (RNA A 、B 、C 、D 和E 4。mR 2NA A 、C 、E 分別編碼三種主要的結(jié)構(gòu)蛋白:纖突蛋白(S 、膜蛋白(M 和核衣殼蛋白(N 。S 蛋白轉(zhuǎn)錄后被切割成N

6、端的S1和C 端的S25。S1蛋白帶有能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的抗原表位,并能決定病毒的血清型5,6。N 蛋白則有可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)IBV 的細(xì)胞免疫7。早期Williams 等的研究認(rèn)為,不同IBV 之間N基因高度保守,尤其是中間區(qū)域8。但Sapats 認(rèn)為N 基因的進(jìn)化和變異與S1相似,具有一定的平行性9。Van 等的研究表明,IBV 的N 蛋白為409個(gè)氨基酸殘基組成的一種磷酸化蛋白,在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中起一定作用10,11。同時(shí)N 蛋白還具有免疫原性,在感染過(guò)程中大量表達(dá)12,13。1995年后,國(guó)內(nèi)先后有人分離到一種以雞的腺胃腫大為致病特征的IBV 14,15。為了探討IBV 遺傳變

7、異的機(jī)理,我們?cè)贗BV Z J 971株、N 株和X 株的致病型及S1基因變異機(jī)理的基礎(chǔ)上16-18,進(jìn)一步分析了不同組織嗜性IBV 毒株的N 基因的遺傳變異特征。材料與方法1病毒及載體IBV -Z J971(嗜腺胃毒株、N 和X (嗜腎毒株株由本實(shí)驗(yàn)室分離(19951999年間浙江省某些養(yǎng)殖場(chǎng)感染的雞群14,16。IBV H52毒株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。質(zhì)粒載體pBluescript SK (+及大腸桿菌DH5(R -,M -,Amp -由本實(shí)驗(yàn)室保存。2試劑Trizol Reagent 購(gòu)自GIBCO 公司。cDNA 合成試劑盒及UN IQ -5柱離心式膠回收試劑盒、Taq Plus DNA

8、Polymerase 、Eco R 、Hin d 、T4DNA 連接酶及dN TP Mix 等,購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。3引物設(shè)計(jì)根據(jù)G enBank 已發(fā)表的IBV Beaudette 株核衣殼基因序列自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1和P2。P1:5-CG第19卷第1期2003年3月病毒學(xué)報(bào)CHIN ESE JOURNAL OF VIROLO GY Vol.19No.1March 2003G AA TTC A TGGCAA GCGGTAAA GCA G-3與N基因5末端序列相同;P2:5-CCC AAG CTT ACTCAAAGTTCATT2 CTCTCC-3與N基因3末端序列互補(bǔ)。加框部

9、分為加入的酶切位點(diǎn)。4病毒繁殖及RNA的抽提將種毒接種10日齡SPF雞胚,收獲感染雞胚尿囊液后用PEG6000以透析法將其濃縮近50倍。Trizol試劑抽提RNA。5RT-PCR用P2作引物,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈。PCR反應(yīng)體系為:反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1l、滅菌雙蒸水4015l,10×PCR buffer5l,dN TP Mix(10mmol/L1l,P1 (12mol/L1l和P2(12mol/L1l。95預(yù)變性5min后加入015l Taq Plus DNA聚合酶,942min,然后進(jìn)入9445s,5545s,722min,共35個(gè)循環(huán);72延伸10min。最后用1%瓊脂糖凝

10、膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。6N基因的分子克隆及序列測(cè)定首先利用1%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物,然后用膠回收試劑盒回收,得到純化的PCR產(chǎn)物,產(chǎn)物和載體pBS質(zhì)粒各自經(jīng)Eco R、Hin d 37酶切215h。取pBS1l和PCR產(chǎn)物7l經(jīng)455min 反應(yīng)后,加入連接Buffer1l和T4DNA連接酶1l,16連接過(guò)夜,次日連接物經(jīng)65滅活10min。轉(zhuǎn)化感受態(tài)E1coli DH5,涂布于含Amp/X-gal/IPTG的固體培養(yǎng)基中,37培養(yǎng)18h20h。挑取白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,37振蕩培養(yǎng)12h。選取經(jīng)過(guò)酶切及PCR鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定,每個(gè)毒株選2個(gè)克隆進(jìn)行。7序列分析應(yīng)用P

