1、食品中蛋白質(zhì)的測定食品中蛋白質(zhì)的測定GB5009.5-2010第一法：凱氏定氮法第一法：凱氏定氮法內(nèi)容梗概GB 5009.5-2010 內(nèi)容簡介食品中蛋白質(zhì)檢測方法簡介第一法：凱氏定氮法（詳細(xì)）第二法：分光光度法（略）第三法：燃燒值法（略）GB 5009.5-2010 內(nèi)容簡介食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定于2010年3月26日發(fā)布，2010年6月1日實施。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5009.5-2003食品中蛋白質(zhì)的測定、GB/T 14771-1993食品中蛋白質(zhì)的測定方法和GB/T 5413.1-1997嬰幼兒配方食品和乳粉蛋白質(zhì)的測定。統(tǒng)一了食品中蛋白質(zhì)的測定方法，強制性GB 5009.

2、5-2010 內(nèi)容簡介本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 5009.5-2003相比主要修改如下：在第一法中增加了自動蛋白質(zhì)測定儀的方法；增加了燃燒法，作為第三法；修改了換算系數(shù)；（復(fù)合配方食品為6.25）對計算結(jié)果的有效數(shù)字規(guī)定進行了修改；（蛋白質(zhì)含量1 g/100 g 時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量1 g/100 g 時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字）增加pH計對滴定終點的判定。蛋白質(zhì)概況蛋白質(zhì)是含氮的有機化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五種元素組成。某些蛋白質(zhì)中還含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。在食品和生物材料中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿

3、等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。蛋白質(zhì)檢測方法簡介測定蛋白質(zhì)含量的常規(guī)方法有五種： 1、凱氏定氮法 2、乙酰丙酮比色法？ 3、雙縮脲比色法等， （這些方法均存在著樣品需要預(yù)處理、操作繁瑣耗時等缺點。但凱氏定氮法和乙酰丙酮比色法作為我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，分析成本低，測定結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)用十分廣泛。）蛋白質(zhì)檢測方法簡介4、近紅外光譜技術(shù)是20世紀(jì)80年代后期迅速發(fā)展起來的一項物理測試技術(shù)。近紅外透射或反射光譜具有分析樣品用量少、分析速度快和結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，在食品分析領(lǐng)域已經(jīng)逐步得到了應(yīng)用。5、杜馬斯燃燒法比凱氏定氮法還早，近年來杜馬斯燃燒法測定飼料、肥料等農(nóng)產(chǎn)品中氮含量在我國也有了應(yīng)用。蛋白質(zhì)檢

4、測方法簡介目前國家標(biāo)準(zhǔn)中用于檢測食品中蛋白質(zhì)的方法共有三種： 1、凱氏定氮法（適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測定） 2、乙酰丙酮分光光度法（適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測定） 3、燃燒法（適用于蛋白質(zhì)含量在10 g/100 g 以上的糧食、豆類、奶粉、米粉、蛋白質(zhì)粉等固體試樣的篩選測定）不適用于添加無機含氮物質(zhì)、有機非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的食品測定。凱氏定氮方法簡介凱氏定氮法是1883年Kjeldahl發(fā)明，當(dāng)時凱氏只使用H2SO4來分解試樣，來定量谷物中的蛋白質(zhì)，后來由Gunning加入改進，在消化時加入K2SO4使沸點上升，加快分解速度，凱氏定氮法至今仍在使用。根據(jù)食品中蛋白質(zhì)含量不同又分為凱氏定氮常量法

5、、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。第一法：凱氏定氮法原理：食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或者鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。其反應(yīng)方程式如下： 蛋白質(zhì)+ H2SO4 （NH4） 2SO4（NH4NH4）2SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO42SO4+NaOH=NH4OH+Na2SO4 NH4OH H2O + NH3 NH4OH NH4OH H2O + NH3 NH4OH NH3+( NH3+(標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)) H2SO4) H2SO4（NH4NH4）2

