1、東亞飛蝗對有機磷殺蟲劑的抗性及其機理(j l)研究【摘要】：東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Meyen)是為害嚴重的農(nóng)業(yè)害蟲,有機磷殺蟲劑是防治這一害蟲使用較廣的殺蟲劑,為了深入探討東亞飛蝗對有機磷殺蟲劑的抗性機制,針對東亞飛蝗不同種群制定相應的治理策略,更有效地進行抗性治理,本文通過東亞飛蝗田間種群對有機磷農(nóng)藥的敏感性分析,探討了東亞飛蝗對有機磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀;同時利用現(xiàn)代分子生物學技術,研究分析了抗性產(chǎn)生的生化和分子生物學機理,主要研究內(nèi)容如下:一、東亞飛蝗對有機磷農(nóng)藥的敏感性分析和增效作用測定本研究針對我國東亞飛蝗發(fā)生規(guī)模、分布特點、農(nóng)藥使用背景差異和

2、種群遺傳特征,采集了河北黃驊、海南黃流和山東無棣田間種群,選擇有代表性的有機磷農(nóng)藥進行敏感性分析。結果發(fā)現(xiàn),東亞飛蝗無棣種群對馬拉硫磷最為敏感,黃驊種群對毒死蜱和辛硫磷僅有5.4和2.9倍的抗藥性,而黃驊和黃流兩種群對馬拉硫磷已產(chǎn)生了57.5和14.8倍的抗藥性?？梢钥闯?由于東亞飛蝗不同種群馬拉硫磷選擇壓力的差異已經(jīng)造成(zo chn)不同田間種群對其抗性程度產(chǎn)生了變化,而且不同的有機磷農(nóng)藥對同一種群的選擇壓力已產(chǎn)生不同的抗藥性水平。由此說明,研究東亞飛蝗對常用殺蟲劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀(xinzhung),建立有效的抗性治理策略,是十分必要的。通過增效劑磷酸三苯酯(TPP)、順丁烯二酸二乙酯(DE

3、M)及氧化胡椒基丁醚(PBO)在河北黃驊田間種群和敏感品系中對馬拉硫磷的增效試驗,結果發(fā)現(xiàn),無論在黃驊種群還是敏感品系中,PBO對馬拉硫磷都沒有增效作用(增效比分別為0.9和1.1),但在黃驊種群中TPP和DEM對馬拉硫磷表現(xiàn)出顯著的增效作用(增效比分別為16.2和3.3),而在敏感品系中TPP和DEM沒有明顯的增效作用(增效比分別為1.4和1.2);由此推測,酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶與黃驊種群馬拉硫磷抗性相關,而細胞色素P450與馬拉硫磷抗性無關。二、東亞飛蝗有機磷抗性代謝解毒酶生化機制研究本研究分析了東亞飛蝗代謝解毒酶系(酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和細胞色素P450氧化酶)的生化特性。東亞飛

4、蝗河北黃驊種群和敏感品系代謝解毒酶活性表現(xiàn)出不同程度的差異,其中黃驊種群酯酶對-NA、-NB及-NA三種底物的水解活性和谷胱甘肽S-轉移酶對底物CDNB和DCNB水解活性顯著高于敏感品系,分別是敏感品系的2.1-3.2倍和1.2-2.0倍。而對于細胞色素P450活性,兩者之間沒有顯著差異。酯酶聚丙烯酰胺凝膠電泳結果顯示,黃驊種群和敏感品系電泳圖譜中條帶帶型沒有差異,但黃驊種群條帶染色明顯深于敏感品系。據(jù)此推測,黃驊種群與敏感品系之間的酯酶活性和谷胱甘肽S-轉移酶差異與河北黃驊東亞飛蝗的抗藥性有關。用對氧磷、馬拉氧磷兩種有機磷抑制劑對東亞飛蝗海南黃流和山東無棣種群的羧酸酯酶進行體外抑制,實驗結果