11、Cgene和DNA Star軟件進(jìn)行序列分析。結(jié)果1N基因的RT-PCR產(chǎn)物大小采用本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的特異性引物,以IBV-Z J971、N、X和H52的基因組RNA為模板進(jìn)行R T -PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),有一條分子量為1123kb大小的條帶,與預(yù)期擴(kuò)增的基因大小結(jié)果相符(圖1。2N基因的限制性酶切片段分析3N基因重組子質(zhì)粒鑒定及核苷酸序列測(cè)定含有IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,可獲得一條1.23kb的條帶,證明IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因已被克隆到載體pBS SK(+中。重組質(zhì)粒經(jīng)核苷酸序列測(cè)定,IBV-Z J971、H52、

12、N和X毒株N基因的ORF由1230bp組成,編碼409個(gè)氨基酸;它們的G enBank Accession number分別為AF352308; AF352310、AF352309、A Y043315,序列分析發(fā)現(xiàn),在X和N株868位處有一個(gè)Hi n d的酶切位點(diǎn) 。圖1RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure1Result of RT-PCR amplification ofnucleocapsid protein gene of IBVM.Marker(3000bp-100bp;11IBV-Z J971strain;2.IBV-H52 strain;3.IBV-X strain;4.IBV-N

13、 strain.圖2RT-PCR產(chǎn)物Hin d酶切分析Figure2Restriction endonuclease Hin dmap ofRT-PCR product of nucleocapsid proteingene of IBVM.Marker(3000bp-100bp;1.IBV-X strain;2.IBV-N strain; 3.IBV-Z J971strain;4.IBV-H52strain.4不同組織嗜性IBV毒株N基因核苷酸及編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)分析IBV-Z J971、H52、N和X毒株與來(lái)自G enBank 的IBV-Beaudette、M41、Ark99、Cu/T2、D

14、1466、De072、Vic S、Gray株比較,Z J971株與它們的N蛋白的核苷酸序列同源性在8812%9816%,氨基酸序列同源性在9112%9718%;N株則分別為8616%8714%和9015%9115%;X株分別為8613%8714%和9010%9115%;H52株分別為9014%9813%和9210%9810%(表1。IBV-Z J971、H52、N和X毒株N基因核苷酸與來(lái)自G enBank的IBV-Beaudette、M41、Ark99、6病毒學(xué)報(bào)19卷Cu/T2、D1466、De072、Vic S、Gray株比較,X和N 株N基因的核苷酸序列共發(fā)生128個(gè)點(diǎn)突變,這些點(diǎn)突變呈

15、散在分布,涉及整個(gè)ORF,但在500750位及850900位之間突變率較高,分別達(dá)19%和24%。同時(shí),X株和N株皆存在15個(gè)連續(xù)點(diǎn)突變。而Z J971與其它毒株相比,散在分布有59個(gè)點(diǎn)突變,僅存在5個(gè)連續(xù)突變。表1IBV的N蛋白基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列的同源性(%Amino acid sequence on the left;nucleotide sequence on the right.雖然N基因核苷酸的點(diǎn)突變較多,X株和N株N蛋白的氨基酸序列分別僅有17個(gè)和18個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變,而Z J971株有15個(gè)位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變,顯然N基因核苷酸突變有較多的靜默突變。IBV-Z J971、

16、N和X毒株N基因蛋白變異的共同點(diǎn)是以氨基酸的點(diǎn)突變?yōu)樘卣?且呈散在分布,但I(xiàn)BV嗜腎X和N株主要集中第189336位。與G enBank中僅存的8個(gè)IBV株的N基因蛋白氨基酸序列比較,發(fā)現(xiàn)第46、48、64、73、80、108、118、194、237、299、351、360、366位為高發(fā)性突變位點(diǎn),突變率高達(dá)25%42%。根據(jù)N基因核苷酸和推導(dǎo)出的氨基酸序列的同源性,應(yīng)用DNA Star軟件分析N基因進(jìn)化(圖3,結(jié)果顯示:這些IBV-Z J971、N、X、H52等12個(gè)病毒株可分成3組,其中第組包括Z J971、D1466和Cu/T2、Ark99、De072、Gray株,其中Z J971和D