6、SO42SO4 ( (標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)) H2SO4+NaOHNa2SO4+H2O) H2SO4+NaOHNa2SO4+H2O注：凱氏定氮法所測得的含氮量為食品的總氮量，其中還包括少量的非蛋白氮，如尿素氮、游離氨氮、生物堿氮、無機鹽氮等，由凱氏定氮法測得的蛋白質(zhì)稱為粗蛋白質(zhì)。 試劑和材料除非另有規(guī)定，本方法中所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682 規(guī)定的三級水。4.1 硫酸銅（CuSO45H2O）。4.2 硫酸鉀（K2SO4）。4.3 硫酸（H2SO4 密度為1.84Kg/L）。4.4 硼酸（H3BO3）。4.5 甲基紅指示劑（C15H15N3O2）。4.6 溴甲酚綠指示劑（C21H14Br4O5

7、S）。4.7 亞甲基藍(lán)指示劑（C16H18ClN3S3H2O）。4.8 氫氧化鈉（NaOH）。4.9 95%乙醇（C2H5OH）。試劑和材料4.10 硼酸溶液（20 g/L）：稱取20 g 硼酸，加水溶解后并稀釋至1000 mL。4.11 氫氧化鈉溶液（400 g/L）：稱取40 g 氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100 mL。4.12 硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.0500 mol/L）或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.0500 mol/L）。4.13 甲基紅乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。4.14 亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g

8、 亞甲基藍(lán)，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。試劑和材料4.15 溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1g 溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。4.16 混合指示液：2 份甲基紅乙醇溶液（4.13）與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液（4.14）臨用時混合。也可用1 份甲基紅乙醇溶液（4.13）與5 份溴甲酚綠乙醇溶液（4.15）臨用時混合。儀器和設(shè)備天平：感量為1mg。定氮蒸餾裝置：如圖自動凱氏定氮儀。樣品處理稱取充分混勻的固體試樣0.2 g-2 g、半固體試樣 2 g-5 g 或液體試樣10 g-25 g（約相當(dāng)于30 mg-40 mg 氮），精確至0.001

9、g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸銅、6 g 硫酸鉀及20 mL 濃硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5 h-1 h。取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。蒸餾按圖裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3 處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液（1 g/L）數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保

10、持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。向接收瓶內(nèi)加入10.0 mL 硼酸溶液(4.10)及1 滴-2 滴混合指示液并使冷凝管的下端插入液面下，根據(jù)試樣中氮含量，準(zhǔn)確吸取2.0 mL-10.0 mL（舊10） 試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室，以10 mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0 mL 氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。接收、滴定蒸餾10 min (舊5）后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。以硫酸或鹽酸

11、標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點，其中2 份甲基紅乙醇溶液與1 份亞甲基藍(lán)乙醇溶液指示劑，顏色由紫紅色變成灰色，pH 5.4；1 份甲基紅乙醇溶液與5 份溴甲酚綠乙醇溶液指示劑，顏色由酒紅色變成綠色，pH 5.1。同時作試劑空白。分析結(jié)果的表述分析結(jié)果的表述0.0140 1.0 mL 硫酸c (1/2H2SO4)1.000 mol/L或鹽酸c (HCl) 1.000 mol/L標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）；M 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；F 氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為6.25；純?nèi)榕c純?nèi)橹破窞?.38；面粉為5.70；玉米、高粱為6.24；花生為5.46；大米為5.95；大豆及其粗加

12、工制品為5.71；大豆蛋白制品為6.25；肉與肉制品為6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵為5.30；復(fù)合配方食品為6.25。乳制品中蛋白質(zhì)的含量要結(jié)合具體的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)進行轉(zhuǎn)換和計算。結(jié)果表示以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，蛋白質(zhì)含量1 g/100 g 時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字；蛋白質(zhì)含量1 g/100 g 時，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10 %。各步驟詳解整個過程分四步：1、消化2、蒸餾3、吸收與滴定4、計算第一步：樣品消化樣品與硫酸一起加熱消化，硫酸使有機物脫水。并破壞有機物，使有機

13、物中的C、H氧化為CO2和H2O蒸汽逸出，而蛋白質(zhì)則分解氮，則與硫酸結(jié)合成硫酸銨，留在酸性溶液中。下面注意幾種試劑的作用：硫酸鉀的作用：添加硫酸鉀可以提高溫度加快有機物分解，它與硫酸反應(yīng)生成硫酸氫鉀，可提高反應(yīng)溫度，一般純硫酸加熱沸點330，而添加硫酸鉀后，溫度可達(dá)400，加速了整個反應(yīng)過程。硫酸鉀加入量不能太大，否則溫度太高，生成的硫酸氫銨也會分解，放出氨而造成損失。 濃硫酸的作用:1、脫水使有機物炭化，然后有機物炭化生成碳，碳將H2SO4還原為SO2，本身則變?yōu)镃O22、氧化3、蛋白質(zhì)與濃H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2O4、與NH3生成硫酸銨 其他試劑的作用硫酸銅，氧化汞或硒粉