5、表明,黃流和無棣種群的pI_(50)值有顯著差異,黃流種群分別是山東種群的1.16和1.27倍,說明黃流種群對對氧磷和馬拉氧磷的敏感性較低。然而黃流種群和無棣種群的羧酸酯酶活性測定結果表明,以-NA和-NA為底物時,無棣種群羧酸酯酶活性分別是黃流種群1.75和1.50倍,具有顯著差異。動力學研究表明,無棣種群和黃流種群的羧酸酯酶K_和V_(max)值沒有顯著差異。據(jù)分析黃流種群和無棣種群羧酸酯酶活性的差異可能是由于生態(tài)環(huán)境的不同所導致的種群分化引起的。根據(jù)目前的研究結果尚難以斷定對馬拉硫磷生物測定中LD_(50)值較低的無棣種群對其它農(nóng)藥的敏感性如何?；跓o棣種群較高的羧酸酯酶活性,我們推測,

6、東亞飛蝗無棣種群可能對其它的農(nóng)藥具有較高的抗藥性。三、東亞飛蝗有機磷抗性靶標酶生化機制研究本研究分析了東亞飛蝗有機磷靶標乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)的生化特性。對東亞飛蝗黃驊種群、黃流種群、無棣種群和敏感品系AChE活性和動力學比較結果表明,三個東亞飛蝗田間種群AChE活性與敏感品系相比有顯著差異,黃驊種群、黃流種群和無棣種群AChE活性分別是敏感品系的4.04、9.55和1.99倍,并且三個田間種群的K_m值與敏感品系相比也有顯著差異;根據(jù)有機磷殺蟲劑對AChE的體外抑制結果,河北黃驊種群AChE對馬拉氧磷、氧化毒死蜱及辛硫磷的敏感性與敏感品系相比分別下

7、降了3.2、2.2和1.1倍。而海南黃流種群對馬拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性分別下降了11.3和19.2倍。同時發(fā)現(xiàn),對馬拉硫磷生物測定中僅有1.8倍抗藥性的山東無棣種群,其AChE對馬拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性也分別下降了4.8和2.4倍。結合東亞飛蝗解毒酶的生化機制研究,本文認為黃驊種群對馬拉硫磷的抗性機理主要包括酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶活性升高和乙酰膽堿酯酶的活性升高以及敏感性下降。黃流種群產(chǎn)生抗性主要是由于AChE的活性升高和敏感性降低引起的。而無棣種群可能對其它的農(nóng)藥有較高的抗藥性,導致其AChE敏感性的顯著下降。據(jù)此認為,東亞飛蝗不同種群抗性產(chǎn)生機制是不盡相同的,有可能包括多種不同的

8、抗性機制。四、東亞飛蝗有機磷抗性分子機制研究本研究利用簡并性引物和降落PCR技術從東亞飛蝗中克隆獲得了3個東亞飛蝗羧酸酯酶(carboxylesterases,CarEs)基因的cDNA片段,分別命名為CarE1,CarE2和CarE3。根據(jù)昆蟲羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶的保守區(qū)(motif),采用生物信息學方法對東亞飛蝗表達序列標簽(expressingsequencetags,ESTs)數(shù)據(jù)庫進行了全面搜索,并對其進行了羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶ESTs拼接、注釋,獲得了32條羧酸酯酶ESTs和12條谷胱甘肽S-轉移酶ESTs,與克隆獲得的3條羧酸酯酶基因片段同源比對和拼接后,共得到3

9、4條羧酸酯酶基因片段。采用實時定量PCR技術對上述羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶基因在黃驊種群和敏感品系中的表達量進行了比較,結果發(fā)現(xiàn),羧酸酯酶基因CarE1、CarE4、CarE6、CarE12、CarE15、CarE19、CarE22、CarE23、CarE26、CarE27、CarE30和CarE32在黃驊種群中的表達量分別是敏感品系的3.29、1.13、8.78、3.16、3.17、11.84、2.24、4.92、6.24、4.66、4.47和4.73倍;谷胱甘肽S-轉移酶基因GST1、GST2、GST3和GST12的表達量分別是敏感品系的1.25、1.33、2.47和1.61倍。據(jù)此認

10、為這些羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-轉移酶基因表達提高與東亞飛蝗的抗藥性密切相關。對東亞飛蝗AChE基因克隆和Westernblot分析結果認為直翅目昆蟲AChE基因可能有其特殊性,尚有待進一步研究證實。本文通過東亞飛蝗不同種群對有機磷農(nóng)藥的敏感性分析,揭示了東亞飛蝗的田間抗性現(xiàn)狀。通過生化和分子生物學方法分析了東亞飛蝗對有機磷的抗性機理,發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗不同種群在產(chǎn)生抗性過程中的機制是不盡相同的,有可能包括多種不同的抗性機制。這些研究結果對于有效地進行抗性治理,延緩東亞飛蝗的抗性發(fā)展均具有重要的實踐意義。本文首次借助現(xiàn)有的東亞飛蝗的ESTs數(shù)據(jù)庫對抗性相關解毒酶基因進行了系統(tǒng)研究,用real-tim