17、1466株親緣關(guān)系最密切;第組包括Beaudette、H52、M41和Vic S株;第組包括N和X株,IBV 嗜腎毒株與上述被分析的毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 。圖3N蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure3Phylogenetic tree of nucleocapsid protein of some IBV strains討論根據(jù)臨床病變特征,IBV毒株主要可分為嗜呼吸道、嗜腎和嗜腺胃毒株三類。Ark99、Vic S、D1466、M41、De072、H52、Cu/T2、Beaudette株為嗜呼吸道毒株,Gray、X、N株為嗜腎毒株16,Z J971株為嗜腺胃毒株14,17。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí),N蛋白與基因161期

18、周繼勇等:不同組織嗜性傳染性支氣管炎病毒核衣殼基因的遺傳變異性分析組RNA包裝信號(hào)序列的相互作用(N-RNA有助于病毒mRNA的合成和螺旋狀核衣殼的形成19,20。冠狀病毒的N-RNA相互作用較之非冠狀病毒高效,提示N蛋白可能參與調(diào)節(jié)病毒RNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄21,22。本研究從N基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白分析,嗜腺胃IBV-Z J971株N 蛋白的不同于其他組織嗜性,IBV的顯著特點(diǎn)是, 111、117、142、171和401位的氨基酸突變,即H111 D、S117A、V142L、P171A和E401D;嗜腎IBV-N株和X株N蛋白不同于其他組織嗜性IBV特有的突變是,46、48、189、

19、190、220、223、236、237、240、286、299、301、334、335、336、351位氨基酸的突變,即A46 S、A48P、L189R、N190S、E220D、I223A、V236Y、S237K、K240Q、Q286R、T299K、R301E、E334D、V335E、V336P和T351S;X、N株與其他IBV具有很遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。嗜腎IBV-N株和X株N蛋白氨基酸的變異特征,與Williams等人的“N蛋白中間區(qū)域尤其保守”的觀點(diǎn)不一致8。因此,我們認(rèn)為嗜腺胃IBV-Z J971株、嗜腎IBV-N株和X株各自均存在不同于呼吸型IBV毒株的特征,是IBV新的變異株。同時(shí)IBV

20、組織嗜性的形成和改變可能與N基因的變異有關(guān)。從N基因角度我們發(fā)現(xiàn),嗜腺胃IBV-Z J971株與荷蘭的疫苗株D1466關(guān)系具有很高的同源性和最近親緣關(guān)系,而Z J971株S基因具有與M41株的S基因同源性較高和親緣關(guān)系最近的特征18,因此從進(jìn)化角度分析,嗜腺胃IBV毒株S基因與N基因變異不一致。我們認(rèn)為Z J971是一重組病毒,就其形成機(jī)制,嗜腺胃IBV來(lái)源可能是其他組織嗜性IBV在動(dòng)物體內(nèi)某種酶作用下發(fā)生突變所致。參考文獻(xiàn):1Jia W,K araca K,Parrish C R,et al.A novel variant of avian infec2tious bronchitis vi

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33、ty ,Hangz hou 310029,Chi na Abstract :Two specific primers were designed according to the published sequence of nucleocapsid (N protein gene of strain Beaudette of infectious bronchitis virus (IBV from G enBank.cDNA of N gene was amplified by re 2verse transcription polymerase chain reaction (R T -P

34、CR from viral RNAs of proventriculopathogenic IBV strain Z J 971,nephropathogenic IBV strains N ,X and IBV vaccine strain H52res pectively.They were cloned into vec 2tor pBluescript SK (+and sequenced by the dideoxy -mediated chain termination method.The results indicat 2ed that the complete open reading frame (ORF of N gene is 1230bp