14、，催化劑，加快反應(yīng)速度（但為了防止污染通常使用硫酸銅，所以有機物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑）。 有的加少量過氧化氫、次氯酸鉀作為氧化劑。50%NaOH的作用 蒸餾時使溶液呈堿性 第二步蒸餾：樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，在這操作中。一是加入氫氧化鈉溶液要過量，如果NaOH量加的不夠就變成H2S， H2S是強酸，使顏色變紅。二是要防止樣液中氨氣逸出。第三步吸收與滴定：蒸餾過程中放出的氨可用一定量的標(biāo)準(zhǔn)硫酸或標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進行氨的吸收，然后再用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液反滴定過剩的硫酸或鹽酸溶液，從而計算出總氮量。（全量）半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸直

15、接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。（用硼酸代替H2SO4，這樣可省略了反滴定，H2SO4是強酸，要求較嚴(yán)，而硼酸是弱酸，在滴定時，不影響指示劑變色范圍，另外硼酸為吸收液濃度在3%以上可將氨完全吸收，為保險起見一般用4%）。滴定滴定終點至灰色或藍(lán)紫色 實驗注意事項u1.樣品應(yīng)是均勻的，若是固體樣品應(yīng)事先研細(xì)，液體樣要混合均勻。u2.樣品放入K氏燒瓶時，不要粘在瓶頸上，萬一粘附可用少量水緩慢沖下，以免被檢樣消化不完全，使結(jié)果偏低。u3.消化時，如不容易呈透明溶液，可將K氏燒瓶放冷后，加入30%過氧化氫催化劑23ml，促使氧化。u4.在整個消化過程中，不要用強火

16、，保持和緩的沸騰，使火力集中在K氏燒瓶底部，以免附在壁上的蛋白質(zhì)在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。u5.如硫酸缺少，過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這時會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用，樣品中脂肪含量過高時或取樣量較大時，要添加硫酸量，若如干試樣超過5 g 可按每克試樣5 m1的比例增加硫酸用量。 實驗注意事項6.蒸餾裝置不能漏氣。氨是否完全蒸餾出來，PH試紙檢查餾出液是否為堿性。7.向蒸餾瓶中加入濃堿時，往往出現(xiàn)褐色沉淀。這時由于分解促進劑與加入的硫酸銅反應(yīng)，生成氫氧化銅，經(jīng)加熱后又分解生成氧化銅的沉淀，有時Cu離子與氨作用生成深蘭色的絡(luò)合物。8.蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1

17、分鐘后關(guān)掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。自動凱氏定氮儀法稱取固體試樣0.2 g-2 g、半固體試樣2 g-5 g 或液體試樣10 g-25 g（約相當(dāng)于30 mg-40 mg 氮），精確至0.001 g。按照儀器說明書的要求進行檢測。大多數(shù)實驗室用FOSS的自動定氮儀，準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性好。樣品消化時可低溫烘干后進行，不起大泡飛濺。34自動凱氏定氮儀法 在凱氏定氮法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的自動凱氏定氮儀法，具有安全、高效、準(zhǔn)確的優(yōu)點。儀器： 自動蒸餾裝置消化爐凱氏定氮儀設(shè)備操作sop1、確保儀器運行正常、管道內(nèi)部干凈、管道及其連接口密封性好2、準(zhǔn)備好吸收液（20ml 2%硼酸 +幾滴混合指示劑）并做好標(biāo)記3、檢查堿溶液及純化水桶是否與儀器連接好，放入盛裝消化好樣品的消化瓶，放入盛裝吸收液的錐形瓶并保證管口插入液面下。4、設(shè)置并啟動程序程序設(shè)置步驟加堿或加水時間蒸餾時間C0（樣品檢測)E0（加堿）5sE04minC1（樣品間清洗）E10sE12minC2（試驗結(jié)束后第一次清洗）E2（加水）20sE2