1、1 石河子大學(xué)藥學(xué)院石河子大學(xué)藥學(xué)院2 3 45Fluorescence Phosphorescence Measurement6S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換能量l l 2l l 1l l 3 l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換7Fluorescence Phosphorescence MeasurementUV/Vis激發(fā)物質(zhì)粒子電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)電子回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)電子回到基態(tài)，同時(shí)發(fā)射出熒光8菲9ex = 445 nm em = 525 nm 1011激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)熒光物質(zhì)分

2、子的兩個(gè)特征光譜熒光物質(zhì)分子的兩個(gè)特征光譜(excitation spectrum)： F l lex (fluorescence spectrum)： F l lem121. 激發(fā)光譜激發(fā)光譜：將激發(fā)熒光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長(zhǎng)，固定熒光發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定不同波長(zhǎng)激發(fā)光下物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度(F)，作Fl光譜圖稱激發(fā)光譜。 從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長(zhǎng)lex，選用 lex可得到強(qiáng)度最大的熒光。2. 熒光光譜熒光光譜：選擇lex作激發(fā)光源，用另一單色器將物質(zhì)發(fā)射的熒光分光，記錄每一波長(zhǎng)下的 F，作 F- l 光譜圖稱為熒光光譜。 熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長(zhǎng)為 l

3、em。 lex 與 lem一般為定量分析中所選用的最靈敏的波長(zhǎng)。激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜13 n * * 共軛雙鍵共軛雙鍵，K帶強(qiáng)吸收，熒光效率高，帶強(qiáng)吸收，熒光效率高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)。熒光強(qiáng)度強(qiáng)。弱吸收，體系間跨越幾率大，熒光較弱吸收，體系間跨越幾率大，熒光較弱，意義不大。弱，意義不大。14 f發(fā)射的光量子數(shù)吸收的光量子數(shù)15 分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響分子結(jié)構(gòu)對(duì)熒光效率的影響長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)分子的剛性和共平面性分子的剛性和共平面性取代基作用取代基作用16ex 205nm 286nm 356nmem 278nm 321nm 404nm f 0.11 0.29 0.36 （1）長(zhǎng)共軛

4、結(jié)構(gòu)）長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)結(jié)論：結(jié)論：電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度（熒光效率）越大，熒光波電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度（熒光效率）越大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移長(zhǎng)長(zhǎng)移苯環(huán) 萘環(huán) 蒽環(huán)17長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)（芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)）（芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)） 共軛系統(tǒng)共軛系統(tǒng) f l lex、 l lem （1）長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)）長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)18CH2OCOCH3VAl lex=327nm， l lem=510nm 稠芳環(huán)分子的幾何排列對(duì)熒光的影響稠芳環(huán)分子的幾何排列對(duì)熒光的影響 含有長(zhǎng)共軛雙鍵的脂肪烴含有長(zhǎng)共軛雙鍵的脂肪烴 19（2）分子的剛性和共平面性）分子的剛性和共平面性在相同的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性和共平面性越強(qiáng)，熒光效率越

5、大，熒在相同的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性和共平面性越強(qiáng)，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移光波長(zhǎng)長(zhǎng)移20金屬離子絡(luò)合增加分子剛性和共平面性金屬離子絡(luò)合增加分子剛性和共平面性 NOHNOMg1/2 8-羥基喹啉羥基喹啉 8-羥基喹啉鎂羥基喹啉鎂 21位阻效應(yīng)的影響位阻效應(yīng)的影響SO3NaNCH3CH3NNaO3SH3CCH3 1-二甲氨基萘二甲氨基萘-7-磺酸鹽磺酸鹽 1-二甲氨基萘二甲氨基萘-8-磺酸鹽磺酸鹽 f=0.75 f=0.03 22CHCHHCHC立體效應(yīng)的影響立體效應(yīng)的影響Question：為什么剛性和共平面性會(huì)影響熒光效率? cis- trans- 23（3）取代基作用）取代基作用給電子基

6、團(tuán)給電子基團(tuán)NH2、 OH、OCH3、NHR、NR2熒光效率提高、熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移熒光效率提高、熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移COOH、 NO2、 CO、NO、鹵素、鹵素?zé)晒庑蕼p弱甚至熄滅熒光效率減弱甚至熄滅供電子基團(tuán)供電子基團(tuán)吸電子基團(tuán)吸電子基團(tuán)-R、-SO3H、-NH3+對(duì)對(duì) f 無(wú)影響無(wú)影響 24 25 例例 題題關(guān)于熒光效率，下面錯(cuò)誤的敘述是：關(guān)于熒光效率，下面錯(cuò)誤的敘述是：A 具有長(zhǎng)共軛的具有長(zhǎng)共軛的*躍遷的物質(zhì)具有較大的熒光效率躍遷的物質(zhì)具有較大的熒光效率 B 分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大 C 順式異構(gòu)體的熒光效率大于反式異構(gòu)體順式異構(gòu)體的熒光效率大于反

