1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 熒光分光光度法熒光分光光度法測(cè)定諾氟沙星片的含量測(cè)定諾氟沙星片的含量 儀器名稱(chēng)儀器名稱(chēng)熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)國(guó)別廠家：日本島津公司國(guó)別廠家：日本島津公司 儀器型號(hào)：儀器型號(hào)：RF-5301PC一一 概述概述 什么是熒光呢？當(dāng)紫外光照射到某些物質(zhì)的時(shí)候，什么是熒光呢？當(dāng)紫外光照射到某些物質(zhì)的時(shí)候，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的可見(jiàn)這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的可見(jiàn)光光，而當(dāng)紫外光停止照射時(shí)，這種光線(xiàn)也隨之很快地消而當(dāng)紫外光停止照射時(shí)，這種光線(xiàn)也隨之很快地消失，這種光線(xiàn)稱(chēng)為熒光。第一次發(fā)現(xiàn)熒光現(xiàn)象失，這種光線(xiàn)稱(chēng)為熒光。第一次發(fā)現(xiàn)熒光現(xiàn)象的是的是1616世紀(jì)西班牙的內(nèi)

2、科醫(yī)生和植物學(xué)家世紀(jì)西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.MonardesN.Monardes, ,提提出到在含有一種稱(chēng)為出到在含有一種稱(chēng)為“Lignum NephriticumLignum Nephriticum”的木的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛(ài)的天藍(lán)色。頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛(ài)的天藍(lán)色。 直到直到18521852年年StokesStokes在考察奎寧和葉綠素的在考察奎寧和葉綠素的熒光時(shí)，用分光計(jì)觀察到其熒光的波長(zhǎng)比熒光時(shí)，用分光計(jì)觀察到其熒光的波長(zhǎng)比入射光的波長(zhǎng)稍長(zhǎng)些，才判明這種現(xiàn)象是入射光的波長(zhǎng)稍長(zhǎng)些，才判明這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長(zhǎng)這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)

3、射不同波長(zhǎng)的光，而不是由光的漫射作用所引起的，的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念。到從而導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念。到1919世世紀(jì)末人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、紀(jì)末人們已經(jīng)知道了包括熒光素、曙紅、多環(huán)芳烴等多環(huán)芳烴等600600種以上的熒光物質(zhì)。種以上的熒光物質(zhì)。 20 20世紀(jì)以來(lái)，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，世紀(jì)以來(lái)，熒光現(xiàn)象被研究得更多了，發(fā)現(xiàn)了共振熒光、增感熒光，能夠進(jìn)行熒光產(chǎn)發(fā)現(xiàn)了共振熒光、增感熒光，能夠進(jìn)行熒光產(chǎn)率得絕對(duì)測(cè)定，還進(jìn)行了熒光壽命的直接測(cè)定率得絕對(duì)測(cè)定，還進(jìn)行了熒光壽命的直接測(cè)定等等。等等。 熒光分析方法的發(fā)展，與儀器應(yīng)用是分不熒光分析方法

4、的發(fā)展，與儀器應(yīng)用是分不開(kāi)的。開(kāi)的。1919世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行世紀(jì)以前，熒光的觀察是靠肉眼進(jìn)行的，直到的，直到19281928年，才由年，才由JetteJette 和和WestWest提出了第提出了第一臺(tái)光電熒光計(jì)。一臺(tái)光電熒光計(jì)。19481948年由年由StuderStuder推出了第一推出了第一臺(tái)自動(dòng)光譜校正裝置，到臺(tái)自動(dòng)光譜校正裝置，到19521952年才出現(xiàn)商品化年才出現(xiàn)商品化的校正光譜儀器。的校正光譜儀器。 近幾十年來(lái)，在其它學(xué)科迅速發(fā)展的影響近幾十年來(lái)，在其它學(xué)科迅速發(fā)展的影響下，隨著激光、微處理機(jī)和電子學(xué)的新成就等下，隨著激光、微處理機(jī)和電子學(xué)的新成就等一些新的科學(xué)

5、技術(shù)的引入，大大推動(dòng)了熒光分一些新的科學(xué)技術(shù)的引入，大大推動(dòng)了熒光分析方法在理論方面的進(jìn)展，并且相應(yīng)地加速了析方法在理論方面的進(jìn)展，并且相應(yīng)地加速了各式各樣新型熒光分析儀器的問(wèn)世，使熒光分各式各樣新型熒光分析儀器的問(wèn)世，使熒光分析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動(dòng)化的方析法不斷朝著高效、痕量、微觀和自動(dòng)化的方向發(fā)展，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和選擇性日益向發(fā)展，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和選擇性日益提高，方法的應(yīng)用范圍很寬，包括工業(yè)、農(nóng)業(yè)、提高，方法的應(yīng)用范圍很寬，包括工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、公安情報(bào)和科學(xué)研究等醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、公安情報(bào)和科學(xué)研究等各個(gè)領(lǐng)域中。如今，熒光分析法已發(fā)展為一種各個(gè)領(lǐng)域

6、中。如今，熒光分析法已發(fā)展為一種重要且有效的光譜化學(xué)分析手段。重要且有效的光譜化學(xué)分析手段。工作工作原理原理熒光分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)和原理圖熒光分光光度計(jì)基本結(jié)構(gòu)和原理圖 由光源氙弧燈發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成由光源氙弧燈發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大