11、ePCR對代謝解毒酶羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-轉移酶基因在抗性和敏感種群中差異表達進行了定量分析,確定了抗性形成過程中的關鍵代謝解毒酶基因,這將極大地推動東亞飛蝗抗性機制的系統(tǒng)深入研究。綜上所述,本文研究結果對東亞飛蝗抗性機制和東亞飛蝗的抗性治理均具有重要的理論和實踐意義?！娟P鍵詞】：東亞飛蝗有機磷抗性抗性機理代謝酶靶標酶【學位授予單位】：山西大學【學位級別】：博士【學位授予年份】：2008【分類號】：S433.2【目錄】：文中部分名詞中英文對照及縮略語16-18中文摘要18-22ABSTRACT22-27第一章引言27-311本文的研究依據(jù)27-282本文的研究內(nèi)容283本文的目的和意義28

12、-294本研究的特色與創(chuàng)新之處29-31第二章文獻綜述31-73第一節(jié)東亞飛蝗的國內(nèi)外研究概況31-371.1東亞飛蝗概述31-331.1.1東亞飛蝗分布、生活習性和形態(tài)特征31-331.2東亞飛蝗國內(nèi)外研究概況33-371.2.1國外研究概況33-351.2.2國內(nèi)研究概況35-37第二節(jié)昆蟲抗藥性的研究進展37-632.1昆蟲抗藥性的定義372.2昆蟲抗藥性的分類37-382.3昆蟲抗藥性研究的歷史和現(xiàn)狀38-392.4昆蟲抗藥性的形成及演化39-402.5昆蟲抗藥性的研究方法和監(jiān)測技術40-472.5.1生物測定法40-422.5.2生化測定法42-432.5.3電生理檢測法432.5.

13、4抗藥性遺傳的測定43-452.5.5抗藥性分子檢測45-472.6昆蟲抗藥性生理生化機制47-602.6.1昆蟲的行為抗性47-482.6.2昆蟲的生理抗性482.6.3昆蟲的生化抗性48-602.6.3.1昆蟲的代謝抗性48-542.6.3.1.1非專一性酯酶系與抗藥性的關系49-502.6.3.1.2谷胱甘肽S-轉移酶與抗藥性的關系50-522.6.3.1.3細胞色素P450與抗藥性的關系52-542.6.3.2昆蟲的靶標抗性54-602.6.3.2.1乙酰膽堿酯酶靶標與抗性的關系55-572.6.3.2.2擊倒抗性與鈉離子通道57-592.6.3.2.3氨基丁酸受體氯離子通道與昆蟲抗藥

14、性59-602.7抗藥性治理60-632.7.1適度治理60-612.7.2飽和治理612.7.3復合作用治理61-63第三節(jié)我國東亞飛蝗抗藥性的研究現(xiàn)狀63-733.1我國東亞飛蝗的為害63-643.2中國東亞飛蝗發(fā)生區(qū)的生態(tài)類型64-663.2.1蝗區(qū)的概念64-653.2.2東亞飛蝗發(fā)生區(qū)的生態(tài)類型65-663.3我國東亞飛蝗的治理66-693.3.1我國東亞飛蝗治理的發(fā)展進程66-673.3.2我國東亞飛蝗可持續(xù)治理進展67-693.4有機磷殺蟲劑的毒理作用69-703.4.1有機磷殺蟲劑的發(fā)展及其基本特點693.4.2有機磷殺蟲劑對昆蟲毒殺作用的機理69-703.4.3有機磷殺蟲劑馬