7、式異構(gòu)體D 共軛體系上的取代基不同，對(duì)熒光效率的影響也不同共軛體系上的取代基不同，對(duì)熒光效率的影響也不同26 4、 影響熒光強(qiáng)度的外部因素影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度溫度溶劑溶劑pH熒光熄滅熒光熄滅散射光散射光學(xué)習(xí)目的學(xué)習(xí)目的:提高熒光分析的靈敏度和選擇性提高熒光分析的靈敏度和選擇性271). 溫度溫度熒光素鈉的乙醇溶液在下列哪種條件下熒光強(qiáng)度最強(qiáng)？熒光素鈉的乙醇溶液在下列哪種條件下熒光強(qiáng)度最強(qiáng)？ A 0 B -10 0 C -20 0 D -30 0 1. 一般情況下，隨著溫度的升高，溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度將一般情況下，隨著溫度的升高，溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度將降低。降低

8、。2. 原因原因: 溫度升高時(shí)溫度升高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速度加快分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加分子間碰撞幾率增加， 使無(wú)輻使無(wú)輻射躍遷增加射躍遷增加， 從而降低了熒光效率從而降低了熒光效率282). 溶劑溶劑萘在下列哪種溶劑中的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)？萘在下列哪種溶劑中的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)？A 1氯丙烷氯丙烷 B 1溴丙烷溴丙烷 C 1碘丙烷碘丙烷 D 1，2二氯丙烷二氯丙烷 1. 一般情況下，溶劑極性的增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒一般情況下，溶劑極性的增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。溶劑粘度增加，熒光強(qiáng)度增加。光強(qiáng)度增強(qiáng)。溶劑粘度增加，熒光強(qiáng)度增加。2. 原因原因: 在極性溶劑中，在極性溶劑中， 躍遷的能量差小

9、。躍遷的能量差小。粘度增加，分子間的碰撞減小，無(wú)輻射躍遷減小。粘度增加，分子間的碰撞減小，無(wú)輻射躍遷減小。*29 熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，隨溶劑介電常數(shù)的增大而lem長(zhǎng)移。 如:Normalized fluorescence emission spectra of D-10460 in303). pH的影響的影響 當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響，當(dāng)熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)熒光強(qiáng)度有較大影響，主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡的改變。主要是因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡的改變。苯胺在下列哪種條件下熒光強(qiáng)度最強(qiáng)？苯胺在下列哪種條件下熒光強(qiáng)度最

10、強(qiáng)？ A pH1 B pH3 C pH13 D pH10314). 熒光熄滅熒光熄滅 （fluorescence quenching） 什么叫熒光熄滅什么叫熒光熄滅 什么叫熒光熄滅劑什么叫熒光熄滅劑 常見(jiàn)的熒光熄滅劑有哪些常見(jiàn)的熒光熄滅劑有哪些 避免熒光熄滅的措施避免熒光熄滅的措施 熒光熄滅的應(yīng)用熒光熄滅的應(yīng)用32 熒光熄滅劑熒光熄滅劑 （quenching medium） 熒光熄滅熒光熄滅，又稱熒光猝滅，是指熒光物質(zhì)，又稱熒光猝滅，是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用而引起分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子的相互作用而引起熒光強(qiáng)度降低或熒光強(qiáng)度與濃度偏離線性關(guān)系熒光強(qiáng)度降低或熒光強(qiáng)度與濃度偏

11、離線性關(guān)系的現(xiàn)象。的現(xiàn)象。 引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑熒光熄滅劑。如，鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化如，鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羧基和羰基化合物均為常見(jiàn)的熒光熄滅劑。合物均為常見(jiàn)的熒光熄滅劑。33引起熒光熄滅的原因引起熒光熄滅的原因碰撞碰撞損失能量損失能量作用作用生成不發(fā)光的配位化合物生成不發(fā)光的配位化合物溶解溶解O2熒光物質(zhì)氧化熒光物質(zhì)氧化/ O2順磁性順磁性體系間跨越體系間跨越激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)重態(tài)重原子重原子Br/I體系間跨越體系間跨越三重態(tài)三重態(tài)熒

12、光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度過(guò)大時(shí)，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)熒光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度過(guò)大時(shí)，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。象。(濃度限量濃度限量1g1mg/ml)34避免熒光熄滅的措施：避免熒光熄滅的措施：（1）選擇合適的溶劑）選擇合適的溶劑（2）溶液濃度在合適的范圍）溶液濃度在合適的范圍&熒光熄滅法熒光熄滅法(fluorescence quenching method)：利用熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光熄滅劑的利用熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。濃度呈線性關(guān)系測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。 355). 散射光散射光（Sc

13、attering light）的干擾的干擾散射光散射光選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)消除拉曼光的干擾選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長(zhǎng)消除拉曼光的干擾瑞利光（波長(zhǎng)與入射光相同）瑞利光（波長(zhǎng)與入射光相同）拉曼光（拉曼光（波長(zhǎng)與入射光不同波長(zhǎng)與入射光不同）36硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與拉曼光譜(b)熒光光譜熒光光譜拉曼光譜拉曼光譜瑞利光瑞利光320nm拉曼光拉曼光360nm拉曼光拉曼光400nm熒光熒光448nm激發(fā)激發(fā)320nm激發(fā)激發(fā)350nm瑞利光瑞利光350nm373839 40紫外紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量池測(cè)量池(吸收池吸收池)I0ItI0ItIF,p41 例例 題題在測(cè)量分子熒光強(qiáng)度時(shí)，

