1、基因工程概念基因工程概念 基因工程是指按照人們的意愿，進行基因工程是指按照人們的意愿，進行嚴格的設計，并通過嚴格的設計，并通過體外體外DNADNA重組重組和和轉轉基因基因等技術，賦予生物以等技術，賦予生物以新的遺傳特性新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。物類型和生物產(chǎn)品。 由于基因工程是在由于基因工程是在DNADNA分子水平分子水平上進上進行設計和施工的，因此又叫做行設計和施工的，因此又叫做DNADNA重組重組技術技術?；蚬こ滔嚓P要點基因工程相關要點基因工程相關要點基因工程相關要點2、基本工具：、基本工具： “分子手術刀分子手術刀

2、”: “分子縫合針分子縫合針”: 基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體:3、基本操作步驟：基本操作步驟： 1 1、目的基因的、目的基因的獲取獲取 2 2、基因表達載體的、基因表達載體的構建構建（核心）（核心）3 3、將目的基因、將目的基因導入導入受體細胞受體細胞 4 4、目的基因的、目的基因的檢測檢測與鑒定與鑒定 黏性末黏性末端端黏性末端黏性末端 1.1.限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶EcoRI一、基因工程的基本工具一、基因工程的基本工具 來源：來源：原核生物原核生物 作用特點：作用特點：特異性，即識別特異性，即識別特定核苷酸序列（反向對特定核苷酸序列（反向對稱重復排列）稱重復排列）

3、，切割，切割特定切點（磷酸二酯鍵）。特定切點（磷酸二酯鍵）。 結果：結果：產(chǎn)生黏性末端產(chǎn)生黏性末端（EcoRI）（堿基互補配對）或平（堿基互補配對）或平末端末端（SmaI）。1 1、限制性核酸內切酶、限制性核酸內切酶-“-“分子手術刀分子手術刀” 2.DNA2.DNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針”1)種類：種類：2)作用部位：作用部位：Ecoli DNA連接酶連接酶（黏性末端）（黏性末端）T4 DNA連接酶連接酶 （黏性末端和平末端）（黏性末端和平末端）磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 DNA連接酶連接酶可把平末端或黏性末端之間的縫隙可把平末端或黏性末端之間的縫隙“縫合縫合”起來，即相當于把梯子兩邊

4、的扶手的斷起來，即相當于把梯子兩邊的扶手的斷口連接起來，這樣一個口連接起來，這樣一個重組重組DNA分子分子就形成了。就形成了。對比DNA聚合酶具有具有1至多個至多個限制酶切點限制酶切點，供外，供外源源DNADNA片段插入片段插入在受體細胞中在受體細胞中能復制并穩(wěn)定保存能復制并穩(wěn)定保存具有具有標記基因標記基因，供重組，供重組DNADNA的鑒的鑒定和選擇定和選擇對宿主細胞無害對宿主細胞無害作用：作用：將外源基因送入受體細胞。將外源基因送入受體細胞。常用載體：常用載體：擬核外環(huán)狀擬核外環(huán)狀DNA （質粒）（質粒）其他種類：其他種類：噬菌體衍生物和動植物病毒噬菌體衍生物和動植物病毒條件：條件： 3.

5、3.分子運載車分子運載車載體載體質粒質粒細菌擬核細菌擬核DNADNA之外結構簡單、能之外結構簡單、能自主復自主復制制的很小的的很小的環(huán)狀環(huán)狀DNADNA分子分子。小結小結基因工基因工程程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有專一性具有專一性(識別序列識別序列)切開切開DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵種類種類E.coliDNA連接酶連接酶T4 DNADNA連接酶連接酶運載運載工具工具具備的具備的條件條件具一個或多個限制酶切位點具一個或多個限制酶切位點能在宿主細胞中自我復制并能在宿主細胞中自我復制并穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在具

6、標記基因具標記基因對宿主細胞無害對宿主細胞無害質粒、質粒、噬菌體衍生物、動植物病毒噬菌體衍生物、動植物病毒二、基因工程基本操作的四個步驟二、基因工程基本操作的四個步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達載體的構建、基因表達載體的構建3 3、將目的基因導入受體細胞、將目的基因導入受體細胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定（一）目的基因的提?。ㄒ唬┠康幕虻奶崛?.目的基因：主要是指目的基因：主要是指_ 。2.獲取方法：獲取方法：1）_中中獲取目的基因獲取目的基因2）PCR反應擴增反應擴增DNA3）人工合成法：化學方法合成）人工合成法：化學方法合成DNA片段（反轉