15、拉硫磷的基本特點703.5東亞飛蝗有機磷抗藥性研究70-713.6研究展望71-73第三章東亞飛蝗對有機磷農(nóng)藥的敏感性分析和增效作用測定73-811材料與方法74-751.1供試東亞飛蝗的采集及飼養(yǎng)741.2供試藥品74-751.3生物測定的方法751.4馬拉硫磷增效測定的方法752結果與分析75-772.1東亞飛蝗敏感品系和不同田間種群對有機磷農(nóng)藥的敏感性75-762.2東亞飛蝗敏感品系和黃驊種群增效實驗結果76-773討論77-81第四章東亞飛蝗有機磷抗性代謝解毒酶生化機制研究81-971材料與方法82-861.1供試種群821.2供試藥劑82-831.3實驗所用的主要儀器設備83-841

16、.4酯酶的測定84-851.4.1酶液的提取841.4.2酯酶活性計算的標準曲線的測定841.4.3酯酶活力的測定84-851.4.4羧酸酯酶動力學常數(shù)K_m、V_(max)值的測定851.4.5羧酸酯酶的體外抑制851.4.6酯酶非變性聚丙烯酰胺凝膠(Non-denaturingPAGE)電泳分析851.5谷胱甘肽S-轉移酶活性的測定85-861.6細胞色素P450單加氧酶活性的測定861.7蛋白含量的測定861.8數(shù)據(jù)分析862結果與分析86-932.1蛋白濃度測定和酯酶活性計算的標準曲線86-882.2東亞飛蝗敏感品系和黃驊抗性種群解毒酶活性的差異882.3東亞飛蝗黃流和無棣種群羧酸酯酶

17、活性、動力學和體外抑制比較88-933討論93-973.1東亞飛蝗黃驊種群代謝解毒機制93-953.2東亞飛蝗黃流和無棣田間種群代謝解毒機制95-97第五章東亞飛蝗有機磷抗性靶標酶生化機制研究97-1051材料和方法98-1011.1供試種群981.2供試藥劑98-991.3乙酰膽堿酯酶酶液的提取991.4乙酰膽堿酯酶活性的測定991.5乙酰膽堿酯酶動力學常數(shù)K_m、V_(max)值的測定991.6乙酰膽堿酯酶的體外抑制991.7乙酰膽堿酯酶非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳99-1001.8蛋白含量的測定1001.9數(shù)據(jù)分析100-1012結果與分析101-1032.1東亞飛蝗不同種群和敏感品系乙酰膽

18、堿酯酶活性比較1012.2東亞飛蝗不同種群和敏感品系乙酰膽堿酯酶動力學參數(shù)比較101-1022.3東亞飛蝗不同種群和敏感品系乙酰膽堿酯酶對不同抑制劑的敏感性102-1033討論103-105第六章東亞飛蝗有機磷抗性分子機制研究105-1351材料和方法106-1151.1供試種群1061.2供試藥劑和主要儀器106-1071.3東亞飛蝗表達序列標簽(expressingsequencetags,ESTs)數(shù)據(jù)庫的搜索1071.4東亞飛蝗羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的基因克隆107-1111.4.1總RNA提取1071.4.2第一鏈cDNA合成107-1081.4.3PCR擴增反應108-1091.4

19、.3.1PCR引物的設計108-1091.4.3.2PCR擴增1091.4.4東亞飛蝗羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶PCR產(chǎn)物回收與純化1091.4.5質粒載體的連接反應和轉化109-1111.4.5.1連接反應109-1101.4.5.2感受態(tài)細胞的制備1101.4.5.3轉化反應和細菌培養(yǎng)110-1111.4.6質粒DNA測序1111.4.7測序及同源性比較1111.5東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶的Westernblot分析111-1121.5.1樣品的處理1111.5.2SDS電泳1111.5.3蛋白質轉膜1111.5.4抗體雜交111-1121.6羧酸酯酶基因3末端克隆112-1131.6.1總RNA的提取1121.6.2第一鏈cDNA合成1121.6.3羧酸酯酶基因的3-RACE引物1121.6.43cDNA末端快速擴增(3-RACE)112-1131.7東亞飛蝗羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶基因的定量分析113-1151.7.1總RNA的提取1131.7.2引物設計1131.7.3實時熒光定量PCR反應113-1151.7.4東亞飛蝗羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉移酶基因表達量比較1152結果115-1312.1東亞飛蝗羧酸酯酶基因PCR擴增cDNA片段的核苷酸順序及推導的氨基酸順序1152.2東亞飛蝗羧酸酯酶基因3RACE擴增片段的核苷酸順序