1、肝臟蛋白的提取和濃度測定 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室1實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私獠⒄莆盏鞍踪|(zhì)的提取方法 了解掌握考馬斯亮藍(lán)法（Braford法）測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法 2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)?zāi)康母闻K組織蛋白的提取蛋白的濃度測定3 原理： RIPA裂解液是一種傳統(tǒng)的細(xì)胞組織快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 膽氧膽酸鈉（sodium deoxycholate）, 0.1% SDS，得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western。1.肝臟組織的提取4操作步驟超聲勻漿冰上放置 4度離心吸取上清1.肝臟組織的提取組織取材51.肝臟組織的提取 （1）組織取材：取約100mg大鼠肝臟組織，用滅菌的剪刀將組

2、織塊盡量剪碎，放入1.5ml 滅菌的EP管中 61.肝臟組織的提取 （2）超聲勻漿：加0.5mlRIPA裂解液（含50ulPMSF）,置于冰上，用超聲勻漿器進(jìn)行勻漿,超聲每次10秒，重復(fù)3次71.肝臟組織的提取 （3）冰上放置：裂解完全后，冰上放置30分鐘 81.肝臟組織的提取 （4）4度離心：放入離心機(jī)中，4 12000rpm離心5min 91.肝臟組織的提取 （5）吸取上清：取上清分裝于0.2ml離心管中并置于20保存，待用 10超聲勻漿要保持低溫超聲強(qiáng)度以不產(chǎn)生泡沫為準(zhǔn)注意事項(xiàng)112.蛋白的濃度測定考馬斯亮藍(lán)法BCA法紫外吸收法Lowry法(Folin-酚試劑法)雙縮脲法12132.蛋白

3、的濃度測定-考馬斯亮藍(lán)法1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。考馬斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水微區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G-250的最大光吸收峰在465nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰改變?yōu)?95nm。在595nm下，光密度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系，故可以用于蛋白質(zhì)含量的測定。1415實(shí)驗(yàn)步驟管號試劑(ml) 1. 取試管7支，編號，按下表加入試劑:2. 混勻, 室溫放置2 min。在波長 595nm 處以0號管調(diào)零，測定各管吸光度值。1516 以標(biāo)準(zhǔn)液的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。C（蛋白濃度）A（吸光度）Axcx 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線： 0.20.40.6 0.81.0mg/mLOD16實(shí)驗(yàn)