7、錄片段（反轉錄法、直接合成法）法、直接合成法）從基因文庫從基因文庫編碼蛋白質的結構基因編碼蛋白質的結構基因 文庫類型文庫類型cDNAcDNA文庫文庫基因組文庫基因組文庫文庫大小文庫大小基因中啟動子基因中啟動子基因中內含子基因中內含子基因多少基因多少種間基因交流種間基因交流小小大大無無有有無無有有某生物的部分某生物的部分基因基因某生物的全部基某生物的全部基因因可以可以部分可以部分可以利用利用PCRPCR技術擴增目的基因技術擴增目的基因聚合酶鏈式反應（聚合酶鏈式反應（PCRPCR）模板模板DNA DNA 4 4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸一對引物一對引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(T

8、aq酶）酶）原理：原理：DNADNA半保留復制半保留復制前提：前提：一段已知目一段已知目的基因的核苷酸序的基因的核苷酸序列列條件：條件：延伸延伸(70(70 -75-75 )變性變性(90-95(90-95 ) 退火退火(55(55 -60-60 ) 過程：過程：（二）基因表達載體構建二）基因表達載體構建1、基因表達載體由、基因表達載體由 _、_ _、_、 四部分組成。四部分組成。目的基因目的基因啟動子啟動子標記基因標記基因 終止子終止子2、啟動子作用：、啟動子作用：3、標記基因的作用：、標記基因的作用： RNA聚合酶識別和結合的位點，聚合酶識別和結合的位點，啟動轉錄的啟動轉錄的“開關開關”。

9、 鑒別受體細胞中是否含有鑒別受體細胞中是否含有目的基因目的基因 ，從普通細胞，從普通細胞中篩選出含目的基因的受中篩選出含目的基因的受體細胞體細胞（1 1）用一定的）用一定的_切割質粒，使其出現(xiàn)一個切割質粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出切口，露出_。（2 2）用）用_切斷目的基因，使其產(chǎn)生切斷目的基因，使其產(chǎn)生 _。（3 3）將切下的目的基因片段插入質粒的）將切下的目的基因片段插入質粒的_處，處，再加入適量再加入適量_，形成了一個重組，形成了一個重組DNADNA分分子（重組質粒）子（重組質粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一種限制酶同一種限制酶相同相同的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA連接酶連接

10、酶重組質粒形成過程重組質粒形成過程: :轉化轉化: :目的基因目的基因進入受體細胞內進入受體細胞內，并且在受體細胞，并且在受體細胞內維持內維持穩(wěn)定和表達穩(wěn)定和表達的過程。的過程。（三）將目的基因導入受體細胞（三）將目的基因導入受體細胞受體細胞種類受體細胞種類方法方法植物細胞植物細胞動物細胞動物細胞微生物細胞微生物細胞農桿菌轉化法（雙子葉植物、裸子植物）農桿菌轉化法（雙子葉植物、裸子植物）基因槍法（單子葉植物）基因槍法（單子葉植物）花粉管通道法花粉管通道法顯微注射技術：顯微注射技術：目的基因表達載體提純目的基因表達載體提純 取卵取卵（受精卵受精卵）顯微注射顯微注射受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育新性狀動物新

11、性狀動物用用CaCa2+2+處理處理細胞細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞表達載體與感表達載體與感受態(tài)細胞混合受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞 原核生物原核生物繁殖快、多為單細胞、遺繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少，故早期常作為受體傳物質相對較少，故早期常作為受體細胞。細胞。大腸桿菌細胞大腸桿菌細胞用用Ca2+處理處理感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞重組表達載體重組表達載體DNA溶于緩沖液溶于緩沖液混合混合導入導入分子水平檢測：分子水平檢測：檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNADNA上是否插入了目的上是否插入了目的基因：基

12、因：方法方法DNADNA分子雜交分子雜交( (探針與基因組探針與基因組DNA)DNA)檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNAmRNA：方法方法分子雜交（探針與生物體分子雜交（探針與生物體mRNAmRNA）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：方法方法抗原抗原抗體雜交抗體雜交( (生物中蛋白質與抗體生物中蛋白質與抗體) )個體水平鑒定個體水平鑒定（性狀）（性狀）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等（四）目的基因的檢測與鑒定（四）目的基因的檢測與鑒定分子探針：分子探針：同位同位素標記的素標記的目的基目的基因因的的單鏈單鏈 轉基因生物轉