14、要在與入射光成直角的方向上進(jìn)行測(cè)量，這是在測(cè)量分子熒光強(qiáng)度時(shí)，要在與入射光成直角的方向上進(jìn)行測(cè)量，這是由于：由于：A 熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的，為了減小透射光的影響熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的，為了減小透射光的影響B(tài) 只有在與入射光成直角的方向上，才有熒光只有在與入射光成直角的方向上，才有熒光C 熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度小熒光強(qiáng)度比透射光強(qiáng)度小 D 熒光的波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)長(zhǎng)熒光的波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)長(zhǎng)4243熒光光譜的制備 44 45F=2.3K I0ECl =KC熒光分析法僅適用于稀溶液的測(cè)定熒光分析法僅適用于稀溶液的測(cè)定滿足定量分析條件：滿足定量分析條件： ECl0.05FC降低熒光自熄滅（內(nèi)部猝滅）作用

15、降低熒光自熄滅（內(nèi)部猝滅）作用靈敏度高（放大信號(hào)）靈敏度高（放大信號(hào)）4600 xxssFFccFF 1. 直接比較法直接比較法 ： 如果熒光物質(zhì)溶液的工作曲線通過(guò)原點(diǎn)，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進(jìn)行測(cè)定： 47 2. 工作曲線法：工作曲線法： 配制一系列濃度梯度的待測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同空白溶液，使其經(jīng)過(guò)相同的處理之后分別測(cè)定熒光強(qiáng)度：Fs、F0、Fx，然后作（ Fs - F0） c 曲線，根據(jù)（FxF0)，從工作曲線上求得待測(cè)物的濃度（或含量）。 4849熒光分析法與紫外熒光分析法與紫外- -可見(jiàn)分光可見(jiàn)分光光度法的主要區(qū)別光度法的主要區(qū)別紫外光紫外光I0I0lgIIAACF(S=10-

16、910-12g/ml)樣品溶液樣品溶液UV-vis(S=10-610-7g/ml)FC熒光分析法熒光分析法平行于入射光平行于入射光垂直于入射光垂直于入射光靈敏度高靈敏度高（吸收）（吸收）（發(fā)射）（發(fā)射）50熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別 紫外紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)光路光路光源光源儀器儀器校正校正吸收池吸收池入射光與吸入射光與吸收光同方向收光同方向入射光與熒入射光與熒光垂直方向光垂直方向兩種光源兩種光源(紫外紫外+可見(jiàn)可見(jiàn))一種光源一種光源(紫外紫外)空白溶液空白溶液(F=0)熒光對(duì)照品溶液熒光對(duì)照品溶液(F=10

17、0%或或50%)空白溶液空白溶液(T=100%)紫外無(wú)吸收紫外無(wú)吸收兩面透光兩面透光低熒光材料低熒光材料四面透光四面透光51 52535455熒光試劑熒光胺熒光胺 l lex=275、390nm， l lem=480nmOOOONRHOHOOCOR-NH2 -NH2熒光胺 吡咯啉酮(pyrrolinone)脂肪族和芳香族伯胺脂肪族和芳香族伯胺56鄰苯二甲醛(OPA)伯胺類、伯胺類、 -氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸）氨基酸（除半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸） l lex=340nm， l lem=455nm (2-巰基乙醇存在，巰基乙醇存在，pH910的緩沖溶液的緩沖溶液) 3. 1-二甲氨

18、基二甲氨基-5-氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl， 丹酰氯丹酰氯)伯胺、仲胺及酚基的生物堿類伯胺、仲胺及酚基的生物堿類 l lex=365nm， l lem=500nm丹酰肼丹酰肼(Dansyl-NHNH2)：可的松等的羰基：可的松等的羰基 熒光試劑57585960 616263DNA自身熒光效率很低，通過(guò)熒光標(biāo)記分子探針(probe)指能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用(與互補(bǔ)核酸序列退火雜交)而用于待測(cè)核酸樣品中特定基因的探測(cè)。 利用分子雜交，在高分辨變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進(jìn)行的一項(xiàng)技術(shù)。 待測(cè)序列DNA片段內(nèi)切成一系列單鏈寡聚核苷酸，成為系列相差一個(gè)堿基的連續(xù)末端； 不同顏色熒光標(biāo)記； 在四種反應(yīng)體系（A、C、G、T）中，寡核苷酸分別終止于不同位置； 四種寡核苷酸產(chǎn)物電泳分離，熒光掃描，在核苷酸梯形圖中讀出DNA序列。64 6566 67 l熒光分析是當(dāng)今最靈敏熒光分析是當(dāng)今最靈敏的分析方法之一。利用的分析方法之一