7、器放大輸至記錄儀，激發(fā)光生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀，激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸輪所控制，當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí)，輪所控制，當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí)， 將激發(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)膶⒓ぐl(fā)光單色器的光柵，固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，激發(fā)光波長(zhǎng)處，而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上，將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上，所記錄的光譜即發(fā)射光譜（所記錄的光譜即發(fā)射光譜（emission emission spectrumspectrum）, ,簡(jiǎn)稱(chēng)熒光光譜。簡(jiǎn)稱(chēng)熒光光譜。 當(dāng)測(cè)繪

8、熒光激發(fā)光譜時(shí)，將熒光單色當(dāng)測(cè)繪熒光激發(fā)光譜時(shí)，將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處，只器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處，只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動(dòng)，將各波長(zhǎng)的激發(fā)光的強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀，所記錄激發(fā)光的強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀，所記錄的光譜即激發(fā)光譜的光譜即激發(fā)光譜(excitation (excitation spectrumspectrum）。）。 下圖為諾氟沙星的激發(fā)光譜下圖為諾氟沙星的激發(fā)光譜(A)和發(fā)射光譜和發(fā)射光譜(B) 當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時(shí)，將激當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時(shí)，將激發(fā)光單色器固定在所選擇的激發(fā)光波長(zhǎng)處，發(fā)光單色器固定在所選

9、擇的激發(fā)光波長(zhǎng)處，將熒光單色器固定至所選擇的熒光波長(zhǎng)處，將熒光單色器固定至所選擇的熒光波長(zhǎng)處，由記錄儀得出的信號(hào)是樣品溶液的熒光強(qiáng)由記錄儀得出的信號(hào)是樣品溶液的熒光強(qiáng)度。度。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康? 1、掌握熒光光度法的基本原理；、掌握熒光光度法的基本原理；2 2、了解熒光分光光度計(jì)的基本操作。、了解熒光分光光度計(jì)的基本操作。二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 按照受激方法的不同，分子發(fā)光可分按照受激方法的不同，分子發(fā)光可分為不同類(lèi)型。如果分子因吸收外來(lái)輻射的為不同類(lèi)型。如果分子因吸收外來(lái)輻射的光子能量而被激發(fā)，所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)光子能量而被激發(fā)，所產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)為光致發(fā)光；如果分子的激發(fā)能量是由反

10、為光致發(fā)光；如果分子的激發(fā)能量是由反應(yīng)的化學(xué)能或由生物體釋放出的能量所提應(yīng)的化學(xué)能或由生物體釋放出的能量所提供，其發(fā)光現(xiàn)象分別稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光和生物供，其發(fā)光現(xiàn)象分別稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光和生物發(fā)光。發(fā)光。 通俗地講，當(dāng)紫外光或可見(jiàn)光照射某些物通俗地講，當(dāng)紫外光或可見(jiàn)光照射某些物質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同質(zhì)時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)發(fā)射出各種顏色和不同強(qiáng)度的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)光，而當(dāng)紫外光停強(qiáng)度的波長(zhǎng)更長(zhǎng)的可見(jiàn)光，而當(dāng)紫外光停止照射時(shí)，這種光線(xiàn)也隨之很快地消失，止照射時(shí)，這種光線(xiàn)也隨之很快地消失，這種光線(xiàn)稱(chēng)為熒光。按分子激發(fā)態(tài)的類(lèi)型這種光線(xiàn)稱(chēng)為熒光。按分子激發(fā)態(tài)的類(lèi)型來(lái)劃分時(shí)，由第一電子激發(fā)單重態(tài)的產(chǎn)生來(lái)劃分時(shí)，

11、由第一電子激發(fā)單重態(tài)的產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)為熒光，的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)為熒光，而由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射而由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷，其發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)為磷光，如圖所示。躍遷，其發(fā)光現(xiàn)象稱(chēng)為磷光，如圖所示。 熒光是物質(zhì)在吸光之后發(fā)射出的波長(zhǎng)熒光是物質(zhì)在吸光之后發(fā)射出的波長(zhǎng)較長(zhǎng)的輻射，因此，溶液的熒光強(qiáng)度較長(zhǎng)的輻射，因此，溶液的熒光強(qiáng)度(F)(F)與該溶液的吸光程度及溶液中熒光物質(zhì)的與該溶液的吸光程度及溶液中熒光物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率有關(guān)。熒光定量分析基于下熒光量子產(chǎn)率有關(guān)。熒光定量分析基于下式公式：式公式： F=2.303IF=2.303IO ObC=kCbC=

12、kC式中式中:F:F為熒光強(qiáng)度為熒光強(qiáng)度, I, Io o為入射光強(qiáng)度，為入射光強(qiáng)度，為物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，為物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，為摩爾吸光系為摩爾吸光系數(shù)，數(shù)，b b為光程，為光程，C C為熒光物質(zhì)的濃度。以為熒光物質(zhì)的濃度。以F-F-C C或或logF-logClogF-logC作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品測(cè)其測(cè)其F F值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得相應(yīng)濃度，值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得相應(yīng)濃度，即可計(jì)算出含量。即可計(jì)算出含量。三、試劑三、試劑1.1.諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制2.2.各種不同各種不同pHpH緩沖溶液的配制緩沖溶液的配制 四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1 1、掃描諾氟沙星的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜、掃描諾氟沙星的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜2 2、酸度對(duì)諾氟沙星熒光強(qiáng)度影響、酸度對(duì)諾氟沙星熒光強(qiáng)度影響的測(cè)定的測(cè)定3 3、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定、諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定4 4、諾氟沙星藥片的測(cè)定、諾氟沙星藥片的測(cè)定五、數(shù)據(jù)處理五、數(shù)據(jù)處理 1.1.以以F