1、多重PCR分析檢測和定量分析小定鞭金藻（定鞭藻門）的物種特異性孫勇摘要 多重PCR用于檢測和定量分析小定鞭金藻的物種和基因特異性，以基因組基因為模版，用一套引物特異性的擴(kuò)增四種具有基因特異性的PCR產(chǎn)物，通過普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳可以產(chǎn)生診斷條帶，熒光分子標(biāo)記被用于實時定量PCR（qPCR），通過分離小定鞭金藻及其相關(guān)物種，對其物種和基因特異性加以評價，用定量PCR進(jìn)行評估環(huán)境樣品中藻類數(shù)目可比從人工計數(shù)得到平均值有較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差。這顯著的改善了基于DNA的檢測技術(shù)，通過快速同時測定四種特異性條帶，可以區(qū)分一些長期地理隔離的小定鞭金藻。引言 小定鞭金藻與世界范圍內(nèi)很多魚類的死亡，快速的

2、從水體中檢測出來該藻顯得十分必要，早期的檢測往往有缺憾，包括光學(xué)顯微鏡檢測溶血性檢測，但這些檢測方法對低濃度的金藻無能為力。有一些分子生物學(xué)的替代方案用于檢測，如實時定量PCR，為了擴(kuò)大檢測范圍改善檢測方法，使用多重?zé)晒釶CR，在普通PCR的基礎(chǔ)上加入多對引物，以增加遺傳標(biāo)記的數(shù)目，使PCR不需要經(jīng)過凝膠電泳就能分析，縮短了檢測時間。實驗及結(jié)果先選取相應(yīng)引物，進(jìn)行單引物擴(kuò)增，獲得特異性條帶，并測定序列，單引物擴(kuò)增后多引物擴(kuò)增，實驗及結(jié)果 多引物擴(kuò)增采用選取四個引物GMP1,SYNAP1,FUCO,GST，由于小定鞭金藻多以單藻形式生存，而常規(guī)PCR也不能給出相關(guān)藻類濃度方面的信息，所以根據(jù)所測

3、定的序列使用特異性熒光分子信標(biāo)，實時定量PCR（QPCR），根據(jù)熒光量得到相應(yīng)藻類的含量，用QPCR檢測了六個藻種（TX,SC,ME,UK,N1,N2,PAT）實驗及結(jié)果 其中只有FUCO熒光信號在六個物種中均有存在，確定使用FUCO進(jìn)行QPCR，然后DNA的濃度梯度評估，細(xì)胞濃度梯度評估，以確定不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使他們可以用于定量未知樣本，得到DNA用量和細(xì)胞用量與信號強度的關(guān)系。DNA的量小于10pg大于50ng均得不到理想的曲線細(xì)胞用量小于100，大于10000個也得不到理想的曲線分別得到DNA用量和細(xì)胞用量與QPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線然后測定信號大小根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)藻類的量討論 討論本測定的效率隨地理隔離距離的增加而下降，也取決于探針的特異性和靈敏度，實驗中可知每個探針的靈敏度是不同的，在此次實驗中其他的地理植株沒有被探測就是因為沒有選取到特異性比較好的探針（引物），進(jìn)一步的實驗應(yīng)當(dāng)尋找更加保守的DNA區(qū)域，更敏感的引物。討論 本實驗表明多重QPCR可以用于小定鞭金藻的檢測，快速切特異性好。傳統(tǒng)多重PCR需要7個小時完成，而多重QP