13、基因生物 轉基因生物是指利用轉基因生物是指利用 技術導入技術導入 _培育出的能夠將新性狀培育出的能夠將新性狀穩(wěn)定地穩(wěn)定地_ 給后代的給后代的 生物。生物。基因工程基因工程外源基因外源基因遺傳遺傳基因工程基因工程優(yōu)點：優(yōu)點： 打破了常規(guī)育種難以突破的打破了常規(guī)育種難以突破的 _ ， _ _ 的改的改變了生物的遺傳性狀變了生物的遺傳性狀. .物種之間的界限物種之間的界限( (生殖隔離生殖隔離) )定向定向三、 基因工程的應用1、植物基因工程成果、植物基因工程成果2、動物基因工程成果、動物基因工程成果抗蟲轉基因植物抗蟲轉基因植物（抗蟲棉）（抗蟲棉）抗病轉基因植物抗病轉基因植物（病毒外殼蛋白基因）（病

14、毒外殼蛋白基因）抗逆轉基因植物抗逆轉基因植物（抗性基因）（抗性基因）改良植物品質改良植物品質（營養(yǎng)、實用、觀賞價值）（營養(yǎng)、實用、觀賞價值）提高動物生長速度提高動物生長速度（外源生長激素基因）（外源生長激素基因）改善畜產(chǎn)品質量改善畜產(chǎn)品質量生產(chǎn)藥物生產(chǎn)藥物（乳腺生物反應器）（乳腺生物反應器）做器官移植供體做器官移植供體（導入調節(jié)因子，避免（導入調節(jié)因子，避免排異反應）排異反應）基因工程藥物基因工程藥物（轉基因工程菌生產(chǎn)抗體、（轉基因工程菌生產(chǎn)抗體、細胞因子等）細胞因子等）3 3、基因診斷、基因診斷: :用放射性同位素用放射性同位素( (如如3232P)P)、熒光分子等、熒光分子等標記的標記的D

15、NADNA分子做探針，利用分子做探針，利用DNADNA分子雜交原理分子雜交原理，鑒，鑒定被檢測標本上的遺傳信息，達到檢測疾病的目的。定被檢測標本上的遺傳信息，達到檢測疾病的目的。4 4、基因治療、基因治療: :把把健康的外源基因健康的外源基因導入有基因缺陷導入有基因缺陷的細胞中，達到的細胞中，達到治療疾病的目的。治療疾病的目的。 取患者骨髓分離干細胞病毒正?；虿⑷胝；虻母杉毎⑷牖颊唧w內四、蛋白質工程概念：概念：以蛋白質分子的結構規(guī)律及其生物功能的關系作為以蛋白質分子的結構規(guī)律及其生物功能的關系作為基礎，通過基礎，通過基因修飾基因修飾或或基因合成基因合成，對現(xiàn)有的，對現(xiàn)有的蛋白質蛋白質進

16、行進行改造改造，或制造一種或制造一種新的蛋白質新的蛋白質，以滿足人類生產(chǎn)生活的需要。，以滿足人類生產(chǎn)生活的需要。原理：原理：步驟：步驟：DNADNAmRNAmRNA翻譯翻譯轉錄轉錄肽鏈肽鏈復制復制折疊折疊具有空間結具有空間結構的蛋白質構的蛋白質表達生物表達生物特有的功特有的功能或性狀能或性狀基因基因DNADNA氨基酸序列氨基酸序列多肽鏈多肽鏈蛋白質蛋白質三維結構三維結構預期功能預期功能生物功能生物功能mRNAmRNA轉錄轉錄翻譯翻譯折疊折疊DNADNA合成合成分子設計分子設計比較：基因工程和蛋白質工程比較：基因工程和蛋白質工程基因工程基因工程蛋白質工程蛋白質工程相同點相同點都要改造基因，都屬于

17、分子水平都要改造基因，都屬于分子水平產(chǎn)生新的產(chǎn)生新的基因型，無新基因基因型，無新基因基因（型）基因（型）產(chǎn)生的蛋白質產(chǎn)生的蛋白質原有的原有的可以是新的可以是新的聯(lián)系聯(lián)系蛋白質工程是以基因工程為基礎，蛋白質工程是以基因工程為基礎，是基因工程的應用和延伸；前者是基因工程的應用和延伸；前者可為后者修飾、改造酶可為后者修飾、改造酶基因工程步驟基因工程步驟1342概念：概念：原理：原理：工具工具步驟步驟應用應用基基因因工工程程小小結結限制性核酸內切酶：限制性核酸內切酶：DNA連接酶：連接酶：載體：載體：來源；作用及特點；結果來源；作用及特點；結果種類；作用種類；作用作用；必備條件；常用載體作用；必備條件；常用載體目的基